基因敲除新技術(shù)

1、會計學(xué)1基因敲除新技術(shù)基因敲除新技術(shù)第1頁/共69頁ZFN 技術(shù)原理技術(shù)原理鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結(jié)構(gòu)中每一個螺旋可以特異識別3-4個堿基；人工設(shè)計識別特異DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通過改變其中7個X來實現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。第1頁/共69頁第2頁/共69頁ZFN 技術(shù)鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術(shù)進行各種基

2、因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達到識別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。第2頁/共69頁第3頁/共69頁第3頁/共69頁第4頁/共69頁嶄新的技術(shù)嶄新的技術(shù) - TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn)經(jīng)典的挑戰(zhàn) 染色體染色體DNA序列的人工編輯修改序列的人工編輯修改 （點）突變：（點）突變：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，（基因敲除，Knockout） 片段刪除片段刪除 片段插入片段插入目的與用途：生物模型；表達工具；基因治療目的與用途：生物模型；表達工具；基因治療嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn)第4頁/共69頁第5頁

3、/共69頁第5頁/共69頁第6頁/共69頁基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對象。技術(shù)原理：技術(shù)原理：表達一個重組核酸酶，在靶點識別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識別靶點核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過程。第6頁/共69頁第7頁/共69頁第7頁/共69頁第8頁/共69頁102堿基模塊單元 14 18個重復(fù)真核表達 14 18個重復(fù)特異識別指定的14 -18 個核酸序列并與之結(jié)合34氨基酸單元第

4、8頁/共69頁第9頁/共69頁TALEN 發(fā)展過程第9頁/共69頁第10頁/共69頁TALEN (TALE+FOK I) 表達質(zhì)粒對 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表達質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染、表達切割靶位點切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標(biāo)基因敲除突變體第10頁/共69頁第11頁/共69頁TALEN介導(dǎo)的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個數(shù)量級Donor plasmidHRDonor plasmidLeft armRight armDonor plasmidLeft

5、 armRight arm點突變片段刪除基因敲入第11頁/共69頁第12頁/共69頁2011年8月， Nature Biotechnology 上同時發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。 一篇人類干細胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 兩篇斑馬魚 Targeted gene disruption in somatic zebrafish

6、cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 一篇綜述Move over ZFNTALEN的最前沿第12頁/共69頁第13頁/共69頁X 2X 2X 2第13頁/共69頁第14頁/共69頁第14頁/共69頁第15頁/共69頁 TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點），只須按照靶點序列將相應(yīng)TAL

7、單元（14 -18個）串聯(lián)克隆即可。TALE識別模塊串聯(lián)構(gòu)建第15頁/共69頁第16頁/共69頁具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)第16頁/共69頁第17頁/共69頁具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)步驟一：靶點識別單元串聯(lián)第17頁/共69頁第18頁/共69頁步驟二：TALEN表達質(zhì)粒構(gòu)建具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng)第18頁/共69頁第19頁/共69頁將靶點識別模塊克隆入真核表達載體，得到將靶點識別模塊克隆入真核表達載體，得到Talen質(zhì)粒對質(zhì)粒對靶點識別模塊串接成功后需克隆入真核表達載體中。此真核表達載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有

8、FokI序列。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個堿基）分別進行TAL識別模塊構(gòu)建。X 2真核表達TALEN質(zhì)粒對第19頁/共69頁第20頁/共69頁步驟三步驟三. 將將TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞中實現(xiàn)靶基因敲除質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞中實現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，其表達的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點并與靶位點特異結(jié)合。此時，兩個TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標(biāo)基因。FOKI 內(nèi)切

9、酶打斷靶點區(qū)第20頁/共69頁第21頁/共69頁內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。突變體形成第21頁/共69頁第22頁/共69頁PCR 酶切法酶切法 利用靶點設(shè)計時挑選的，位于相鄰靶位點之間的特異性內(nèi)切酶位點，進行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 當(dāng)左右靶點之間沒有合適的酶切位點時可使用CEL-I核酸酶檢測。 經(jīng)驗規(guī)律：= 2%可用，=10%很好第22頁/共69頁第23頁/共69頁啟動子 ABCDEF stop-Target site - DEF

10、HIJK啟動子 ABCDEFHIJK共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測質(zhì)粒熒光素酶檢測質(zhì)粒+TALEN質(zhì)粒 1+TALEN質(zhì)粒 2熒光素酶檢測法熒光素酶檢測法發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。有文獻表明，發(fā)光倍數(shù)達1.5至2倍即可有效獲得突變體。第23頁/共69頁第24頁/共69頁 有限稀釋法獲得單細胞克隆 PCR-酶切法鑒定 PCR測序確認第24頁/共69頁第25頁/共69頁14 18bp靶點序列怎樣做TALEN第25頁/共69頁第26頁/共69頁康為TALEN定制質(zhì)粒產(chǎn)品1單元模塊質(zhì)粒A, G, C, T 4種選擇2單元模塊質(zhì)粒共16種選擇pCS2 TALEN真核表達載體TALEN空載

11、體2種/套1+2單元模塊質(zhì)粒套裝4+16+2共22種質(zhì)粒/套多單元模塊質(zhì)粒20以下任意單元數(shù)目pCS2 TALEN真核表達質(zhì)粒將指定TALEN模塊插入pCS2 TALEN真核表達載體第26頁/共69頁第27頁/共69頁康為TALEN技術(shù)服務(wù)TALEN質(zhì)粒構(gòu)建提供兩個測序證明的14-18堿基TALEN識別域真核表達克隆(pCS2)。且以293T細胞系轉(zhuǎn)染，PCR酶切鑒定，灰度掃描定量證實突變效率高于10%TALEN靶向敲除細胞系構(gòu)建提供經(jīng)克隆測序證明的目標(biāo)基因移碼突變細胞系(雜合子）TALEN靶向敲除斑馬魚構(gòu)建提供目標(biāo)基因基因移碼突變F1斑馬魚（雜合子）第27頁/共69頁第28頁/共69頁第28

12、頁/共69頁第29頁/共69頁第29頁/共69頁第30頁/共69頁第30頁/共69頁第31頁/共69頁第31頁/共69頁第32頁/共69頁第32頁/共69頁第33頁/共69頁新技術(shù)介紹新技術(shù)介紹CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)基因系統(tǒng)基因修飾技術(shù)修飾技術(shù)第33頁/共69頁第34頁/共69頁Biotechnology: Rewriting a genomeNature 495, 5051 (07 March 2013) doi:10.1038/495050a第34頁/共69頁第35頁/共69頁1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka U

13、niversity）在對一種細菌）在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。兩端還存在一段不太長的特有的序列。u2013以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CR

14、ISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。的基因修飾。第35頁/共69頁第36頁/共69頁1 CRISPR-Cas概述概述CRISPR-Cas：一種來源是細菌獲得性免疫的由：一種來源是細菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。第36頁/共69頁第37頁/共69頁CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：識別識別切割切割1 CRISPR-Cas概述概述第37頁/共69頁第38頁/共69頁1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)CRISPR：（clus

15、tered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, 廣泛分布于廣泛分布于細菌和古細菌基因組中。細菌和古細菌基因組中。CRISPR 位點通常由短的高度保守位點通常由短的高度保守的重復(fù)序列的重復(fù)序列(repeats) 組成組成, 重復(fù)序列的長度通常重復(fù)序列的長度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開。隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。）與靶基因進

16、行識別。第38頁/共69頁第39頁/共69頁1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)第39頁/共69頁第40頁/共69頁1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。第40頁/共69頁第41頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，

17、是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行通過對入侵的病毒和核酸進行特異性特異性的識別，利用的識別，利用Cas蛋白進蛋白進行切割，從而達到對自身的免疫。行切割，從而達到對自身的免疫。第41頁/共69頁第42頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第42頁/共69頁第43頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第43頁/共69頁第44頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細胞針對外源系統(tǒng)賦予原核細胞針對外源DNA特異性免特異性免疫疫, 而這種特異性是由間隔序列（而這種特異性是由間隔序列（s

18、pacer）決定的。在宿主）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細菌進化了菌進化了CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由揮是由CRISPR 間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。）來實現(xiàn)的。第44頁/共69頁第45頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。第45頁/共6

19、9頁第46頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。第46頁/共69頁第47頁/共69頁2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求第47頁/共69頁第48頁/共69頁3 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾第48頁/共69頁第49頁/共69頁3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes

20、 using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系統(tǒng)用設(shè)計好的統(tǒng)用設(shè)計好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來達到基因的定向模板替換的相應(yīng)基因來達到基因的定向修飾。修飾。第49頁/共69頁第50頁/共69頁3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換第50頁/共69頁第51頁/共69頁3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-

21、Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。第51頁/共69頁第52頁/共69頁3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾第52頁/共69頁第53頁/共69頁3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾第53頁/共69頁第54頁/共69頁3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA第54頁/共69頁第55頁/共69頁 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上發(fā)表的Multiplex Genome En

22、gineering Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的spacers的的crRNA實現(xiàn)了同時對兩個基因進行編輯。實現(xiàn)了同時對兩個基因進行編輯。3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 第55頁/共69頁第56頁/共69頁3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 第56頁/共69頁第57頁/共69頁4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術(shù)?？赡塬@得諾貝爾獎

23、技術(shù)。第57頁/共69頁第58頁/共69頁4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上發(fā)表的上發(fā)表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs對同一基因進行修飾，效率分別為對同一基因進行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。第58頁/共69頁第59頁/共69頁4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系

24、統(tǒng)前景分析 而且從實際應(yīng)用的角度來說，而且從實際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比比TALENs更更容易操作，因為每一對容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個核苷酸就行。個核苷酸就行。第59頁/共69頁第60頁/共69頁4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析u 只需合成一個只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。蛋白不具特異性。u 編碼編碼sgRNA的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZFNs更簡單方便。更簡單方便。u 較短的較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)的序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs編編碼載體帶來的并發(fā)癥。碼載體帶來的并發(fā)癥。技術(shù)優(yōu)勢第60頁/共69頁第61頁/共69頁ZFN 技術(shù)原理技術(shù)原理鋅指核酸酶（Zinc-finger nuc