DNA重組生物試驗(yàn)報(bào)告

1、DNA重組生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生命科學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)課指導(dǎo)老師：成績(jī)：實(shí)驗(yàn)名稱：基因工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)類型：生物實(shí)驗(yàn)同組學(xué)生姓名：實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蠡蚬こ虒?shí)驗(yàn)是生物實(shí)驗(yàn)中極具代表性的一部分，在此次實(shí)驗(yàn)中有如下目的和要求：1、 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解和掌握含GFP基因質(zhì)粒的提取和瓊脂糖DNA電泳的等十個(gè)小實(shí)驗(yàn)組合而成的基因工程實(shí)驗(yàn)的原理和技術(shù)。2、 了解生物實(shí)驗(yàn)的完整流程，對(duì)實(shí)驗(yàn)室基本操作規(guī)范與儀器設(shè)備使用方法得到初步了解，從而建立系統(tǒng)、有條理的實(shí)驗(yàn)思路。3、 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力，在實(shí)踐中加強(qiáng)對(duì)專業(yè)知識(shí)的認(rèn)知與體會(huì)，融匯貫通，寓學(xué)于用，感受生物學(xué)科的魅力。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理基因工程又稱DNA重組技術(shù)，是將不同來(lái)源的基

2、因按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建成雜種DN6子（又稱重組DNA分子），然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種和生產(chǎn)新產(chǎn)品等?；蚬こ碳夹g(shù)為生命科學(xué)的研究提供了有力的手段，同時(shí)為以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的建立奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)?；蚬こ碳夹g(shù)建立的標(biāo)志性實(shí)驗(yàn)是：1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的伯格（P.Berg）等人將猿猴病毒SV40的DN用口大腸桿菌入噬菌體DNA分別進(jìn)行EcoRI酶切，然后用TDNA!接酶將兩個(gè)酶切片段進(jìn)行連接，率先完成了人類歷史上第一個(gè)DNA分子的體外重組實(shí)驗(yàn)，因此榮獲了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的科恩（S.Cohen）等人在體

3、外構(gòu)建了含四環(huán)素和鏈霉素兩個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得了雙抗性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，成功完成了第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)。上述兩大科研成果標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。一個(gè)典型的基因工程技術(shù)包含以下幾個(gè)步驟：1 .目的基因和載體DNA勺獲取。2 .目的基因和載體DNA勺限制性內(nèi)切酶的酶切消化。3 .酶切后的目的基因和載體DNA勺體外重組連接，以獲得重組DNA分子。4 .通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化等技術(shù)，將重組DNA子導(dǎo)入細(xì)菌等活細(xì)胞。5 .轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選鑒定以及目的基因表達(dá)的檢測(cè)。其中目的基因、載體、工具酶及宿主細(xì)胞是缺一不可的，因此被稱為基因工程的四大要素。實(shí)驗(yàn)一含GFP基因質(zhì)粒的提取目前獲取目的基因

4、DNA片段常用方法是：從GeneBank中查得目的基因的DNA序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR勺方法擴(kuò)增目的基因的DNA段。根據(jù)目的基因的來(lái)源不同，用于PCFT增的模板DNA大致有兩個(gè)來(lái)源：由于真核細(xì)胞DNA的基因編排方式，是由內(nèi)含子和外顯子等組成，因此，只能通過(guò)提取目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成出cDNA作為PCR的模板。原核生物的DNAM基因是連續(xù)的。因此提取原核細(xì)菌的DNA就可用于PCR的擴(kuò)增。本次實(shí)驗(yàn)的目的基因就是來(lái)自一種細(xì)菌編碼的脂肪酶基因。細(xì)菌基因組DNA的提取先是用溶菌酶及蛋白酶K裂解細(xì)胞，釋放DNARNAM蛋白質(zhì)等。然后用苯酚/氯仿處理，使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)離心去除蛋白質(zhì)及細(xì)菌碎片

5、，DNA和RNA存在于上清水相中，然后用RNase分解RNA酒精沉淀DNA即可獲取目標(biāo)基因組DNA實(shí)驗(yàn)二瓊脂糖DNA勺電泳DNA分子是兩性電解質(zhì)，在溶液中形成兼性離子而攜帶電荷，帶電分子在電場(chǎng)中將產(chǎn)生移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。帶電分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的快慢，除受到場(chǎng)強(qiáng)、緩沖液類型及緩沖液離子強(qiáng)度等外界因素的影響外，還受到分子的大小、帶電量及分子的形態(tài)等自身因素的影響。為避免斷電后電泳分開(kāi)不同DNA分子的迅速擴(kuò)散混合，DNA電泳常采用瓊脂糖的凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)三PCR擴(kuò)增目的基因1985年美國(guó)Cetus公司的穆利斯等人設(shè)計(jì)并研究成功了一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)PCR（PolymeraseChainReactio

6、n）,從而榮獲了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種類似于細(xì)胞內(nèi)DNA勺天然復(fù)制過(guò)程，利用半保留復(fù)制的原理，以待擴(kuò)增的DNA為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異的DNA片段。將目的基因DNAS高溫（94C）下解鏈成為單鏈模板；人工合成的一對(duì)與目的基因兩側(cè)序列相互補(bǔ)的寡核甘酸引物在低溫（4060C）下分別與變性的目的基因片段兩側(cè)的兩條鏈的部分序列互補(bǔ)結(jié)合；在中等溫度（6575C）下由耐熱DNA聚合酶（Taq酶）將dNTP中的脫氧單核甘酸加到引物3'-OH末端，并以此為起點(diǎn)，沿著模板以5'一3'方向延伸，合成一條新的互補(bǔ)鏈。新合成的DNAi連的起點(diǎn)是由加入的引

7、物在模板DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)決定的。由于PCR應(yīng)中，雙鏈DNA高溫變性成單鏈，引物與模板單鏈DNAf氐溫退火（配對(duì)），適溫下引物延伸3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，每一循環(huán)所形成的DNA分子均能成為下一循環(huán)的模板，所以PCR勺特定目的DNAT物以指數(shù)方式遞增，在數(shù)小時(shí)內(nèi)，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)后，理論上可使DNAT增至10億（230=109）倍。并且原來(lái)對(duì)單拷貝基因進(jìn)行探測(cè)和分析時(shí)需用10dg基因組DNA現(xiàn)在可以減少到ng水平。樣品DNA預(yù)變性雙鏈DNAS鏈,94C5min引物與單鏈模板DNA結(jié)合30-60C,30秒-雙鏈DNAB鏈<聚合酶合成新鏈94C、40秒65-75C、2min延伸反應(yīng)完成實(shí)驗(yàn)四PCR

8、產(chǎn)物的純化DNA分子內(nèi)特殊堿基序?qū)嶒?yàn)五DNA的酶切反應(yīng)基因工程技術(shù)必不可少的工具酶之一，是限制性內(nèi)切酶，它能識(shí)別和切割雙鏈列。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用特點(diǎn)分成i型、n型及m型3大類，I型和出型核酸限制性內(nèi)切酶一般由兩個(gè)亞基構(gòu)成，既具有內(nèi)切酶的活性，又有甲基化酶的活性，I型和出型識(shí)別位點(diǎn)固定但酶切位點(diǎn)不固定。而n型酶其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化酶作用活性是分開(kāi)的，而II型酶識(shí)別位點(diǎn)固定同時(shí)酶切位點(diǎn)也是固定的，因此基因工程中應(yīng)用的是n型核酸限制內(nèi)切酶。核酸限制性內(nèi)切酶的命名：以EcoRI為例，第一個(gè)大寫(xiě)字母E為大腸桿菌的屬名的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)字母co為大腸桿菌的種名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母R為大腸桿菌的

9、菌株名；最后一個(gè)羅馬數(shù)字表示該細(xì)菌中已分離出這類內(nèi)切酶的順序編號(hào)。實(shí)驗(yàn)六DNA酶切產(chǎn)物的過(guò)柱純化實(shí)驗(yàn)七質(zhì)粒的提取將一個(gè)有用的目的DNA片段通過(guò)體外重組技術(shù)，轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖及表達(dá)的工具稱為載體。載體種類很多，根據(jù)目的不同選用相應(yīng)的載體，其中質(zhì)粒是最常用的載體。質(zhì)粒（plasmid）是一種獨(dú)立于染色體之外的雙鏈DNA可自主復(fù)制、攜帶了少量的遺傳信息（如：抗生素抗性基因），自然界質(zhì)粒存在于原核生物及低等的真核生物（如酵母、霉菌），自然界發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒均有缺陷，必須經(jīng)過(guò)改造才能應(yīng)用于基因工程。理想的質(zhì)粒載體包含：一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)選擇性抗性標(biāo)記人工合成的多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsit

10、e,MCS含有多個(gè)核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)具有較小的相對(duì)分子量和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒具有不相容性（incompatibility）或不親和性，是指在沒(méi)有選擇壓力的條件下，兩種親緣關(guān)系密切，攜帶相同復(fù)制原點(diǎn)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的提取常用堿法提取：利用表面活性劑SDS溶解細(xì)胞膜上的磷脂和蛋白質(zhì)，在PH高達(dá)12.6的堿性條件下使染色體DNA變性，而分子量較小的質(zhì)粒DNA只是部分變性，當(dāng)醋酸鉀重新調(diào)回PH至中性時(shí)，質(zhì)粒復(fù)性恢復(fù)原狀，而該復(fù)性條件下染色體DNA能完全復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與菌體蛋白及細(xì)菌碎片凝集成塊，經(jīng)離心去除，而上清中含有質(zhì)粒DNA少量蛋白及RNA經(jīng)去除蛋

11、白及RNA后，即可獲取質(zhì)粒DNApBSS幽粒的圖譜實(shí)驗(yàn)八DNA的重組連接質(zhì)粒與目的基因經(jīng)核酸限制性內(nèi)切酶酶切后形成的DNA末端有兩類：平末端和黏性末端。按照一定比例將質(zhì)粒和目的基因混合后，加入DNA1接酶，DNA1接酶能酶促合成相鄰核甘酸之間的單鏈缺口，形成磷酸二酯鏈，很顯然，含黏性末端的DNA片段之間的連接效率，要明顯高于平末端的DNA片段間的連接。實(shí)驗(yàn)九感受態(tài)細(xì)菌的制備DNA重組分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳形狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的車t化（transformation）。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍

12、的現(xiàn)象。在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與宿主菌兩者在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系，另一方面還與宿主菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。所謂感受態(tài)，即指宿主細(xì)胞最易接受外源DNA段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由宿主菌的遺傳特性所決定，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子等影響。據(jù)報(bào)道cAMP可以使感受態(tài)水平提高10000倍，而CsT也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在指數(shù)期，新鮮柔嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。對(duì)于Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化而言，菌齡、CaCl2處理時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）的保存期以及熱擊時(shí)間均是很重要的因素，其中感受態(tài)細(xì)胞通常在122

13、4h內(nèi)轉(zhuǎn)化效率最高，之后轉(zhuǎn)化率急劇下降。因此在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)至ODO0為0.40.6后放入冰浴中使其終止生長(zhǎng)，然后將菌株置于低溫與處理的低滲CaCl2溶液中，即造成細(xì)胞膨脹，使細(xì)胞通透性發(fā)生短暫性變化，從而極易與外源DNAK黏附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。此時(shí)，將該體系轉(zhuǎn)移到42c下做短暫的熱擊（heatshock）,外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNM子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，是宿主細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基里培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（transformant）,即帶有異源DNA子的宿主細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)十重組質(zhì)粒DNA勺轉(zhuǎn)化外源DNA載體分子

14、的連接即為DNA1組技術(shù)，重組的DNA分子式在DNAi!接酶的作用下，有Mg2+ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源DNA分子連接起來(lái)。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過(guò)各種方法篩選出重組子，并可通過(guò)酶切電泳進(jìn)行重組子的鑒定。三、主要儀器設(shè)備在基因工程實(shí)驗(yàn)中用到的儀器主要包括：旋渦混合器、離心機(jī)、電泳槽、烘箱、PCR、冰箱等。此外，實(shí)驗(yàn)中所用工具還包括常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)工具如：離心管、移膠板、eppendorf管、移液器等。四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)一含GFP基因質(zhì)粒的提取實(shí)驗(yàn)步驟：1 .取菌液0.51ml,12000r/min離心1

15、0秒鐘，棄上清液2 .在旋渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散3 .加入400uL含溶菌酶的GTE溶液（含葡萄糖、Tris-Hcl緩沖?和EDTA,在旋渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散4 .37度保溫20分鐘。5 .加酚一氯仿異戊醇400ul,渦旋混勻，6 .12000r/min離心5min,將上清液移至新的離心管中。7 .向上清液中加入1/10體積（約40uL）的3mol/l醋酸鈉（pH5.2）,混勻，加入1mL的乙醇（約2倍體積的無(wú)水乙醇），混勻，-20度靜止30min沉淀DNA取出，12000r/min離心10min。8 .小心棄上清液，用1mL的70駐醇洗滌沉淀，12000r/min離心5

16、min,棄上清，放入55度烘箱中3分鐘，除去乙醇9 .用50uL含RNaseA的TE溶解，37度溫浴30min,除去RNA10 .取5uL樣品進(jìn)行電泳。樣品貯存再4度冰箱中。實(shí)驗(yàn)二瓊脂糖DNA勺電泳實(shí)驗(yàn)操作：1 .稱取0.7克的瓊脂糖，加入100ml0.5XTBE在微波爐上加熱，使瓊脂糖熔解2 .等凝膠溫度降至大約55c以下時(shí)，加入5屋的0.5mg/L澳化乙錠（EB）。3 .將移膠板放入膠室中，并將梳子垂直安插在移膠板上方，將凝膠倒入膠室中。4 .等凝膠完全凝固后（約30分鐘），將梳子輕輕拔出。5 .將凝膠體放入加有0.5XTBE電泳緩沖液的電泳槽中，并且使電泳緩沖液高出凝膠。6 .取2d16

17、X上樣緩沖液與5wlPCFT物混勻后，加到凝膠孔中，7 .加入如3科1的1/Hindlllmarker*。8 .蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷海?00V）以及電泳方向，開(kāi)始電泳。9 .前面色素接近膠的先端，切斷電流，停止電泳，打開(kāi)槽蓋。10 .取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像。實(shí)驗(yàn)三PCR擴(kuò)增目的基因?qū)嶒?yàn)操作管，添加以下各種成分反應(yīng)液1.取一個(gè)0.2mleppendorfddH2O36.5模板DNA5上游引物（10（1mol/L）下游引物（10mol/L）dNTPmxture（10mmol/L）10倍X緩沖液+MgCl2Taq酶總體積11屋（100-200ng）*11科11科111（各20n

18、mol）5科10.5?。?.5U）50l2.3.PCR儀中。C條件下使模板DNA®變性5min。變性94C30秒退火58C30秒延伸72C1.0min最后在72c條件進(jìn)行延伸7-10min。30cycles稍作離心，將反應(yīng)管放入設(shè)定反應(yīng)程序：944C保存4.取5d1反應(yīng)液用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，鑒定PCRT物是否存在以及大小。實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物的純化實(shí)驗(yàn)操作1 .電泳確認(rèn)后將PCR物移至1.5ml新的eppendorf管中。2 .加入200dlTE緩沖液，加入300酚/氯仿/異戊醇，混勻，室溫，12000rpm離心5分鐘。*3 .取上層水液添加1/10體積（約30?。┑?mol/

19、L的NaAc（pH5.2）和2.5倍體積（約0.75ml）的冰冷無(wú)水乙醇。4 .-20C冰箱中放置30min以上。5 .4C、12000rpm離心5min。6 .棄上清，添加1ml的冰冷70%醇。4C、12000rpm離心5min。7 .棄去上清，室溫干燥，30小TE液溶解沉淀。實(shí)驗(yàn)五DNA的酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟：1. 在0.5mleppendorf管中加入下列成分，（定容40l）AddHO2科1PCR產(chǎn)物301(5Ng)10X緩沖液4dlXhol21BamHI211總體積40dlBddH2O2i1pET質(zhì)粒30"10X緩沖液41Xhol2dlBamHI2i1總體積40"2.

20、混勻，少許離心一下。3. 在37c條件下反應(yīng)2-4小時(shí)以上，或酶切過(guò)夜。4. 取5d1酶切質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳，預(yù)檢。實(shí)驗(yàn)六DNA酶切產(chǎn)物的過(guò)柱純化1 .反應(yīng)管中加BufferB3250d1,輕彈混合均勻2 .裝柱，將pET的雙酶切產(chǎn)物混合液加在柱子白色填料區(qū)，靜置1分鐘，8000rpm離心1分鐘并棄去上層廢液。3 .分別加入500lWashsolution,9000rpm離心30s棄去廢液。4 .重復(fù)步驟3,棄去廢液后再在9000rpm條件下空離1分鐘。5 .分別將兩個(gè)柱子轉(zhuǎn)入新管，在柱中心加20lElution，靜置1分鐘，離心1分鐘。收集產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)七質(zhì)粒的提取實(shí)驗(yàn)步驟1 .取1.5ml培養(yǎng)液

21、在4C、12000rpm離心2min,棄去上清液，收集菌體。2 .加入100dl的溶液I,使菌體充分懸浮，室溫條件下靜置5min。3 .加入200dl新配置的溶液II,溫和上下顛倒2-3回，冰浴條件下靜置5min。4 .加入150dl的溶液III,上下顛倒混勻數(shù)次，冰浴條件下靜置5min。5 .4c條件下12000rpm離心10min。6 .取上清，加入等體積（400?。┑姆?氯仿/異戊醇，充分混勻，室溫條件下12000rpm離心5min。7 .吸取上層水相，加入1/10體積量（約40）3mol/L的pH5.2NaAc,再加入2.5倍體積（約1ml）的預(yù)冷的無(wú)水乙醇。8 .放入-20C冰箱中靜

22、止30min,然后在4c條件下12000rpm離心15min。9 .棄去上清液，加入1ml預(yù)冷的70%Z；醇，在4c條件下12000rpm離心5min,洗滌沉淀。10 .棄上清液，沉淀物自然干燥后，加入40lTE緩沖液溶解沉淀（pET質(zhì)粒用25TE溶解）。11 .加入2dl的10mg/ml的RNaseAH,37c保溫20-30min。12 .取5"的質(zhì)粒電泳。實(shí)驗(yàn)八DNA的重組連接實(shí)驗(yàn)步驟：1 .在離心管中加入以下樣品：PCR產(chǎn)物6科1pET/酶切產(chǎn)物2口10X連接緩沖液1口T4DNA連接酶1科12 .混勻后，離心將液體全部甩到管底。3 .16C條件下保溫過(guò)夜。4 .-20C備用實(shí)驗(yàn)

23、九感受態(tài)細(xì)菌的制備實(shí)驗(yàn)步驟：1. 接種BL21于LB培養(yǎng)基中37c振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2 .接100口培養(yǎng)液于5ml的LB液體培養(yǎng)基中，37c條件下振蕩培養(yǎng)2-2.5小時(shí)左右，OD600達(dá)0.4。3 .將1.5ml培養(yǎng)液移至eppendorf管中、冰浴20min。4 .4c條件下，4000rpm離心5min,棄去上清液。5 .添加0.75ml預(yù)冷的CaCl2溶液，用槍輕輕吹打。6 .冰浴30分鐘后，4c條件下，4000rpm離心5min,棄去上清液。7 .細(xì)胞沉淀用100預(yù)冷的CaCl2溶液懸浮。8 .冰浴放置，備用。實(shí)驗(yàn)十重組質(zhì)粒DNA勺轉(zhuǎn)化1. 取一管100口的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒與目的基因的連

24、接產(chǎn)物5。輕輕用槍吹打均勻，冰浴20min2. 42C、保溫90秒鐘，迅速放入冰中，冰浴5min。3. 添加1ml的LB培養(yǎng)基。4. 37c振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。5. 3000rpm離心5分鐘，棄去1ml上清，余下0.1ml用槍吹勻，吸至含有抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，均勻涂布。6. 37c倒置培養(yǎng)8-12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析GFP基因質(zhì)粒的提取中，還是比上圖為GFP雙酶切回收的電泳結(jié)果，從圖中可以看出，在實(shí)驗(yàn)一：含較成功的，即獲取了目標(biāo)基因組的DNA圖2上圖為PCRT增后的電泳結(jié)果（左五）從圖中可以看出，在此次電泳中，我的PCR產(chǎn)物并沒(méi)有很成功地產(chǎn)生。由于在實(shí)驗(yàn)一中的結(jié)果并沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題，因此我分析實(shí)

25、驗(yàn)三的電泳結(jié)果之所以會(huì)失敗，應(yīng)該是在實(shí)驗(yàn)二或是實(shí)驗(yàn)三的過(guò)程中出現(xiàn)了操作失誤或是其他不可控因素。在實(shí)驗(yàn)三的操作步驟中，主要部分為取一個(gè)0.2mleppendorf管，添加各種成分反應(yīng)液。由于各種反應(yīng)液要添加的量都比較小，而且添加順序比較固定，不能出現(xiàn)亂序添加的情況，這些都是可能造成實(shí)驗(yàn)失敗的因素。但經(jīng)過(guò)回憶，我在添加各反應(yīng)液的過(guò)程中使用的是設(shè)定好吸取容量的移液器，也沒(méi)有出現(xiàn)容量錯(cuò)誤、吸取排出不到位等現(xiàn)象。由于是排隊(duì)添加，順序與周圍同學(xué)進(jìn)行添加的順序也是一致的，因此我分析在添加反應(yīng)液這一步?jīng)]有出現(xiàn)失誤。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，在添加反應(yīng)液過(guò)后應(yīng)該稍作離心，再放入PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。我在添加反應(yīng)液之后，

26、因?yàn)橄胧垢鞣N反應(yīng)液更好融合，在離心之前將eppendorf管在旋渦反應(yīng)器上進(jìn)行了時(shí)長(zhǎng)約15秒的渦旋。我猜想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失敗很有可能與這次渦旋有關(guān)。在渦旋的過(guò)程，振蕩太過(guò)激烈，破壞了原有的基因組DNA,因此在之后的PCR擴(kuò)增中沒(méi)有出現(xiàn)產(chǎn)物。鑒于這一步驟的實(shí)驗(yàn)失敗，為了順利進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)，我吸取了老師提供的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以完成隨后的實(shí)驗(yàn)。圖3上圖為熒光蛋白的電泳結(jié)果（左三），從圖中可以看到，雖然顯示不是特別明顯，但是基本還算比較成功，可以作為熒光蛋白的培養(yǎng)菌落。上圖為實(shí)驗(yàn)最后的熒光蛋白結(jié)果，從圖中可以看到，熒光蛋白成功培養(yǎng)了出來(lái)，亮點(diǎn)清晰，但是數(shù)量較少，密度較小。總體來(lái)說(shuō)算是完成了整個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)要求，但是由于某些因素造成了菌落生長(zhǎng)的不均勻與小數(shù)量。我分析出現(xiàn)這種情況的原因大概跟我在將細(xì)胞鋪勻到平板上是出現(xiàn)了操作失誤。在將反應(yīng)管中的細(xì)胞液吸至平板的過(guò)程中，我錯(cuò)誤地將一半左右的細(xì)胞液鋪在了沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)的平板蓋上面。雖然在金老師的幫助下將那一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到了正確的位置，但是有可能在這個(gè)過(guò)程中