生物化學實驗教學大綱

1、生物化學實驗教學大綱20071、課程屬性：必修2、實驗屬性：非獨立設課3、學時學分：實驗學時224、實驗應開學期：秋季5、先修課程：有機化學、分析化學、普通化學一、課程的性質(zhì)與任務生物化學實驗課是在學習生物化學理論課的基礎上進行的一個實踐性環(huán)節(jié)，本課程的教學任務是讓學生運用已學過的知識驗證一些結(jié)論、結(jié)果和現(xiàn)象，及綜合運用已學過的理論知識設計實驗或進行綜合性的實驗，鞏固和加深對生物化學課程中基本理論知識的理解，訓練學生理論知識的運用能力、實驗操作技能、實驗數(shù)據(jù)的處理和分析能力。二、實驗目的與基本要求本實驗課配合理論教學，通過實驗從實踐中進一步學習，掌握和運用學過的基本理論；運用生物化學理論分析實

2、驗過程中的各種現(xiàn)象和問題，培養(yǎng)、訓練學生的分析和解決問題的能力。學生必須完成的基本要求：準備實驗，預習實驗；寫出預習報告，擬定記錄表格；測取實驗數(shù)據(jù)；整理實驗數(shù)據(jù)；寫出實驗報告。三、實驗考核方式及辦法 考核方式：考查；實驗成績占總成績的30%，實驗成績評分辦法：實驗操作占40%，實驗態(tài)度占20%，實驗報告占40%。四、實驗項目一覽表生物化學實驗項目一覽表序號實驗項目名稱實驗類型實驗要求適用專業(yè)學時1234567血清球蛋白的分離-分子篩凝膠層析法醋酸纖維薄膜電泳法分離動物血清蛋白質(zhì)血清乳酸脫氫酶同工酶的分離與測定動物肝臟DNA的提取紫外吸收法測定核酸含量應用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用維生素C含量

3、的測定驗證性驗證性綜合性驗證性綜合性綜合性綜合性必做必做必做必做必做必做必做農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類4333333五、實驗項目的具體內(nèi)容實驗一 血清球蛋白的分離-分子篩凝膠層析法1、本次實驗的目的和要求學習和掌握分子凝膠層析法的原理和技術（溶脹，裝柱，加樣和洗脫），了解葡聚糖凝膠的選用原則2、實驗內(nèi)容或原理分子篩指的是一些多孔介質(zhì)。當含有不同大小分子的混合物流經(jīng)這一介質(zhì)時，小分子的物質(zhì)能進入介質(zhì)的孔隙，而大分子的物質(zhì)則被排阻在介質(zhì)之外，從而達到分離的目的，這種作用稱為"分子篩效應”。當用含有硫酸銨和球蛋白的混合物進行上樣時，球蛋白最先被吸脫下來，硫酸銨后被吸脫下來，

4、從而達到分離的目的。3、需用的儀器和試劑層析柱、試管、鐵架臺、恒壓瓶飽和硫酸銨、10%氫氧化鈉、1%硫酸銅、1%氯化鋇4、實驗步驟凝膠的預處理、裝柱、 鹽析、上樣收集、鑒定、數(shù)據(jù)處理； 5、教學方式學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。結(jié)合多媒體幻燈演示6、考核要求以出勤、隨堂提問、實驗報告和預習報告等平時成績?yōu)橹饕己藘?nèi)容7、實驗報告要求實驗報告應包括下列各項：（1）報告的題目（要簡明確切）；（2）寫報告人及共同測定人員的姓名；（3）實驗目的；（4）實驗原理；（5）實驗儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實驗數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7

5、實驗結(jié)果。明確提出本次實驗的結(jié)論，用公式計算或用文字說明 （8）分析與討論，要對實驗結(jié)果作出估計，分析誤差大小及原因，對實驗中發(fā)現(xiàn)的問題應進行討論，對實驗方法、實驗設備有何改進建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。實驗二 醋酸纖維薄膜電泳法分離動物血清蛋白質(zhì)1、本次實驗的目的和要求掌握醋酸纖維薄膜電泳的原理，操作及測定動物蛋白質(zhì)的相對百分含量技術2、實驗內(nèi)容或原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在pH值大于其等電點的溶液中成為帶負電的陰離子，在電場中 移向陽極。血清中的數(shù)種蛋白質(zhì)在同一pH條件下由于其解離狀況不同、，帶點不同，在電場中移動速度不同，采用電泳法可將其分離。醋酸纖維素是纖維素羥基乙?；纬傻睦w維

6、素乙酰酯將它溶于有機溶劑后，涂抹成均勻的薄膜待溶劑干后即稱為醋酸纖維薄膜。3、需用的儀器和試劑水平電泳裝置、培養(yǎng)皿、試管、電泳儀 、電泳槽、0.07mol/L 巴比妥-巴比妥鈉緩沖液、氨基黑10B、漂洗液、透明液4、實驗步驟（1）醋酸纖維薄膜的潤濕和選擇（2）制作電橋：將緩沖液倒入電泳槽中，根據(jù)電泳槽的縱向尺寸，于兩極支架上各放入三層濾紙，濾紙的一端與支架的前端對齊，另一點進入緩沖液中，除去氣泡使濾紙緊貼于支架上，即為紙濾橋。（3）點樣：無光澤面朝上，在距負端1.5cm處，蓋玻片點樣注意點樣時應使血清均勻的分布在點樣區(qū)形成有一定寬度粗細均勻的直線，這是獲得重要清晰區(qū)帶電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)之一?？?/p>

7、事先在濾紙上練習點樣。（4）電泳：將點好樣的薄膜無光澤面向下，兩端貼在電泳槽支架的濾紙上，點樣端在負極。平衡10min ，調(diào)電壓最大，然后調(diào)電流，0.6mA/條，預電泳10min，調(diào)電流1mA/條，電泳45min關閉電源.注意電泳過程中防止電壓偏高或偏低.（5）電泳完畢，取出薄膜直接浸入染色液(.氨基黑10B)中，染色五分鐘（6）漂洗：漂洗液漂洗直至背景染色脫去呈白色，可看出清晰的五條區(qū)帶.（7）記錄：由正極依次為清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白。記下遷移距離。（8）透明：甲液2min，乙液1min，寧缺毋濫。取出薄膜貼于載玻片上放置于陰涼處晾干備用5、教學方式學生為主，教師

8、輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求同上7、實驗報告要求實驗報告應包括下列各項：（1）報告的題目（要簡明確切）；（2）寫報告人及共同測定人員的姓名；（3）實驗目的；（4）實驗原理；（5）實驗儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實驗數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7 實驗結(jié)果。明確提出本次實驗的結(jié)論，用文字說明 （8）分析與討論，要對實驗結(jié)果作出估計，分析誤差大小及原因，對實驗中發(fā)現(xiàn)的問題應進行討論，對實驗方法、實驗設備有何改進建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。實驗三 血清乳酸脫氫酶同工酶的分離與測定（聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳法）1、本次實驗的目的

9、和要求掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術，包括制膠、灌膠、加樣、電泳、剝膠、染色及脫色等。學會用盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離同工酶。2、實驗內(nèi)容或原理聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構的凝膠。血清樣品中含有5種同工酶，在同一pH條件下，解離狀況不同，通過聚丙烯酰胺凝膠具有的濃縮效應、分子篩效應和電荷效應將五種同工酶分離。3、需用的儀器和試劑離心機、中壓電泳儀，電泳槽、注射器、玻璃管、加樣器、丙烯酰胺貯液、過硫酸銨、蔗糖、核黃素、乳酸鈉、輔酶I、PMS、NBT4、實驗步驟（1）貯液及制備 （分

10、離膠每份15ml，濃縮膠每份5ml，可供60人使用）（2）制膠：用注射器在玻璃管管底加入3-4滴蔗糖 加樣器加膠至管高2/3處 加1cm重蒸水水封放到水浴鍋的試管架上聚合除去上層水封加入1cm大孔膠 加1cm重蒸水水封置于燈管下 聚合至凝膠呈乳白色。（3）安裝：將卸掉皮筋、膠帽、乳膠管的玻璃管裝入圓盤電泳槽中，排出管兩端的氣泡。（4）上樣：樣品組成為：兔血清 + 40%蔗糖 + 0.1%溴酚藍（體積比1：1：1）。上樣80l。（5）電泳：上槽連接負極，下槽連接正極。開始時調(diào)節(jié)電流2mA/管，3min后調(diào)節(jié)電流4mA/管。電泳時間根據(jù)指示劑染料的遷移來決定，當溴酚藍指示劑接近凝膠底部1cm時停止

11、電泳。（6）剝膠：用注射器吸滿水，從濃縮膠的一端小心的插入到管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動玻璃管同時推動注射器，靠水流的壓力和潤滑作用將玻璃管與凝膠分開，最終使凝膠從玻璃管中脫落。（7）染色：避光37保溫10-30min，凝膠條上可顯示出紫色的LDH帶。從正極依次為LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5 （M4）（其中LDH4和LDH5含量較少）（8）計算相對遷移率： 相對遷移率=點樣點到各帶的距離/點樣點到染料的距離（9）染色的固定：將凝膠條放入7%醋酸中脫色和固定。5、教學方式學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求考核要求同上。7、實驗

12、報告要求實驗報告要求同上。實驗四 動物肝臟DNA的提取1、本次實驗的目的和要求了解DNA和RNA 的不同溶解性質(zhì)。學習用鹽溶液法從動物組織中提取DNA的原理和操作技術2、實驗內(nèi)容或原理核酸和蛋白質(zhì)時構成生物有機體的主要成分，在生物體內(nèi)核酸通常是與蛋白質(zhì)結(jié)合成核帶白的形式存在，核蛋白有脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白。在濃的NaCl溶液中， 脫氧核糖核蛋白溶解度更大，核糖核蛋白溶解度很小，而在稀的NaCl溶液中， 脫氧核糖核蛋白溶解度很小，而核糖核蛋白溶解度很大，因此可利用不同濃度的NaCl溶液將核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白從樣品中分別提取出來.經(jīng)提取到的核蛋白用SDS處理，會引起蛋白變性而與DNA分開

13、，氯仿異戊醇可將蛋白沉淀除去，DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量的冷乙醇，DNA即析出。.3、需用的儀器和試劑 試劑：0.1M NACL-0.05M檸檬酸鈉混合液 ， 5M NaCl， 25% SDS， 氯仿異戊醇， 95%冷乙醇。 儀器：小燒杯、玻璃棒 、大滴管、量筒、離心杯套筒、勻漿器、小天平、稱量紙。4、實驗步驟(1)細胞的破碎：取8g新鮮的動物內(nèi)臟，用15ml 0.1M NaCl -0.05M檸檬酸鈉混合液放入勻漿器中 研磨，然后倒出勻漿，4000rpm 離心10min，棄去上清液。(2)洗滌：向沉淀中加入10ml 0.1M NaCl -0.05M檸檬酸鈉混合液，玻璃棒攪拌，400

14、0rpm離心，10min，倒掉上清液。(3)蛋白質(zhì)變性：向沉淀中加入10ml 0.1M NaCl -0.05M檸檬酸鈉混合液，混勻后加入8滴SDS 60 水浴保溫10min ，此步的目的是使DNA與蛋白質(zhì)分離。(4)DNA溶解：稍冷加入5M NaCl溶液2ml，攪拌10min。(5)蛋白質(zhì)沉淀：加等體積的氯仿異戊醇 ， 震蕩20min，4000rpm 離心10min，離心杯中出現(xiàn)三層，上層為含DNA和殘留的DNA核蛋白的水層，中層為變性蛋白質(zhì)凝膠，下層是氯仿異戊醇的有機相層。(6)DNA析出：吸出上層的水相，慢慢加入95%冷乙醇，用玻璃棒攪出絲狀的DNA，晾干即為DNA實驗產(chǎn)品。5、教學方式學

15、生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求同上基本考核要求。7、實驗報告要求同上實驗報告要求實驗五 紫外吸收法測定核酸含量1、本次實驗的目的和要求學習紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法2、實驗內(nèi)容或原理DNA和RNA都具有紫外吸收的性質(zhì)，它們的紫外吸收高峰在260nm處。其紫外吸收特性是由于它們含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)的特性所決定的。每毫升溶液含1g DNA鈉鹽的光吸收值為0.020，因此在260nm處測的未知樣的光吸收值即可求出其含量。3、需用的儀器和試劑試管、紫外分光光度計、水浴鍋晾干的DNA粗制品，蒸餾水4、實驗步驟（1）

16、用蓋玻片刮取1mg DNA粗制品，溶于10倍體積的蒸餾水中。(2)在260nm波長下，以蒸餾水作參照，在紫外分光光度計上測定其吸收值。5、教學方式學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求考核要求同上。7、實驗報告要求實驗報告要求同上。實驗六 應用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用1、 本次實驗的目的和要求轉(zhuǎn)氨基作用是動植物界普遍存在的一種生化反應，研究動植物體的轉(zhuǎn)氨基作用可以了解動植物體不同發(fā)育階段代謝動態(tài)的一個側(cè)面，從而研究控制其代謝途徑。2、實驗內(nèi)容或原理由轉(zhuǎn)氨酶催化，經(jīng)轉(zhuǎn)氨基后，原來氨基酸上的氨基轉(zhuǎn)移到酮酸的相應位置上，形成新的另外一個氨基酸和酮酸，可在濾紙上進行層析并被茚三酮溶液檢

17、出。3、需用的儀器和試劑勻漿器、培養(yǎng)皿、試管、毛細血管、吹風機、0.01mil/L磷酸緩沖液，丙氨酸，- 酮戊二酸，飽和苯酚4、實驗步驟（1）肌肉靡的制作：取新鮮魚肉糜100g，加入100ml 0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，用勻漿器制成勻漿備用。 （2）酶促反應： 管號試 劑對照管測定管0.1 mol/L丙氨酸(ml)1.01.00.1 mol/L- 酮戊二酸(ml)1.01.0肌肉靡(ml)2.02.0對照管加入肌肉靡后立即煮沸10min，而后放入37水浴中保溫30min，測定管37保溫30min后，立即于沸水浴中加熱10min終止反應。冷卻后將二管分別過濾2滴到載玻片上待用。 丙 05cm測 谷 對照（3）點樣：取層析紙一張，找出圓心。通過圓心作垂直線，在2條垂直線上于圓心相距0.5cm處，分別作為測定管和對照管及標準丙氨酸，谷氨酸的點樣位置如圖所示。 點樣時將毛細管口輕輕點在濾紙上，使斑點直徑3mm，重復三次，每次待完全干燥后再點下一次。（4）展層：點樣前在層析紙的圓心處打一小洞，取一小層析紙條，剪成刷狀，卷成燈芯狀，插入小孔內(nèi)，使毛刷朝下，點樣面朝上平放在盛有飽和苯酚的培養(yǎng)皿中，上面蓋上合適的培養(yǎng)皿。大約45min待溶劑前沿達到培養(yǎng)皿邊緣小于1cm 處，取出層析紙，記下溶劑前沿去