儀器分析在花色苷中的應(yīng)用

1、 觀賞植物的花色多種多樣，花色主要是由花瓣中的色素類型決定，其中花的藍(lán)紫色是由花色苷形成。在許多觀賞性好、經(jīng)濟價值高的花卉中都缺乏藍(lán)色系，如月季、香石竹、菊花等。因此，花色苷是目前花色研究的熱點，內(nèi)容涉及生化、生理和遺傳學(xué)等多個方面?；ㄉ战Y(jié)構(gòu)、性質(zhì)的研究是花色苷研究的重要基礎(chǔ)，本文主要介紹儀器分析方法在這項研究中的應(yīng)用。 色素的化學(xué)分析：類胡蘿卜素、花色素苷、葉綠素、甜菜色素 花色變異機理 色素生物合成途徑（基因、關(guān)鍵酶） 分子育種改良花色 色素組成 助色素：黃酮醇、二氫黃酮等 金屬離子：Al3+、Fe3+、Mg2+等 pH值 細(xì)胞結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境 2.1 花色苷化學(xué)結(jié)構(gòu) 花色苷（anthocy

2、anin）為黃酮類化合物，是由花色素和各種糖形成的配糖體。 花色素（anthocyanidin）是具有類黃酮典型結(jié)構(gòu)的2-苯基苯并吡喃陽離子的衍生物，以 C6C3C6 為基本骨架，目前已知有20種花色素。 形成配糖體的主要的糖有：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、蕓香二糖、龍膽二糖、槐二糖等。 花色素在3、5、7等位置與糖結(jié)合后形成糖苷，因此花色苷也相應(yīng)地被分為單糖苷、二糖苷或三糖苷. 2.2 影響花色苷顏色穩(wěn)定性的主要因素 花色苷的?；饔茫夯ㄉ盏孽；饔茫?有機酸如-香豆酸、咖啡酸和琥珀酸等通常與花色苷的3、5、7或3位上的糖結(jié)合,形成單酰、二?；蚨圊；ㄉ剀铡ｕ；ㄉ諈⑴c分子內(nèi)輔助著色或分子間

3、輔助著色反應(yīng)，是花色苷在較寬的pH值范圍內(nèi)顏色穩(wěn)定表現(xiàn)。 pH值的作用：值的作用： 在溶液介質(zhì)中,花色苷會隨pH有幾種結(jié)構(gòu)的變換。對于一個給定的pH值,在花色苷的4種結(jié)構(gòu)之間存在著平衡:藍(lán)色的醌式(脫水)堿、紅色的花钅羊正離子、無色的甲醇假堿和查爾酮。 金屬離子：金屬離子： ?；ㄉ嘏c輔助色素、金屬發(fā)生反應(yīng),形成復(fù)合花色素苷。 研究的主要對象：羥基的位置和數(shù)量、糖的類型及位置、酰基化作用、取代基等 研究的主要方法：光譜法紫外可見光譜、紅外吸收光譜，色譜法，核磁共振波譜法，質(zhì)譜法 3.1.1 紫外可見光譜法紫外可見光譜法 紫外-可見光譜很早就被人們應(yīng)用于花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定。該法主要有如下幾點：

4、花色苷最大吸收波長一個在可見光區(qū)的500540nm附近，另一個在紫外275nm附近，通過測定色素的最大吸收波長即可判斷是否為 花色苷類色素。 如果向花色苷的0.01%鹽酸甲醇溶液中滴加35滴ll3甲醇或乙醇溶液,出現(xiàn)藍(lán)移，即最大吸收波長增加，說明-環(huán)有鄰位酚羥基，即可區(qū)分-環(huán)無鄰位酚羥基的天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素和-環(huán)有鄰位酚羥基的矢車菊色素、牽?；ㄉ亍w燕草色素。根據(jù)花色苷最大吸收波長處的吸光度和440nm處的吸光度的比值440/max，參考文獻(xiàn)后，可以判斷糖苷的位置。根據(jù)花色苷在300330nm間有無吸收峰可判斷該色素分子是否有?；绻形辗?，表明該色素有?；嬖?。根據(jù)花色苷在

5、440nm處是否有肩峰，可以判斷該色素5號位的羥基是否被取代。如果5號位的羥基沒有被取代，則該色素在440nm處有肩峰。根據(jù)花色苷在紫外光下是否有熒光，可判斷該色素是否在5號位有取代基，如果有熒光則表明該色素在5號位有取代基。 3.1.2 紅外吸收光譜紅外吸收光譜 目前,紅外吸收光譜應(yīng)用于花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定不太廣泛?；ㄉ盏募t外光譜主要有苯環(huán)、含氧雜環(huán)、糖和羥基和甲氧基四部分。 其中雜環(huán)的CO鍵的吸收峰在1630-1620cm-1，苯環(huán)和雜環(huán)的C一C鍵有三個吸收峰：1605-1580cm-1， ：1577-1565cm-1，：1518-1485cm-1 。苯環(huán)C-H鍵的吸收峰在900-800cm

6、-1，4-H:905885cm-1，6-H:839-848cm-1，8-H:809一830cm-1。B環(huán)C-H鍵的吸收峰位置受取代基影響，不同的苷原也不相同。甲氧基和經(jīng)基的吸收峰在1120-1010cm-1?；ㄉ盏囊姨a(chǎn)物的C=O鍵引起的峰在16541695cm-1。 利用色譜法進行花色苷的結(jié)構(gòu)鑒定需要對花色苷進行酸水解、堿降解和過氧化物降解等處理，使花色苷中的糖苷配基、糖和有機酸游離出來，再通過標(biāo)準(zhǔn)的糖苷配基、糖和有機酸作對照或參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù),進行色譜分析。 各樣品的分析方法主要有：微晶纖維素薄層層析法(CellucoseTLC)，紙層析，HPLC，分析糖類時還有采用衍生化氣相色譜法的報道

7、，RP-HPLC應(yīng)用于花色苷結(jié)構(gòu)鑒定也逐漸多了起來。 核磁共振技術(shù)是有機結(jié)構(gòu)鑒定的重要手段之一。在分子生物學(xué)，藥物化學(xué)，植物化學(xué)等諸多方面有廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用于花色苷的分析從二十世紀(jì)七十年代末已經(jīng)開始了。常用的有，1H一NMR和13C一NMR譜法。 花色苷在不同pH值條件下，會發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，在酸性環(huán)境中呈钅羊鹽離子態(tài)時較容易測定，所以常用以下溶劑：CD3-TFA-d(氘代甲醇-三氟醋酸)，DMsO-d6-TFA(六氘代二甲亞砜-三氟醋酸)，D2O-DCI(重水-氘代氯化氫)，CD3OD-DCl。 各質(zhì)子的信號范圍：苷原9-6ppm，糖中半縮醛的質(zhì)子6-4.5ppm，HC=HH7-6ppm，大多

8、數(shù)糖的質(zhì)子在4-3ppm。 質(zhì)譜是二十世紀(jì)初發(fā)展起來的物理分析方法。在一定條件下能對復(fù)雜的有機物給出確定的，可以重復(fù)的質(zhì)譜圖，由分子的斷裂規(guī)律得到許多的結(jié)構(gòu)信息。FAB(Fast AtomBombardment)是八十年代發(fā)展出的新離子源，多采用惰性氣體，如氫，氘等中性原子流轟擊樣品使之離子化。FAB一MS具有較高的靈敏度，適用于分析極性大分子量較大的化合物。在花色苷的研究中主要用于花色苷的分子量的確定。 4.1 含有很少或者不含有干擾物質(zhì)的體系中花色含有很少或者不含有干擾物質(zhì)的體系中花色苷總量的測定：苷總量的測定： 花色苷的最大吸收區(qū)在500550nm范圍內(nèi)，而離這一范圍最近的類黃酮的最大吸

9、收范圍在350380nm。在新鮮的植物提取物中，因為很少含有在花色苷的最大吸收區(qū)發(fā)生吸收的干擾物質(zhì)，花色苷總量可以利用比耳定量通過適當(dāng)波長處的吸光度來測定。 該方法測定花色苷總量需要在一個恒定的pH介質(zhì)中進行。除了需要在定性的基礎(chǔ)上確定花色苷的種類，還需要測定單個花色苷的最大吸收波長下的摩爾消光系數(shù)或比消光度。又因為單個花色苷的差別很小，而且單個花色苷組成的比率未知，所以一般用平均比消光度avE來測定花色苷總量，誤差小于0.2%。但是，單個花色苷的比消光度E是很難得到的，所以我們可以參考文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù)。 4.2 含有干擾物質(zhì)的體系中花色苷總量的測定：含有干擾物質(zhì)的體系中花色苷總量的測定： 4.

10、2.1 pH示差法：示差法：該法依據(jù)之一是花色苷發(fā)色團的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，依據(jù)之二是超干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH而變化。通過實驗，確定兩個對花色苷吸光度差別最大但是對花色苷穩(wěn)定的pH值，根據(jù)Fuleki的公式可以計算出花色苷總量。 4.2.2 差減法：差減法：差減法就是先測定樣品在可見光區(qū)最大吸光度，經(jīng)二氧化硫或亞硫酸鹽漂白或過氧化氫氧化后，再測定一次吸光度,二者的差值就是花色苷的吸光度。參考用標(biāo)準(zhǔn)花色苷繪制的工作曲線，將吸光度換算成濃度。但是，差減法因所使用的漂白劑也能降低某些干擾組分的吸光度而使總花色苷濃度偏高。 4.3 單個花色苷的定量：單個花色苷的定量： HPLC是廣泛使用

11、的方法。 細(xì)胞pH值的測定 花瓣顏色的判定 主要方法：熒光探針法、電化學(xué)法、核磁共振波譜法 原理：熒光探針強度隨pHi升高呈線形變化 主要的熒光探針：SNAFL、BCECF、NERF等 方法：熒光比值法 優(yōu)點：操作方便、對于細(xì)胞損傷小 應(yīng)用：Asen等人于1975年應(yīng)用這一方法對二百余種植物的花進行了細(xì)胞pH值的測定 乳白玻璃投射法（Satio，1967） 積分球法(Yasuda，1967) 顯微分光光度計法（Asen，1971） 八仙花花瓣的反射光譜的測量八仙花花瓣的反射光譜的測量 新鮮的花瓣切成1010mm2，固于一個蓋玻片上，然后放在一個BaO白板上。將此板放在JASCO Ubest55

12、分光光度計的一個積分球裝置上，記錄400800nm的反射光譜。 八仙花細(xì)胞原生質(zhì)體可見光譜的測量八仙花細(xì)胞原生質(zhì)體可見光譜的測量 將200l原生質(zhì)體懸浮液倒在聚賴氨酸預(yù)包裹的蓋玻片上（1818mm2），在室溫下放置1min，去除懸浮緩沖液后，將蓋玻片放于一個塑料盤中（35mm）并加入2ml儲存緩沖液（根據(jù)實驗需求，KCl的濃度在0.1mM和10mM之間變化）。然后將其放在裝有顯微分光光度計（MCPD7000；Photal）的顯微鏡（IX70；Olympus）下觀察，在直徑10m的光學(xué)光束條件下，測量有色原生質(zhì)體在可見光區(qū)（400800nm）的吸收光譜。 (K. Youshida,2003)植物

13、材料色素實驗方法研究者發(fā)表時間秋海棠花青素NMR（分析?；?、HPLC（分離）Nodive Chirol，1992鴨趾草復(fù)合花色素鴨跖草苷UV-Vis 、NMR、HPLCT. Kondo，1992藍(lán)靛果花色苷紅外吸收光譜李景琳、吳信子，1993土丁桂3-葡萄糖基咖啡酰葡萄糖基咖啡酰葡萄糖-5-琥珀酰葡萄糖苷1H-NMR、 UV-VisToki K.，et al.，1994黃刺玫花青素UV-Vis （鑒定穩(wěn)定性）王常青，1996Ceanothus papillosus助色素UV-Vis 、NMRStephen J.，1997馬氏龍膽二酰花色素苷H-NMR、FAB-MS、UV-VisYoshid

14、a K，et al.，2000 儀器分析技術(shù)在花色苷研究中具有很重要的作用。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，目前的趨勢是多項技術(shù)的結(jié)合以提高實驗的精度。從而更準(zhǔn)確的解釋花色形成的化學(xué)機理，為花色分子育種提供理論依據(jù)。安田齊.(1989)花色的生理生化.中國林業(yè)出版社，北京李景琳,李淑芬,潘世權(quán). （1993）高粱紅色素的主要成分及結(jié)構(gòu)分析.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),5:47-49王常青.（1996）黃刺玫色素的提取及其性質(zhì)的探討. 食品與發(fā)酵工業(yè)，6:36-38譚仁祥.(2002)植物成分分析.北京-科學(xué)出版社:486-501楊少勇，安銀嶺等.(2003)藍(lán)色花植物花色素的著色機理.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，25（5）:

15、68-75姜平平，呂曉玲，朱惠麗.（2003）花色苷類物質(zhì)分離鑒定方法.中國食品添加劑，(4):108-111徐清燏，戴思蘭.（2004）藍(lán)色花卉分子育種.分子植物育種，2（1）：93-99盧鈺，董現(xiàn)義等.(2004)花色苷研究進展.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，35(2):315-320T. Kondo. et al. (1992) Structural basis of blue-colour development in flower petals from Commelina communis. Nature，358:515-518 Toki K.，et al. （1994） An acylated delphinidin glycoside in the blue flowers of evolvulus pilosus. Phytochemistry，36:609-612Yoshida K.，Toyama Y.，et al. （2000） Contribution of each caffeoyl residue of the pigmen