DET電子傳遞原理研究

1、葡萄糖氧化酶在碳納米管修飾電極上的直接電子轉移及其構象變化摘要為深入理解多壁碳納米管（MWCNTs）的直接電子轉移（DET）機制，我們研究了蛋白質與MWCNTs相互作用后發(fā)生的構象變化。本文以葡萄糖氧化酶（GOD）為例，采用循環(huán)伏安法論證碳紙電極經MWCNT修飾后GOD之間明顯的直接電子轉移現象。傅里葉紅外光譜的結果顯示出MWCNTs吸附的GOD沒有變性，但是發(fā)生了結構變化，伊折疊的紅外光譜波數發(fā)生了輕微的移位，數量有所增加，而“-螺旋有所減少，GOD中”-螺旋結構的含量從21.2%下降到了19.6%,Far-UVCD測試也得到了類似的結果，“-螺旋的含量從27.1%下降到了25.9%。密實的

2、生螺旋結構的減少就在一定程度上導致較為松散的外層結構，及活性中心的暴露，因而降低電子傳遞阻力，進而促進了電極界面電子轉移。1前言碳納米管（CNTS）自1991年被發(fā)現以來，其納米結構，獨特的屬性及其在電子、光學、熱、機械中的應用一直是科學家們研究的熱點1。近幾年，CNTs已逐漸應用于生物燃料電池，生物傳感器，藥物釋放系統，及生物醫(yī)學裝置2,3。目前已采用多種方法4功能化CNTs或使其成為聚合物基體的一部分，應用于藥物載體或生物電極。在生物傳感器和生物燃料電池這樣的生物電化學系統中，生物大分子和電極表面的界面反應至關重要，并且這通常是決定系統整體性能的關鍵性因素。因此，提高電極表面和氧化還原活性

3、物質之間的電子轉移速率就顯得尤為重要，此外，生物與電極界面間電子傳遞機制的研究也是必不可少的。近年來的研究中發(fā)現，有的微生物或酶可以與電極接觸而進行直接電子轉移（DET）,而這一機制的研究亦逐漸得到重視，一般來講，直接電子轉移意味著不需要外加任何外源電子介體，目標分析物與電極之間就能進行良好的電子傳遞5,6?？紤]到用作外源電子介體的物質通常較為昂貴，且長期使用還會有生物毒性，所以，直接電子轉移的實現還具有現實的經濟意義。通常來講，一些活性物質如細胞色素C等，容易在電極表面發(fā)生強吸附而導致變性，故要實現直接電子轉移的一個必要條件就是要有一個兼具穩(wěn)定性與生物相容性的電極表面，它不僅要使蛋白質或活性

4、大分子維持必要的結構和活性，還能同時與之實現電子的快速傳遞。為了實現這一目的，很多研究采用碳納米管修飾電極或直接用碳納米管制作基底電極，并成功與多種蛋白質實現了直接電子轉移7。Cai等發(fā)現碳納米管可以實現血色素和葡萄糖氧化酶與電極間的直接電子轉移8,9。同時，對于其他活性物質如過氧化氫酶和膽紅素的研究也得到了類似的結果10-12,這些研究中碳納米管或是被共價連接到或是直接吸附到基底電極上來完成修飾13-15。盡管有大量的研究表明碳納米管可以促進電子轉移，但對其怎樣促進蛋白質進行電子的機制卻很少有更進一步的研究。一般來說，文獻多將這種促進電子轉移的現象歸因于碳納米管的管狀納米尺寸效應及其宏觀展示

5、的獨特的物理電化學特性。除了直接將碳納米管共價連接作為分子導線使用外16,研究還普遍認為碳納米管的管狀纖維結構能夠插入到距離酶活性中心較近的地方產生隧道效應，從而加速電子傳遞17,此外，因為氧化還原活性中心通常是深埋在蛋白質內，為實現直接電子轉移，目標分析物還必須進行有效的構想變化18。在生物分子的電化學行為分析中其構象的轉變有著本質的影響，構象的變化直接決定著蛋白質分子的生物功能。然而，這種構象的轉變卻隨著蛋白質分子及其所處具體微環(huán)境的不同而各異19,并沒有統一的規(guī)律可循。對于負載于碳納米管修飾電極上的蛋白質，尤其是對于未與碳納米管共價相連的蛋白質而言，它們極有可能因吸附在碳管上而導致構想發(fā)

6、生變化，從而影響其電子在界面上的傳遞機制，這也可以解釋碳納米管對于界面電子轉移的促進作用。然而相關的研究卻寥寥無幾。大多數的研究都將碳納米管實現電生物活性蛋白質與電極表面的直接電子轉移歸結于碳管對于其活性中心的接近14,17,18,20-22,或是認為酶的外殼構想發(fā)生部分轉化和展開使之有利于電子的快速傳遞。但是，并沒有直接的實驗結果支持這一結論23,24。本文論證了GOD與MWCNTs間的DET。我們采用傅里葉紅外光譜（FTIR）及圓二色光譜（CD）研究了MWCNTs吸附GOD,及MWCNTs引起的GOD活性中心構象變化。根據GOD分子結構信息判斷GOD吸附在MWCNTs后發(fā)生了怎樣的構象變化

7、。我們的結果闡明了DET機制，并拓展了CNTs的應用空間。2方法2.1 化學試劑葡萄糖氧化酶（GOD,EC1.1.3.4,G71410,300U/mg,Sigma）;Nafion溶液（5%,北京飛馳綠能有限公司）；多壁碳納米管（MWCNTs,純度95%,直徑10-20nm）來自深圳納米技術港有限公司，使用前，要進行純化及功能化，將其加入濃硫酸與濃硝酸的混合液（體積比=3:1）中，超聲4h,用適量的氫氧化鈉溶液中和，然后用微孔濾膜抽濾（0.22濾膜），并用超純水洗滌至濾液呈中性，60C烘干過夜。其他所有化學試劑均為分析純，實驗用水均為超純水（電阻率18MDcm,Millipore-MilliQ系

8、統）。磷酸緩沖液（PBS,20mM,pH6.9,用Na2HPO4（55%）和NaH2P。4（45%）配制）作為電化學測試的支持電解液。2.2GOD/MWCNTs復合體制備將1mg酸化后的MWCNTs和10mgGOD在1mlPBS（pH6.9）中混合，置于4c下12小時，使GOD吸附到MWCNTs上。然后，將混合液徹底離心，去除上清液后回收混合物（以GOD/MWCNT）表示。用超純水沖洗混合物，以去除未充分吸附的GOD分子，冷凍保存。每一步所得均采用FTIR和CD表征。2.3 GOD/MWCNTs修飾碳紙電極的制備將GOD分別負載到Toray裸碳紙（后文成為TP）和MWCNTs修飾的TP電極上，

9、其方法如下：首先，將碳紙切成長方形（0.501.0cm2）并用環(huán)氧樹脂將其連接到銅導線上。每個電極的幾何表面積為0.25cm2。將MWCNTs用超聲（1小時）均勻分散在超純水中，濃度為1mg/ml,采用噴涂的方法將50的MWCNTs隨機負載碳紙電極的兩個面上，然后在紅外燈下干燥10分鐘。將2mgGOD溶解在20mM的0.05ml的PBS中。取20dl的該溶液分別滴涂到TP和MWCNTs修飾的TP電極上，并在室溫下干燥4小時。最后，將5的Nafion溶液涂覆到經GOD吸附的電極表面，在室溫下儲存。2.4 特性及電化學分析采用AXIS-紫外電子能譜儀（KratosAnalytical）來進行X射線

10、光電子能譜（XPS）分析，以判斷GOD是否成功負載到了電極上。實驗采用AlKa單色射線光源（225W,15Ma,15KV）,并且為了對表面電荷效應進行補償，用284.80eV處C1s碳氫峰進行結合能基準。循環(huán)伏安法（CV）測試在電化學工作站（Par283,USA）上進行，采用傳統三電極系統，50ml電解池。以葡萄糖氧化酶負載電極為工作電極，鉗電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極。在每次掃描前，向池中通入15分鐘氮氣以去溶解氧。用0.02M的磷酸緩沖液（pH6.0）（含0.1MNaCl）作為支持電解質來調節(jié)離子強度。所有測試均在室溫下進行。采用Nicolet10MX傅里葉紅外光譜（FTIR

11、）分析儀（ThermoScientific,USA）對酸化碳納米管和吸附于碳管的GOD進行表征分析。對于每個樣品，去掃描128次（分辨率為4cm-1）的平均值來繪圖譜。為進一步研究GOD與碳納米管作用后的二級結構的變化，采用高斯Gauss函數曲線擬合的方法在Origin6.0軟件上對紅外圖譜進行去卷積分峰并定量計算，確定各子峰與蛋白質分子不同二級結構的對應關系，根據它們的積分面積計算各種二級結構的相對百分含量。采用JASCOJ-715分光偏振計（日本）進行圓二色光譜（CD）的測定分析。實驗中蛋白質濃度為0.3mg/ml,在遠紫外區(qū)190至U260nm范圍內，以0.5s的響應時間和20nm/mi

12、n的掃描速率進行測試。采集數據后對每三次掃描的結果進行平均來繪圖，所有結果均以摩爾橢圓率0Qegcm2mol-1）的形式表示。根據Yang-Chen公式用Windows二級結構預測的J-715軟件包（Version1.10）來計算各種蛋白質二級結構所占比率25。3結果與討論3.1 XPS分析X射線光電子能譜是一種在對于電極表面元素和化學組成進行檢測的有力工具，同時也是對固定或吸附蛋白質進行量化的高效手段26。本實驗采用這種檢測技術來證明葡萄糖氧化酶對于碳納米管管修飾的碳紙電極的成功吸附。在表1中，詳細列出了TP,TP/MWCNTs和TP/MWCNTs/GOD的元素組成。由表可知，作為基底電極的

13、碳紙，主要由碳（占98.58%）和一些其他合成時引入的微量雜質組成。在經過碳納米管修飾后，氧的含量有了明顯增加，這是由在碳納米管的酸化過程中引入的竣基所致。在進行葡萄糖氧化酶的負載后，可以觀察到N和O元素的含量都有了明顯增加，這應歸結于GOD蛋白質骨架中的氨基和竣基基團，并表明了GOD的成功負載。此外，作為GOD氧化還原中心的黃素腺喋吟二核甘酸（FAD）輔基由一個核黃素基團連接到二磷酸腺甘（ADP）的磷酸基團上組成。因此，元素分析中的Na和P的出現亦為GOD成功負載的證明，這一結果還可由后續(xù)的FTIR光譜進行映證。表1.TP,TP/MWCNTs和TP/MWCNTs/GOD電極上元素組成表Ele

14、ctrodesF1s(%)O1s(%)N1s(%)C1s(%)Si2p(%)Na1s(%)P2p(%)TPNA1.160.1398.580.13NANATP/MWCNT1.097.964.5386.230.19NANATP/MWCNT/GOD213.26.675.20.341.750.923.2 GOD在TP/MWCNTs電極上的直接電化學分析采用CV來研究負載在CNTs修飾電極上的GOD的電化學行為。實驗以PBS為電解質，測試GOD是否能與MWCNT修飾的碳紙電極進行直接電子轉移。如圖1A所示，對于MWCNT修飾的碳紙電極可以觀察到一對成型良好的氧化還原峰，而裸碳紙電極上卻并未觀察到任何明顯

15、的峰。GOD的催化作用依賴于其輔基FAD,FAD以兩種形態(tài)出現，FAD和FADH2當發(fā)生氧化還原反應時，FAD與FADH2之間相互變換，交替作為電子受體和供體來催化反應進行。因此，圖中出現的氧化還原峰應為負載在CNTs修飾電極上的GOD活性中心FAD/FADH2電對氧化還原反應所致。這表明修飾在碳紙電極上MWCNT層實現了電極與GOD之間直接電子轉移，而沒有CNTs修飾的碳紙電極上沒有氧化還原反應發(fā)生。此外，氧化還原峰的表觀電位為400mV（參比電極為Ag/AgCl）,這個電位值非常接近于FAD/FADH2的氧化還原電位。圖1B為不同掃描速度下的循環(huán)伏安圖，由圖可知，在20至ij100mVs-

16、1的掃速范圍，陰陽極峰電流隨著掃速成線性增加（陰陽極峰電流與掃速線性擬合的相關系數均為0.999,見圖中插圖部分），這表明氧化還原反應受表面負載物質的控制（此處為GOD的輔基FAD）。另外，峰間距從掃速為20mVs-1的42mV到掃速為60mVs-1的60mV而后隨著掃速增加到100mVs-1而增大到84mV,這表明吸附的GOD在MWCNTs上發(fā)生準可逆的電子傳遞反應。采用Laviron理論27計算出的異相電子轉移速率常數（Ks）為1.44s-1。這個值與其他基于CNTs修飾的電極報道的值相近9,17,20。圖1.（A）TP/GOD（實線）和TP/MWCNT/GOD（虛線）電極在掃速為100m

17、Vs-1下；（B）TP/MWCNT/GOD電極在不同掃速下：20mVs-1（實線）,40mVs-1（虛線）,80mVs-1（點線）和100mVs-1（點劃線）的循環(huán)伏安圖。支持電解質為20mM磷酸緩沖液（pH6.0,0.1MNaCl）。CV分析證實了GOD可以與WMCNTs修飾電極進行DET,這一結論與其他CNTs修飾電極所得的Z果相吻合16-18,20,28o因為FAD/FADH2氧化還原活性中心深埋在酶內部26,這成了實現直接電子轉移的內部阻礙。一般認為通過CNTs可以連接或接近酶活性中心，縮短電子隧道距離從而加快電子傳遞速率17,20o也有研究指出CNTs與酶的相互作用可能誘導其構象向有

18、利于電子轉移的方向產生了變化18。理論上，GOD吸附到CNTs表面后，碳管的納米尺寸效應將會導致GOD的部分解旋，從而降低電子從活性中心傳導到蛋白質外殼的電子。在此過程中，酶的構象必然會發(fā)生變化。3.3 FTIR分析實驗采用FTIR對吸附在CNTs上白GOD的構象變化進行的研究，如圖2所示。圖中1720cm-1和1570cm-1處的紅外吸收峰對應著酸化后CNTs上竣基和竣酸基團的振動，而在1210cm-1處的吸收峰則對應著C-O振動，充分證明了CNTs的成功氧化。純GOD的紅外光譜上可以在1654cm-1和1550cm-1處觀察到兩個明顯的特征峰，它們分別對應于酰胺I帶和酰胺II的吸收峰譜29

19、,這通常為蛋白質分子特有的特征峰。酰胺I的吸收峰是由蛋白質骨架上肽鏈上C=O基團的拉伸所致，而酰胺II的吸收峰帶是由N-H平面彎曲和肽鏈上C-N拉伸振動共同作用的結果。這兩個特征峰帶在GOD/MWCNT的圖譜上也看見，亦證明了GOD成功吸附到了CNTs上。此外，還可以觀察到這兩個特征峰的位置并沒有太大改變，只有輕微的惟一，酰胺I帶從1654移到1647cm-1，而酰胺II帶從1550cm-1處移到了1543cm-1處，這說明在吸附過程中酶并沒有失活變性。圖2.MWCNTs,GOD和GOD/MWCNTs的傅里葉紅外圖FTIR光譜圖中的酰胺I帶峰可以用來進一步觀測分析蛋白質構象30。酰胺I帶是一系

20、列單個二級結構峰譜的疊加而成的，對于任何二級結構的改變非常靈敏31。所以，我們選擇純GOD和吸附后GOD的酰胺I帶（范圍為1600-1700cm-1）來進行進一步分峰擬合分析。如3所示，酰胺I帶去卷積后分成了幾個明顯獨立的Gaussian峰。圖3（A）為純GOD的酰胺I帶分峰結果，初步判定1616,1630和1684cm-1處峰可歸于反平行3折疊結構29,32-34。3折疊結構約占到了整個二級結構的37.9%。在1655cm-1處的峰為“螺旋結構的特征峰，其面積占到了整個酰胺I帶二級結構的21.2%。而無規(guī)則卷曲結構（約20.6%）和轉角結構（20.5%）則分別對應于1643和1670cm-1

21、處的峰。在GOD與碳納米管作用后，3折疊結構的峰位置發(fā)生了一定偏移（從1617到1619cm-1,1630到1623cm-1處），這表明氫鍵的強度有所改變。對于不同二級結構所占的比例，其計算結果與圓二色的結果一切顯示在表2中，并在后文對不同部分吸附前后發(fā)生的改變進行了討論。由于FTIR是基于氨基酸殘基的紅外吸收，針對固體蛋白質的構象進行的初步分析。因此，CD是研究蛋白質構象變化方面較為高級的技術，故實驗中采用CD分析的方法對液態(tài)GOD與CNTs吸附后的構象變化進行了全面分析，并與FTIR結果進行了比對。I*ao1訕-1(11640I7MAD.5SSIS1庭口1&K-1660I硼anafiumb

22、ufJan10000210220之部24D250現0濁日廿elaigm/nmJUD59P，-1三GOD(A)和GOD/MWCNTs(B)酰胺I帶的分峰圖3.4 CD分析GOD與CNTs吸附前后的圓二色光譜顯示如圖4所示，其測試區(qū)域190nm到260nm為主要的肽鏈骨架區(qū)域。整體來說a螺旋的手性非常明顯，在208和221nm處出現兩個典型的a螺旋特征負峰35。值得注意的是，GOD吸附碳納米管前后的CD光譜差別不大，大部分是重疊的，負峰的位置也沒有發(fā)生明顯偏移；因此，可以說吸附到MWCNTs上后GOD還保留著其原來生螺旋大部分結構。兩圖譜如此高的相似度也表明了GOD吸附后并未變性。圖4.GOD()

23、和GOD/MWCNTs()在遠紫外區(qū)的圓二色光譜圖CD圖是由特定蛋白質中氫鍵模式和各種二級結構比例決定的。對于GOD可以發(fā)現四種典型的二級結構：生螺旋，b折疊，轉角和無規(guī)則卷曲，其中“-螺旋和伊折疊結構為最常規(guī)的二級結構，其峰常分別出現在190nm和200nm處。由于“-螺旋較其他結構密實，故通常認為它有足夠的控制力能避免內部構象的隨意變化并起著防御對于蛋白質外殼構象擾動的作用29。利用遠紫外區(qū)域CD來估算蛋白質二級結構的算法有很多，實驗中采用Yang-Chen方程式25進行估算，其所得的計算和比較結構列于表2中。FTIR的結果顯示出在與CNTs發(fā)生吸附后，GOD中“-螺旋結構的含量從21.2%下降到了19.6%。Far-UVCD測試也得到了類色的結果，“-螺旋的含量從27.1%下降到了25.9%o另外還可以觀察到，隨著“-螺旋結構含量的下降，伊折疊的含量在FTIR和CD測試中都有所增加。總的來說，吸附到CNTs上的GOD保持了90%以上的原始結構，這對其后續(xù)催化功能的正常使用非常重要。表2.FTIR和CD光譜中計算出的蛋白質二級結構含量比較Instrumental&SheetSecondarystructure(%)TurntechniqueSampleRandomCoila-HelixFTIRGOD37.920.621.220.5GOD/MWCNTs39.