(干貨)液相色譜基礎(chǔ)知識大全

1、一、基本原理高效液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質(zhì)的差別。二、高效液相色譜分析原理（1）、高效液相色譜分析的流程：由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測物由進(jìn)樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入

2、檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。（2）、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A

3、不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A,C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離之目的。不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動力學(xué)兩方面的綜合效益。三、工作原理儲液器中的流

4、動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相,被流動相載入色譜柱（固定相）內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對運(yùn)動時,經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。四、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)HPLC有以下特點(diǎn)：高壓壓力可達(dá)150300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速流速為0.110.0ml/min。高效可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。高靈敏度一一紫外檢測器靈敏度可達(dá)O.Olng。同時

5、消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快一一通常分析一個樣品在1530min,有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高一一紫外檢測器可達(dá)O.Olng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)O.lpg。柱子可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。五、液相色譜的五大系統(tǒng)1、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分為手動進(jìn)樣閥和自動進(jìn)樣器。手動進(jìn)樣閥對于手動進(jìn)樣閥使用過程中需要注意每個樣品進(jìn)樣完成后應(yīng)對進(jìn)樣閥進(jìn)行清洗，防止殘留對下一個樣品分析的影響。還需要注意進(jìn)樣方式，以20UL定量環(huán)為例，我們可以選

6、擇完全充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進(jìn)樣的重復(fù)性，選擇完全充滿定量管進(jìn)樣方式時，需要注入定量環(huán)體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進(jìn)樣方式時，進(jìn)樣體積應(yīng)在定量管體積一半以下，即1-1OPL。自動進(jìn)樣器如果采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，首先需要保證注射器里面沒有氣泡存在，否則影響進(jìn)樣量準(zhǔn)確性;其次是樣品瓶里面有足夠的樣品，保證進(jìn)樣針能夠吸到樣品。為了避免交叉污染需要定期對樣品瓶、蓋和墊進(jìn)行清洗。若自動進(jìn)樣器長時間不使用，應(yīng)該注意：腐蝕性的流動相或洗液（例如，堿性或酸性緩沖溶液）必須完全從系統(tǒng)中置換出來。同時，為了避免細(xì)菌的生長，應(yīng)將一個樣品瓶中充滿甲醇，并重復(fù)幾次進(jìn)樣操作。2、輸液系統(tǒng)輸液泵按輸出

7、液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析來說，輸液泵的流量穩(wěn)定性更為重要，這是因?yàn)榱魉俚淖兓瘯鹑苜|(zhì)的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。輸液泵按工作方式分為氣動泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足下列條件：a流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍（一般為110ml/min）；b能抗溶劑腐蝕；c有較高的輸液壓力；對一般分離，60X105Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達(dá)到150300X105Pa。（1）往復(fù)式柱塞泵結(jié)構(gòu)和原理當(dāng)柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，

8、同時，流動相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關(guān)閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的流動相。（2）氣動放大泵結(jié)構(gòu)和原理其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積（SA）活塞A，則在小面積（SB）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1，則壓力為5X105Pa的氣體就可得到壓力為250X105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。泵頭通常由兩部分組成-單向閥和密封圈-柱塞桿.單向

9、閥一般由閥體塑料或陶瓷閥座和紅寶石球組成.在壓力的作用下寶石球離開閥座,流動相流過單向閥;反之,在反向力的作用下,寶石球回到閥座上,此時流動相不再流過單向閥.顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏.為了保證單向閥不發(fā)生泄漏,一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座,也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上.在不同的應(yīng)用領(lǐng)域,單向閥閥體的材料有所不同,例如考慮生物兼容性的系統(tǒng),單向閥的閥體往往采用金屬鈦,而不用不銹鋼.為了降低成本和減少維護(hù)費(fèi)用,一些生產(chǎn)廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件,當(dāng)然其功能仍保持不變輸液系統(tǒng)即是指高壓恒流泵，其作用是能提供穩(wěn)定準(zhǔn)確的流速。溶劑

10、過濾頭：吸液過濾頭，或稱沉子，主要作用是過濾流動相中可能存在的顆粒性雜質(zhì)。長時間使用后，雜質(zhì)有可能阻塞溶劑過濾頭上的過濾板孔隙;或長時間使用緩沖液，過濾頭表面容易產(chǎn)生一層膜，阻礙流動相正常通過。嚴(yán)重時，即使是已超聲過的溶劑，泵吸液時也會有氣泡在四氟輸液管里產(chǎn)生，因此應(yīng)經(jīng)常對過濾頭進(jìn)行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系統(tǒng)需注意濾頭的烘干處理。單向閥：單向閥的作用是確保液體向一個方向流動，是高壓恒流泵穩(wěn)定輸液的保證。日常使用過程中，可以通過觀察壓力的情況，初步判斷流量是否正常。如果系統(tǒng)已經(jīng)平衡一段時間，壓力應(yīng)該是穩(wěn)定的。但如果壓力存在波動，則表明流量不穩(wěn)定;如果無壓力，則表明無流量。這兩種情況大多是因?yàn)閱蜗蜷y里混入了氣泡或雜質(zhì)?；烊霘馀莸那闆r，應(yīng)把放空閥打開，按沖洗鍵將里面的氣泡排出。單向閥混入雜質(zhì)的情況，須對其進(jìn)行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇，安裝時注意標(biāo)記環(huán)的方向。密封圈：密封圈是固定在柱塞桿上防止泵腔內(nèi)的液體泄漏，是保證泵頭輸液正常的關(guān)鍵部件。但柱塞桿和柱塞密封圈長期使用會發(fā)生磨損，主要與流量、操作壓力和所使用的流動相有關(guān)。當(dāng)使用含鹽的流動相時，由于脫水或蒸發(fā)