wzc高級(jí)生化7-電泳技術(shù)

1、1蛋白質(zhì)分離分析方法之四：蛋白質(zhì)分離分析方法之四：電泳技術(shù)電泳技術(shù)2010.102010.1021. 1.定義：定義：帶電離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。帶電離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。 在外電場(chǎng)的作用下，帶電蛋白質(zhì)顆粒將向在外電場(chǎng)的作用下，帶電蛋白質(zhì)顆粒將向旨與其電性相反的電極移動(dòng)。電泳技術(shù)是旨與其電性相反的電極移動(dòng)。電泳技術(shù)是分離不同分子混合物的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)?？煞蛛x不同分子混合物的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)。可用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷酸和核酸用于氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷酸和核酸等生物分子的分離分析和制備。等生物分子的分離分析和制備。32. 2. 影響蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速度的因素：影響蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速度的因素：內(nèi)

2、不因素內(nèi)不因素主要決定于它所帶的凈電荷量、顆粒的主要決定于它所帶的凈電荷量、顆粒的大小和形狀。大小和形狀。外界因素外界因素如溶液的如溶液的pHpH值、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)強(qiáng)度、值、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)強(qiáng)度、溫度等也會(huì)影響蛋白顆粒的泳動(dòng)速度。溫度等也會(huì)影響蛋白顆粒的泳動(dòng)速度。不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分子大小和形狀不同，在同一不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分子大小和形狀不同，在同一pHpH時(shí)帶電荷數(shù)不等，因而其在同一電泳條件下的泳動(dòng)時(shí)帶電荷數(shù)不等，因而其在同一電泳條件下的泳動(dòng)速度不同因而可被分開(kāi)。速度不同因而可被分開(kāi)。45 若將帶靜電荷若將帶靜電荷Q Q的離子置于電場(chǎng)中，它的受力簡(jiǎn)單分析的離子置于電場(chǎng)中，它的受力簡(jiǎn)單分析如下：

3、如下： 電荷引力：電荷引力： F F引引EQEQ 根據(jù)根據(jù)StokesStokes公式，運(yùn)動(dòng)中的顆粒在溶液中受到阻力：公式，運(yùn)動(dòng)中的顆粒在溶液中受到阻力： F F阻阻6 r 6 r 平衡時(shí)，有平衡時(shí)，有 F F引引F F阻，即阻，即 EQEQ6 r 6 r 整理后得：整理后得： EQ/EQ/（6 r 6 r ） 式中：式中：EE電場(chǎng)強(qiáng)度；電場(chǎng)強(qiáng)度； r r球形粒子的半徑；球形粒子的半徑； 溶液的粘度系數(shù)；溶液的粘度系數(shù)； 帶電粒子運(yùn)動(dòng)速度。帶電粒子運(yùn)動(dòng)速度。63 3。電泳分類。電泳分類 按照電泳時(shí)是否按照電泳時(shí)是否使用支持介質(zhì)，使用支持介質(zhì)，可將電泳分為可將電泳分為 界面電泳界面電泳 區(qū)帶電泳

4、。區(qū)帶電泳。7 3.1 3.1 自由電泳在溶液中進(jìn)行自由電泳在溶液中進(jìn)行 方法是先在方法是先在U-U-形管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖液形管內(nèi)使蛋白質(zhì)溶液和緩沖液之間形成清晰的界面，然后加一電場(chǎng)之間形成清晰的界面，然后加一電場(chǎng)( (圖圖) )，界，界面就會(huì)移動(dòng)，每個(gè)移動(dòng)界面面就會(huì)移動(dòng)，每個(gè)移動(dòng)界面( (峰峰) )相當(dāng)于某一特相當(dāng)于某一特定的蛋白質(zhì)。定的蛋白質(zhì)。 由于界面處存在濃度梯度，利用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)由于界面處存在濃度梯度，利用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)可以觀察到界面系統(tǒng)可以觀察到界面( (電泳照相譜中的峰電泳照相譜中的峰) )的移的移動(dòng)，吸收峰的面積代表了蛋白質(zhì)的含量。動(dòng)，吸收峰的面積代表了蛋白質(zhì)的含量。83.2

5、 3.2 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳在固體支持物上進(jìn)行在固體支持物上進(jìn)行 按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可分為按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可分為: : 濾紙電泳濾紙電泳在濾紙電泳；在濾紙電泳； 薄膜電泳薄膜電泳如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳；如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳； 粉末電泳粉末電泳支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和鋪設(shè)成平板；粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和鋪設(shè)成平板； 細(xì)絲電泳細(xì)絲電泳如尼龍絲和其它人造絲電泳，這是如尼龍絲和其它人造絲電泳，這是類類微量電泳；微量電泳； 凝膠電泳凝膠電泳如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙如瓊脂、瓊脂糖

6、、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠等烯酰胺凝膠等9 按支持物的裝置形式不同，按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為：區(qū)帶電泳可分為：1) 1) 平板式電泳，平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的支持物水平放置，是最常用的電泳方式；電泳方式；2) 2) 垂直板式電泳，垂直板式電泳，聚丙烯酰胺凝膠常做成垂直聚丙烯酰胺凝膠常做成垂直板式電泳；板式電泳；3) 3) 垂直柱式電泳，垂直柱式電泳，聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳即聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳即屬于此類；屬于此類；4) 4) 連續(xù)液動(dòng)電泳，連續(xù)液動(dòng)電泳，首先應(yīng)用于紙電泳，將濾紙首先應(yīng)用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂端向下垂直豎立，兩邊各放一

7、電極，溶液自頂端向下流，與電泳方向垂直。后來(lái)有用淀粉、纖維素流，與電泳方向垂直。后來(lái)有用淀粉、纖維素粉、玻璃粉等代替濾紙來(lái)分離血粉、玻璃粉等代替濾紙來(lái)分離血 清蛋白質(zhì)，分清蛋白質(zhì)，分離量最大。離量最大。10 凝膠電泳最常用的介質(zhì)有：凝膠電泳最常用的介質(zhì)有： （1 1） 聚丙烯酰胺凝膠（分離蛋白質(zhì)）聚丙烯酰胺凝膠（分離蛋白質(zhì)） （2 2） 瓊脂糖凝膠（分離核酸）。瓊脂糖凝膠（分離核酸）。 這兩種凝膠電泳的分辨率都很高。這兩種凝膠電泳的分辨率都很高。 另有：瓊脂、硅膠、淀粉膠等另有：瓊脂、硅膠、淀粉膠等11聚丙烯酰胺凝膠是分離蛋白質(zhì)時(shí)最常用的凝聚丙烯酰胺凝膠是分離蛋白質(zhì)時(shí)最常用的凝膠，可以制作成平

8、板或柱子（圖）。故又膠，可以制作成平板或柱子（圖）。故又稱為平板凝膠電泳和柱狀凝膠。稱為平板凝膠電泳和柱狀凝膠。 1213dodecyldodecyl sulfate sulfate polyacylamidepolyacylamide gel electrophoresis gel electrophoresis SDS-SDS-蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，1.41.4克克SDSSDS與與1 1克蛋白質(zhì)結(jié)合，相克蛋白質(zhì)結(jié)合，相當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)分子的當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)分子的SDSSDS。這樣，蛋白這樣，蛋白質(zhì)的原有電荷效應(yīng)被覆蓋，帶有相同密度負(fù)電荷，分子量質(zhì)的原有

9、電荷效應(yīng)被覆蓋，帶有相同密度負(fù)電荷，分子量大小與遷移率成正比。大小與遷移率成正比。 SDSSDS改變蛋白質(zhì)分子單體構(gòu)象，全部變成似雪茄煙形的長(zhǎng)改變蛋白質(zhì)分子單體構(gòu)象，全部變成似雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒型。橢圓棒型。144. 4. 電泳技術(shù)的應(yīng)用：電泳技術(shù)的應(yīng)用： 電泳技術(shù)主要用于分離各種有機(jī)物（如氨基酸、多電泳技術(shù)主要用于分離各種有機(jī)物（如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、脂類、核苷酸、核酸等）和無(wú)機(jī)鹽；肽、蛋白質(zhì)、脂類、核苷酸、核酸等）和無(wú)機(jī)鹽；也可用于分析某種物質(zhì)純度，還可用于分子量的測(cè)也可用于分析某種物質(zhì)純度，還可用于分子量的測(cè)定。定。 電泳技術(shù)與其他分離技術(shù)（如層析法）結(jié)合，可用電泳技術(shù)與其他分離技術(shù)（

10、如層析法）結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，“指紋法指紋法”就是電泳法與層就是電泳法與層析法的結(jié)合產(chǎn)物。用免疫原理測(cè)試電泳結(jié)果，提高析法的結(jié)合產(chǎn)物。用免疫原理測(cè)試電泳結(jié)果，提高了對(duì)蛋白質(zhì)的鑒別能力。電泳與酶學(xué)技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)的鑒別能力。電泳與酶學(xué)技術(shù)結(jié)合發(fā)現(xiàn)了同工酶，對(duì)于酶的催化和調(diào)節(jié)功能有了深入的了了同工酶，對(duì)于酶的催化和調(diào)節(jié)功能有了深入的了解。所以電泳技術(shù)是醫(yī)學(xué)科學(xué)中的重要研究技術(shù)。解。所以電泳技術(shù)是醫(yī)學(xué)科學(xué)中的重要研究技術(shù)。15紙電泳用于血清蛋白質(zhì)分離已有相當(dāng)長(zhǎng)紙電泳用于血清蛋白質(zhì)分離已有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，在實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)中都曾經(jīng)的歷史，在實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)中都曾經(jīng)廣泛

11、應(yīng)用。自從廣泛應(yīng)用。自從19571957年年KohnKohn首先將醋酸首先將醋酸纖維薄膜用作電泳支持物以來(lái)，紙電泳纖維薄膜用作電泳支持物以來(lái)，紙電泳已被醋酸纖維薄膜電泳所取代。因?yàn)楹笠驯淮姿崂w維薄膜電泳所取代。因?yàn)楹笳呔哂斜燃堧娪倦姖B小、分離速率快、者具有比紙電泳電滲小、分離速率快、分離清晰、血清用量少以及操作簡(jiǎn)單等分離清晰、血清用量少以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)。4.1 4.1 紙電泳和醋酸纖維薄膜電泳紙電泳和醋酸纖維薄膜電泳16瓊脂經(jīng)處理去除其中的果膠成分即為瓊脂糖。由于瓊瓊脂經(jīng)處理去除其中的果膠成分即為瓊脂糖。由于瓊脂糖中硫酸根含量較瓊脂為少，電滲影響減弱，因而脂糖中硫酸根含量較瓊脂為少，電

12、滲影響減弱，因而使分離效果顯著提高。使分離效果顯著提高。例如血清脂蛋白用例如血清脂蛋白用瓊脂凝膠瓊脂凝膠電泳只能分出兩條區(qū)帶電泳只能分出兩條區(qū)帶（- -脂蛋白、脂蛋白、-脂蛋白），而脂蛋白），而瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠電泳可將血清電泳可將血清脂蛋白分出三條區(qū)帶（脂蛋白分出三條區(qū)帶（- -脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白和脂蛋白和-脂蛋脂蛋白）。所以瓊脂糖為較理想的凝膠電泳的一種材料。白）。所以瓊脂糖為較理想的凝膠電泳的一種材料。血清中的脂類物質(zhì)與載脂蛋白結(jié)合成水溶性的脂蛋白血清中的脂類物質(zhì)與載脂蛋白結(jié)合成水溶性的脂蛋白形式存在，各種脂蛋白中所含的載脂蛋白種類和數(shù)量形式存在，各種脂蛋白中所含的載脂蛋白種

13、類和數(shù)量不同、脂蛋白顆粒大小不同等因素，使它們?cè)陔妶?chǎng)中不同、脂蛋白顆粒大小不同等因素，使它們?cè)陔妶?chǎng)中的移動(dòng)速率各異，因而可以通過(guò)電泳達(dá)到分離。的移動(dòng)速率各異，因而可以通過(guò)電泳達(dá)到分離。4.2 4.2 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：17瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化是分離鑒定和純化DNADNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。 該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶染色啶染色, ,在紫外光下至少可以檢出在紫外光下至少可以檢出1-10ng1-10ng的的DNADNA條帶條帶, ,從而從而可以確定可

14、以確定DNADNA片段在凝膠中的位置。此外片段在凝膠中的位置。此外, ,還可以從電泳還可以從電泳后的凝膠中回收特定的后的凝膠中回收特定的DNADNA條帶條帶, ,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。 瓊脂糖瓊脂糖和聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離度。瓊脂糖凝膠分離DNADNA片度大小范圍較廣片度大小范圍較廣, ,不同濃度瓊不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp200bp至近至近50kb50kb的的DNADNA片段。片段。 瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒

15、定的電場(chǎng)下電泳。目前目前, ,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNADNA電泳。電泳。 18 聚丙烯酰胺分離小片段聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)DNA(5-500bp)效果效果較好較好, ,其分辯力極高其分辯力極高, ,甚至相差甚至相差1bp1bp的的DNADNA片片段就能分開(kāi)。段就能分開(kāi)。 聚丙烯酰胺凝膠電泳很快聚丙烯酰胺凝膠電泳很快, ,可容納相對(duì)大量可容納相對(duì)大量的的DNA,DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。19

16、（1 1） DNADNA的分子大小的分子大小: : 線狀雙鏈線狀雙鏈DNADNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與與DNADNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。（2 2） 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度一個(gè)給定大小的線狀一個(gè)給定大小的線狀DNADNA分子分子, ,其遷移速度在不同濃度的其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。瓊脂糖凝膠中各不相同。DNADNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃

17、度的選擇取決于成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNADNA分子的大小。分離分子的大小。分離小于小于0.5kb0.5kb的的DNADNA片段所需膠濃度是片段所需膠濃度是1.2-1.5%,1.2-1.5%,分離大于分離大于10kb10kb的的DNADNA分子所需膠濃度為分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為則所需膠濃度為0.8-1.0%0.8-1.0%。實(shí)驗(yàn)因素對(duì)電泳結(jié)果的影響：實(shí)驗(yàn)因素對(duì)電泳結(jié)果的影響：20 （3 3） DNADNA分子的構(gòu)象分子的構(gòu)象 當(dāng)當(dāng)DNADNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)分子處于不同構(gòu)象時(shí), ,它

18、在電場(chǎng)中移動(dòng)它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān)距離不僅和分子量有關(guān), ,還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNADNA在瓊脂糖凝在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的膠中移動(dòng)速度是不一樣的, ,超螺旋超螺旋DNADNA移動(dòng)最快移動(dòng)最快, ,而線狀雙鏈而線狀雙鏈DNADNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNADNA帶難以確定是質(zhì)粒帶難以確定是質(zhì)粒DNADNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌煌瑯?gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NADNA引起時(shí)引起時(shí), ,可從瓊脂糖凝膠上將可從瓊脂糖凝

19、膠上將DNADNA帶逐個(gè)回收帶逐個(gè)回收, ,用同一種限用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解制性內(nèi)切酶分別水解, ,然后電泳然后電泳, ,如在凝膠上出現(xiàn)相如在凝膠上出現(xiàn)相同的同的DNADNA圖譜圖譜, ,則為同一種則為同一種DNADNA。21224.3 4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無(wú)電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量小無(wú)電滲作用、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品量小（1100ug1100ug）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過(guò)控）、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，并可通過(guò)控制

20、單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例，聚合成不制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例，聚合成不同孔徑大小的凝膠，可用于蛋白質(zhì)、核酸等分同孔徑大小的凝膠，可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析。子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析。還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDSSDS），以），以測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。23將丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、緩沖液和催化劑等溶液按一將丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、緩沖液和催化劑等溶液按一定比例加到用瓊脂封了底的玻璃管中，聚合后得到圓定比例加到用瓊脂封了底的玻璃管中，聚合后得到圓柱膠。實(shí)際操作時(shí)，

21、在玻璃管中分兩次灌膠。先灌下柱膠。實(shí)際操作時(shí)，在玻璃管中分兩次灌膠。先灌下層的分離膠，待其聚合后再灌上層的濃縮膠。這樣制層的分離膠，待其聚合后再灌上層的濃縮膠。這樣制得的凝膠柱實(shí)際上是個(gè)不連續(xù)體系。得的凝膠柱實(shí)際上是個(gè)不連續(xù)體系。利用該體系中凝膠孔徑的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連利用該體系中凝膠孔徑的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、續(xù)性、pHpH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，先使進(jìn)的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，先使進(jìn)入柱膠的樣品在濃縮膠中逐漸濃縮、在上下膠層界面入柱膠的樣品在濃縮膠中逐漸濃縮、在上下膠層界面上最終被壓縮成很薄的樣品區(qū)帶，進(jìn)入分離膠后再進(jìn)上最終被壓縮成很薄的樣品區(qū)帶，進(jìn)

22、入分離膠后再進(jìn)行組分的分離，形成最終的分離區(qū)帶。行組分的分離，形成最終的分離區(qū)帶。根據(jù)分離膠緩沖液根據(jù)分離膠緩沖液pHpH值高低，有值高低，有3 3種操作系統(tǒng)，分別為堿性種操作系統(tǒng)，分別為堿性系統(tǒng)、酸性系統(tǒng)和中性系統(tǒng)，其中以堿性系統(tǒng)最為常系統(tǒng)、酸性系統(tǒng)和中性系統(tǒng)，其中以堿性系統(tǒng)最為常用。用。4.3.1 4.3.1 聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳：聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳：2425 在濃縮膠中，除了有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)外，還存在一在濃縮膠中，除了有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)外，還存在一種特殊的濃縮效應(yīng)。種特殊的濃縮效應(yīng)。該效應(yīng)是以上多種不連續(xù)效應(yīng)綜合作該效應(yīng)是以上多種不連續(xù)效應(yīng)綜合作用的結(jié)果。這種不連續(xù)聚丙烯

23、酰胺凝膠電泳由于兼有電荷用的結(jié)果。這種不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳由于兼有電荷效應(yīng)、濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，因此具有很高的分辨率。效應(yīng)、濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，因此具有很高的分辨率。其分子篩效應(yīng)主要由凝膠孔徑大小決定，而決定凝膠孔徑其分子篩效應(yīng)主要由凝膠孔徑大小決定，而決定凝膠孔徑的大小主要是凝膠的濃度。的大小主要是凝膠的濃度。 但交聯(lián)劑對(duì)電泳泳動(dòng)率亦有影響，交聯(lián)劑重量對(duì)總單位重但交聯(lián)劑對(duì)電泳泳動(dòng)率亦有影響，交聯(lián)劑重量對(duì)總單位重量的百分比越大，則電泳泳動(dòng)率越小。不管交聯(lián)劑是以何量的百分比越大，則電泳泳動(dòng)率越小。不管交聯(lián)劑是以何種方式影響電泳時(shí)的泳動(dòng)率，總之它是影響凝膠孔徑的一種方式影響電泳時(shí)的泳動(dòng)率，

24、總之它是影響凝膠孔徑的一個(gè)重要參數(shù)。個(gè)重要參數(shù)。 為了使實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較高，在制備凝膠時(shí)對(duì)交聯(lián)劑的濃度、為了使實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較高，在制備凝膠時(shí)對(duì)交聯(lián)劑的濃度、交聯(lián)劑與丙稀酰胺的比例、催化劑的濃度、聚膠所需時(shí)間交聯(lián)劑與丙稀酰胺的比例、催化劑的濃度、聚膠所需時(shí)間等影響泳動(dòng)率的因子都應(yīng)盡可能保持恒定。等影響泳動(dòng)率的因子都應(yīng)盡可能保持恒定。26如果合成的如果合成的聚丙烯酰胺凝膠從上至下是一個(gè)正的線性梯度凝膠聚丙烯酰胺凝膠從上至下是一個(gè)正的線性梯度凝膠，點(diǎn)在凝膠頂部的樣品在電場(chǎng)中向著凝膠濃度逐漸增高的方點(diǎn)在凝膠頂部的樣品在電場(chǎng)中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸減小的方向遷移。隨著電泳的繼續(xù)進(jìn)行，蛋向即孔

25、徑逐漸減小的方向遷移。隨著電泳的繼續(xù)進(jìn)行，蛋白質(zhì)受到孔徑的阻力越來(lái)越大。白質(zhì)受到孔徑的阻力越來(lái)越大。電泳開(kāi)始時(shí)，樣品在凝膠中的遷移速率主要受兩個(gè)因素的影響：電泳開(kāi)始時(shí)，樣品在凝膠中的遷移速率主要受兩個(gè)因素的影響：一是樣品本身的電荷密度，電荷密度越高，遷移速率越快；一是樣品本身的電荷密度，電荷密度越高，遷移速率越快；二是樣品分子的大小二是樣品分子的大小MrMr越大，遷移速率越慢。越大，遷移速率越慢。當(dāng)遷移所受到的阻力達(dá)到足以使樣品分子完全停止前進(jìn)時(shí)，那當(dāng)遷移所受到的阻力達(dá)到足以使樣品分子完全停止前進(jìn)時(shí)，那些跑得慢的低電荷密度的樣品分子將些跑得慢的低電荷密度的樣品分子將“趕上趕上”與它大小相與它大

26、小相同但具有較高電荷密度的分子并停留下來(lái)形成區(qū)帶。同但具有較高電荷密度的分子并停留下來(lái)形成區(qū)帶。4. 3.2 4. 3.2 連續(xù)密度梯度電泳：連續(xù)密度梯度電泳：27因此，在梯度凝膠電泳中，樣品的最終遷移位置僅因此，在梯度凝膠電泳中，樣品的最終遷移位置僅取決于分子自身的大小，而與樣品分子的電荷密取決于分子自身的大小，而與樣品分子的電荷密度無(wú)關(guān)。樣品混合物中分子質(zhì)量大小不同的組分，度無(wú)關(guān)。樣品混合物中分子質(zhì)量大小不同的組分，電泳后將依分子質(zhì)量大小停留在不同的凝膠孔徑電泳后將依分子質(zhì)量大小停留在不同的凝膠孔徑層次中形成相應(yīng)的區(qū)帶。層次中形成相應(yīng)的區(qū)帶。由此看出，在梯度凝膠電泳中，分子篩效應(yīng)體現(xiàn)得由此

27、看出，在梯度凝膠電泳中，分子篩效應(yīng)體現(xiàn)得更為突出。由于相對(duì)遷移率與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)在更為突出。由于相對(duì)遷移率與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，但僅適合于球狀蛋白質(zhì)，且電泳要的分子質(zhì)量，但僅適合于球狀蛋白質(zhì)，且電泳要有足夠高的伏特小時(shí)（一般不低于有足夠高的伏特小時(shí)（一般不低于20002000伏特小伏特小時(shí)）。時(shí)）。28連續(xù)密度梯度電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)密度梯度電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1) 1) 具有使樣品中各個(gè)組分濃縮的作用。具有使樣品中各個(gè)組分濃縮的作用。稀釋的樣品可以分次上樣，不會(huì)影響最終稀釋的樣品可以分次上樣，不會(huì)影

28、響最終分離效果。分離效果。 2) 2) 可提供更清晰的譜帶，適于純度分析?？商峁└逦淖V帶，適于純度分析。 3) 3) 可在一張膠片上同時(shí)測(cè)定分子質(zhì)量分可在一張膠片上同時(shí)測(cè)定分子質(zhì)量分布范圍相當(dāng)大的多種蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。布范圍相當(dāng)大的多種蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。 4) 4) 可以測(cè)定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，可以測(cè)定天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，這對(duì)研究寡聚蛋白是相當(dāng)有用的。這對(duì)研究寡聚蛋白是相當(dāng)有用的。294.3.3 SDS-4.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移率取決于它在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移率取決于它所帶的凈電荷的多少、分子

29、的大小和形狀。所帶的凈電荷的多少、分子的大小和形狀。如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二烷基硫酸鈉（縮寫(xiě)烷基硫酸鈉（縮寫(xiě)SDSSDS）加熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白）加熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原，質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原，并且并且1g1g蛋白質(zhì)可定量結(jié)蛋白質(zhì)可定量結(jié)合合1.4g SDS1.4g SDS，亞基的構(gòu)象呈長(zhǎng)橢圓棒狀。，亞基的構(gòu)象呈長(zhǎng)橢圓棒狀。由于與蛋白質(zhì)由于與蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合的SDSSDS呈解離狀態(tài)，使蛋白質(zhì)亞基帶上大量負(fù)電呈解離狀態(tài)，使蛋白質(zhì)亞基帶上大量負(fù)電荷，其數(shù)值大大超過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷密度，荷，其數(shù)值大大超

30、過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷密度，掩蓋了掩蓋了不同亞基間原有的電荷差異。不同亞基間原有的電荷差異。各種蛋白質(zhì)各種蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物復(fù)合物具有相同的電荷密度，具有相同的電荷密度，電泳時(shí)純粹按亞基靠凝膠的分電泳時(shí)純粹按亞基靠凝膠的分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離。子篩效應(yīng)進(jìn)行分離。有效遷移率與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成有效遷移率與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成很好的線性關(guān)系。很好的線性關(guān)系。30313233 所以，所以，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳不僅是一聚丙烯酰胺凝膠電泳不僅是一種好的蛋白質(zhì)分離方法，也是一種十分有種好的蛋白質(zhì)分離方法，也是一種十分有用的測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的方法。用的測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的方法。 應(yīng)該注意的是，應(yīng)

31、該注意的是，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)得的是蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量。對(duì)寡法測(cè)得的是蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量。對(duì)寡聚蛋白來(lái)說(shuō)，為了正確反映其完整的分子聚蛋白來(lái)說(shuō)，為了正確反映其完整的分子結(jié)構(gòu)，還應(yīng)用連續(xù)密度梯度電泳或凝膠過(guò)結(jié)構(gòu)，還應(yīng)用連續(xù)密度梯度電泳或凝膠過(guò)濾等方法測(cè)定天然構(gòu)象狀態(tài)下的分子質(zhì)量濾等方法測(cè)定天然構(gòu)象狀態(tài)下的分子質(zhì)量及分子中肽鏈（亞基）的數(shù)目。及分子中肽鏈（亞基）的數(shù)目。344.3.4 4.3.4 等電聚焦電泳等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)的聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)的作用下會(huì)自發(fā)形成一個(gè)連續(xù)的作用下

32、會(huì)自發(fā)形成一個(gè)連續(xù)的pHpH梯度。梯度。蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離，運(yùn)動(dòng)到等電點(diǎn)膠層時(shí)就失去所帶蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離，運(yùn)動(dòng)到等電點(diǎn)膠層時(shí)就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)電荷而穩(wěn)定停留在該處，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)不同，因而在等電聚焦電泳中得到有效分離。不同，因而在等電聚焦電泳中得到有效分離。在等電聚焦電泳中，利用各蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)的差異，并不利在等電聚焦電泳中，利用各蛋白質(zhì)組分等電點(diǎn)的差異，并不利用凝膠的分子篩作用。用凝膠的分子篩作用。它的分辨力高，可分離等電點(diǎn)相它的分辨力高，可分離等電點(diǎn)相差差0.010.02pH0.010.02pH單位的蛋白質(zhì)，可用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定

33、蛋白質(zhì)的單位的蛋白質(zhì)，可用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，精確度可達(dá)等電點(diǎn)，精確度可達(dá)0.01pH0.01pH單位。單位。354.3.5 4.3.5 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳先先將混合物在一個(gè)直徑將混合物在一個(gè)直徑1mm1mm的玻管凝膠中進(jìn)行等電聚的玻管凝膠中進(jìn)行等電聚焦凝膠。聚焦后將凝膠條小心的從毛細(xì)管中取出，焦凝膠。聚焦后將凝膠條小心的從毛細(xì)管中取出，然后放到另一平板凝膠的頂部（垂直板）或一端然后放到另一平板凝膠的頂部（垂直板）或一端（水平板），再讓膠條中已經(jīng)分離的組分在平板（水平板），再讓膠條中已經(jīng)分離的組分在平板膠中走膠中走SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。由于蛋白質(zhì)的

34、等電點(diǎn)和分子質(zhì)量之間沒(méi)有什么必然的聯(lián)由于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量之間沒(méi)有什么必然的聯(lián)系，因此，經(jīng)過(guò)雙向電泳可將數(shù)千種蛋白質(zhì)分開(kāi)，系，因此，經(jīng)過(guò)雙向電泳可將數(shù)千種蛋白質(zhì)分開(kāi)，顯示出極高的分辨力。顯示出極高的分辨力。36375. 5. 基本操作過(guò)程基本操作過(guò)程分離膠的制備分離膠的制備濃縮膠的制備濃縮膠的制備 加樣加樣 待分離樣品的制備待分離樣品的制備 電泳電泳剝膠剝膠 固定染色、洗脫固定染色、洗脫 38 根據(jù)分離根據(jù)分離DNADNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠胺凝膠. .1. 1.按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底按要求裝配好垂直電泳

35、板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用部用1%1%的瓊脂的瓊脂 糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出漏出. .2. 2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成將裝好的玻璃電泳板傾斜成45456060角角. .3. 3.按表按表3 3配制所需配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)濃度凝膠的毫升數(shù). .4. 4.加入加入TEMEDTEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液的膠床中，直到液 體接近溢出時(shí)為止體接近溢出時(shí)為止. .5. 5.立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力泡，用一有力

36、 的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使玻璃板斜靠在物體上，使 成成1010角，可減少液體泄漏的機(jī)角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì)會(huì). .6. 6.室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入倒入0.1XTBE 0.1XTBE 緩沖液緩沖液. .39 7. 7. 小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤⌒⌒娜〕鍪嶙樱⒓从镁彌_液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳出后，?子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn) 生不

37、規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNADNA電泳帶型不規(guī)則電泳帶型不規(guī)則. . 8. 8. 將將DNADNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不加樣時(shí)不 要產(chǎn)生氣泡要產(chǎn)生氣泡. . 9. 9. 接好電極，電壓為接好電極，電壓為1-8V/cm1-8V/cm，進(jìn)行電泳，進(jìn)行電泳. . 10. 10. 根據(jù)指示劑遷移位置來(lái)判定是否終止電泳根據(jù)指示劑遷移位置來(lái)判定是否終止電泳. . 11.11.電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻去一塊玻 璃板，讓凝膠吸附在另

38、一塊玻璃板上璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上. .浸入含浸入含0.5ug/ml0.5ug/ml的溴化乙錠溶的溴化乙錠溶 液液中，中，151530min30min后取出水洗紫外后取出水洗紫外儀下觀察結(jié)果儀下觀察結(jié)果. . 12. 12. 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng10ng以上量的以上量的DNADNA條條帶帶. .要求更高要求更高 的靈敏度，可用銀染的靈敏度，可用銀染. . 40常用的催化劑和加速劑有以下兩種：常用的催化劑和加速劑有以下兩種：（1 1）過(guò)硫酸銨）過(guò)硫酸銨-TEMED-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)（四甲基乙二胺）系統(tǒng) 在在AcrAcr 和和BisB

39、is的溶液中放入這個(gè)催化系統(tǒng)后，過(guò)硫酸銨的溶液中放入這個(gè)催化系統(tǒng)后，過(guò)硫酸銨 （NH4NH4）2S2O82S2O8產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過(guò)硫酸銨濃度的平方根成而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過(guò)硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進(jìn)行。正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進(jìn)行。 例如，在例如，在pH 8.8pH 8.8條件下條件下7 7的丙烯酰胺溶液的丙烯酰胺溶液3030分鐘就能聚合完分鐘就能聚合完畢；在畢；在 pH 4.3pH 4.3時(shí)聚合很慢，要時(shí)聚合很慢，要9090分鐘才能完成

40、。溫度與聚合分鐘才能完成。溫度與聚合的快慢成正比。通常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更的快慢成正比。通常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更快。如將混合后的凝膠溶液放在近快。如將混合后的凝膠溶液放在近00的地方，就能延緩聚合。的地方，就能延緩聚合。一般來(lái)講，溫度過(guò)低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時(shí)都能延緩一般來(lái)講，溫度過(guò)低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時(shí)都能延緩凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。在聚合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。41 （2 2）核黃素）核黃素-TEMED-TEMED系統(tǒng)系統(tǒng) 這是

41、一個(gè)光激發(fā)的催化反應(yīng)。核黃素在光照下分解，黃素這是一個(gè)光激發(fā)的催化反應(yīng)。核黃素在光照下分解，黃素被還原成無(wú)色型，但在有氧條件下，無(wú)色型又被氧化成有被還原成無(wú)色型，但在有氧條件下，無(wú)色型又被氧化成有游離基的黃素環(huán)，使聚合作用開(kāi)始。游離基的黃素環(huán)，使聚合作用開(kāi)始。 核黃素催化系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是：核黃素催化系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是： 用量極少（用量極少（ 1mg/100mL1mg/100mL），對(duì)所分析的樣品沒(méi)有任何影），對(duì)所分析的樣品沒(méi)有任何影響；響； 聚合作用所用的時(shí)間可以自由控制，變化光照時(shí)間、強(qiáng)聚合作用所用的時(shí)間可以自由控制，變化光照時(shí)間、強(qiáng)度，可使聚合延緩或加速。而過(guò)硫酸銨度，可使聚合延緩或加速。而過(guò)硫酸銨-TEMED-TEMED系統(tǒng)的聚系統(tǒng)的聚合作用所需的時(shí)間除了取決于溫度、合作用所需的時(shí)間除了取決于溫度、pHpH及有氧分子或不及有氧分子或不純物質(zhì)的存在外，還取決于它們的濃度。純物質(zhì)的存在外，還取決于它們的濃度。 為了使分析的結(jié)果重復(fù)性高，核黃素催化系統(tǒng)的光照時(shí)間為了使分析的結(jié)果重復(fù)性高，核黃素催化系統(tǒng)的光照時(shí)間和強(qiáng)度最好標(biāo)準(zhǔn)化。和強(qiáng)度最好標(biāo)準(zhǔn)化。 424344 關(guān)于凝