流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用優(yōu)秀課件

1、1流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用2 基本原理基本原理n光源u488nm蘭綠色，15mW空冷，氬離子激光n流路u流動(dòng)室(flow cell)F鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBS 無(wú)顆粒，無(wú)熒光本底 無(wú)菌，穩(wěn)定的pHF樣本流SAMPLE 單細(xì)胞懸液5*1051*106個(gè)/mln放大部分u光電倍增管PMT HVu放大電路 GAIN 增益F線性：LINF對(duì)數(shù)：LOGn統(tǒng)計(jì)：計(jì)算機(jī)3FLOW CELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath flu

2、id4FLOW CYTOMETRY(FCM)PMTAMPcomputerLINLOGLASERSAMPLESIGNAL5濾片濾片n帶通濾片 BAND PASS (BP)u只允許某些波長(zhǎng)的光通過(guò)n二向色性濾片 DICHROIC FILTERu一定波長(zhǎng)以上通過(guò)，該波長(zhǎng)以下折射630 nm BandPass FilterTransmitted LightWhite Light Source620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected lightTransmitted LightLight Source6PMTPMTPMTPMT

3、4DichroicFiltersBandpassFiltersFlow Cytometry PrincipleLaser 1234Flow cell7OPTICS8信號(hào)信號(hào)n熒光信號(hào)uFL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4u線性，對(duì)數(shù)n散射光信號(hào)u前向散射光(FS)：細(xì)胞大小u側(cè)向散射光(SS)：結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度9熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)10常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)(nm) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488

4、675 免疫熒光 深紅PI 488 620 DNA染色 橙紅11EPICS XL 流式細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞分析儀12BECKMANCOULTERBECKMANCOULTERFLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER-細(xì)胞分析領(lǐng)域中的細(xì)胞分析領(lǐng)域中的CTCT實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏度、多參數(shù)的細(xì)胞功能分析實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏度、多參數(shù)的細(xì)胞功能分析13細(xì)胞的特征與細(xì)胞功能n不同細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征n不同細(xì)胞的蛋白表達(dá)n其它細(xì)胞功能特征14CD # = cluster designation number1590 Degree Scatter0 200 400 600 8001000Forward S

5、catter0 200 400 600 8001000 815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionForward Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale16Log FITC 1000 100 10 1 110.1Count 30 700 15017Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 1001000Log PE Fluorescence (CD4).1 1 10 100123445%2%26% 雙參數(shù)直方圖雙

6、參數(shù)直方圖DOT PLOT27%18CD分子(Cluster of differentiation) -人類白細(xì)胞分化抗原1982年巴黎首屆國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議確定CD命名法已有200多個(gè)分化抗原群被鑒定和命名已得到WHO有關(guān)管理機(jī)關(guān)批準(zhǔn) 19CD抗原及其相關(guān)細(xì)胞群抗原及其相關(guān)細(xì)胞群n 細(xì)胞群 CD抗原 n T細(xì)胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38n B細(xì)胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75n 髓系細(xì)胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35n NK細(xì)胞 CD16 CD56 CD57 CD94n 血小板

7、 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 n 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97n 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-fn 內(nèi)皮細(xì)胞 CD105 CD106 CD109n細(xì)胞因子受體 CD25 CD115 CD117 CD122 CD12620212223242526HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)標(biāo)志CD23: 與變態(tài)反應(yīng)嚴(yán)重程度呈正相關(guān)275例正常人CD4,CD8計(jì)數(shù)編 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8號(hào) *109/L *100% *109/L

8、 *100% *109/L *100% *109/L 1 8.1 33.1 2681 38.3 1027 25.4 680 1.51 2 6.7 35.0 2345 43.2 1014 26.0 609 1.66 3 8.0 36.5 2920 38.0 1110 27.0 788 1.41 4 5.4 36.0 1944 43.5 846 22.0 428 1.98 5 5.4 34.1 1841 46.5 856 25.5 469 1.82 288例HIV/AIDS患者CD4,CD8計(jì)數(shù)編 WBC LY/WBC LY CD4/LY CD4 CD8/LY CD8 CD4/CD8號(hào) *109/

9、L *100% *109/L *100% *109/L *100% *109/L 1 3.9 44.5 1736 34.9 606 48.0 833 0.73 2 1.8 32.0 576 4.3 25 61.8 356 0.07 3 3.6 48.3 1739 16.4 285 58.6 1019 0.28 4 3.1 36.2 1122 17.4 195 59.2 644 0.29 5 5.1 39.9 2035 2.9 60 74.7 1520 0.11 6 4.7 35.8 1683 23.8 401 35.6 599 0.67 7 4.0 18.0 720 10.3 74 43.3

10、312 0.24 8 4.6 60.1 2765 19.3 534 58.6 1620 0.23 298例HIV/AIDS患者臨床情況編 性 測(cè)出抗HIV 目前的 診斷 臨 床 情 況 號(hào) 別 陽(yáng)性的年齡 年齡 1 女 30 30 HIV感染 無(wú)臨床癥狀 2 男 34 35 AIDS TB,PCP,面神經(jīng)麻痹,HZV, 隱球菌腦膜炎 3 女 30 34 HIV感染 無(wú)臨床癥狀 4 女 23 26 HIV感染 乏力,體力差 5 男 32 33 AIDS TB,PCP 6 女 62 63 HIV感染 無(wú)臨床癥狀 7 男 29 30 AIDS PCP 8 男 31 35 HIV感染 無(wú)臨床癥狀 30

11、3132亞亞型型常常 表表 達(dá)達(dá) 抗抗 原原M0CD11b CD13或或CD33M1CD13 CD15 CD33 CD34 HLA-DR CD56 CD19M2CD11b CD13 CD15 CD33 CD34M3CD11b CD13 CD15 CD33 CD34M4CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34M5CD4 CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34M6血血型型糖糖蛋蛋白白A CD13 CD33 CD34M7CD41 CD61 CD13 CD33 CD34 因因子子相相關(guān)關(guān)抗抗原原33AML與ALL免疫表型 CD19 CD7 CD33 C

12、D13 HLA-DR TdTB-ALL + - - - + +/-T-ALL - + - - -/+ +AML - -/+ + + +/- - 34T-ALL表型特征 CD7 CD5 CD2 CD3 CD4 CD8 CD1a I + 90% 75% - - - -II + + + 25% 90% 90% +III + + + + +/- +/- - 35非T-ALL亞型 HLA-DR CD19 CD10 CD20 Cyu smIg Ig重排I + - - - - - -II + + - - - - +III + + + - - - + IV + + + + - - +V + + + + + -

13、 + VI + + - + - - + 36AML免疫表型 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7HLA-DR + + - + + +/- +/-CD34 + +/- - +/- +/- - +/-CD33 + + + + + +/- +/- CD13 +/- + + + + + +/- CD11b - + +/- + + - / CD15 - + +/- + + +/- / CD14 - +/- - + + - - GPA - - - - - + - GP - - - - - - + 373839成人急性白血病成人急性白血病P-gpP-gp表達(dá)的臨床意義表達(dá)的臨床意義 P-gp+ P-gp

14、+ P-gp-P-gp- 緩解率（CR） 20.5% 78.5%AMLAML 6個(gè)月復(fù)發(fā)率 66.7 % 8.7% 151 平均無(wú)病生存期 5M 13M 緩解率（CR） 66.7% 80.0%ALL ALL 6個(gè)月復(fù)發(fā)率 50.0 % 9.5% 47 平均無(wú)病生存期 4M 13M李建勇 Clin J Oncol 1998,4:30240 成人成人ALLALL多藥耐藥多藥耐藥P-gpP-gp與形成學(xué)分型的關(guān)系與形成學(xué)分型的關(guān)系 分型 例數(shù) P-gp+ P-gp- P-pg陽(yáng)性率 L1 25 3 22 12% L2 40 10 30 25% L3 3 1 2 33.3%P0.05 華東：中華血液學(xué)

15、雜志，1998，19：37141P-gpP-gp表達(dá)與表達(dá)與ALLALL免疫分型的關(guān)系免疫分型的關(guān)系免疫分型 例數(shù) P-gp陽(yáng)性例數(shù) 陽(yáng)性率(%) B 38 8 21.1 T 10 1 10.0 T/B 4 2 50.0 難分類 4 2 50.0 My- 40 4 10.0 My+ 16 9 56.3 My+ALL My+ALL 的的P-gpP-gp陽(yáng)性率明顯增高陽(yáng)性率明顯增高42AMLAML中免疫表型與中免疫表型與P- gpP- gp表達(dá)的關(guān)系表達(dá)的關(guān)系成人：成人： P-gp的表達(dá)與CD7、CD14、CD42b、CD61、 CD34 等高度相關(guān)。老年人：老年人： P-gp的表達(dá)與CD14、C

16、D42b、CD61有相關(guān)性 P-gp的表達(dá)與CD34高度相關(guān)。 43444.血液病的其他應(yīng)用AA，PNH鑒別診斷自身抗體檢測(cè) PAIgG, PAIgM, PAIgA RBC抗體 粒細(xì)胞抗體45PNH紅細(xì)胞表面CD59表達(dá)4647 癌基因與抗癌基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系(癌前病變,惡性腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià))細(xì)胞增殖能力研究細(xì)胞增殖能力研究48490 200 400 600 8001000DNA contentCountNormal Cell Cycle 500 200 400 600 8001000PI FluorescenceCounts0 75 150 225 300DNA Analysi

17、s510 200 400 600 8001000PI FluorescenceCounts0 75 150 225 300DNA Analysis5253DNA倍倍體體DNA指指數(shù)數(shù)(DI)意意義義(染染色色體體數(shù)數(shù))正正二二倍倍體體 (2n, Diploid)1.0046條條染染色色體體亞亞二二倍倍體體 (Haploid)0.5023條條染染色色體體四四倍倍體體 (Teraploid)2.0092條條染染色色體體低低倍倍體體 (Hypoploid)1.01.046條條染染色色體體54淋巴瘤組織學(xué)分級(jí)與DNA倍體及S期細(xì)胞關(guān)系Histology DNA Analysis S 期比值期比值(%)

18、Low -grade Diploid 15Intermediate-grade Frequently Aneuploid 5 15High-grade Frequently Diploid 1555異倍體癌前病例病變結(jié)果組織類別 異倍體(例數(shù)) 癌變例數(shù) 組織學(xué)分級(jí) 1 2 3鼻咽 13 7 0 1 6口腔 7 4 0 0 4胃 10 3 0 0 3宮內(nèi)膜 9 6 0 1 5宮頸 6 2 0 0 2總計(jì) 45 22 2 20 56各類癌前病變組織學(xué)分級(jí)與DNA倍體關(guān)系(1)組織類別 不典型增 例數(shù) DNA倍體(例數(shù)) 生分級(jí) 二倍體 異倍體 鼻咽粘膜 1 11 11 0 2 28 23 5 3

19、 13 5 8口腔粘膜 1 10 10 0 2 6 6 0 3 19 12 7 57各類癌前病變組織學(xué)分級(jí)與DNA倍體關(guān)系(2)組織類別 不典型增 例數(shù) DNA倍體(例數(shù)) 生分級(jí) 二倍體 異倍體胃粘膜 1 18 18 0 2 14 13 1 3 14 6 8宮內(nèi)膜 1 10 10 0 2 14 13 1 3 16 8 8宮頸粘膜 1 9 9 0 2 16 12 4 3 5 3 2 58596061626364 活化血小板的概念活化血小板的概念循環(huán)血液中處于靜息狀態(tài)的血小板受到生物或物理因子刺激后,使血小板胞漿內(nèi)顆粒膜糖蛋白釋放與質(zhì)膜融合,血小板膜表面糖蛋白發(fā)生數(shù)量重排和構(gòu)象變化而成為活化血小

20、板65活化血小板的功能活化血小板的功能參與血栓形成與止血參與炎癥和免疫反應(yīng)參與腫瘤的轉(zhuǎn)移66血小板活化標(biāo)志物在缺血性腦血管疾病中研究血小板活化標(biāo)志物在缺血性腦血管疾病中研究： 1.腦缺血患者急性期血小板CD62p、CD63測(cè)定2.缺血性腦血管患者CD62p、CD54、CD49d測(cè)定3.缺血性腦血管患者CD62p、TSP、CD54測(cè)定676869 應(yīng)用應(yīng)用FCMFCM曾開(kāi)展過(guò)的一此基礎(chǔ)研究曾開(kāi)展過(guò)的一此基礎(chǔ)研究：胃癌及癌旁組織胃癌及癌旁組織DNADNA、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞凋亡、P- gp P- gp 、粘附分子檢測(cè)的臨粘附分子檢測(cè)的臨床意義床意義哮喘患者氨茶堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究哮喘患者氨茶堿誘導(dǎo)

21、細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 NONO與造血干細(xì)胞增殖活性關(guān)系的研究與造血干細(xì)胞增殖活性關(guān)系的研究中藥中藥 “清心飲清心飲”拆方治療病毒性心肌炎機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究拆方治療病毒性心肌炎機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究中藥治療強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)理研究中藥治療強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)理研究氨氯地平治療高血壓的機(jī)理研究氨氯地平治療高血壓的機(jī)理研究葛根素對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究葛根素對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究心臟移植后免疫排異反應(yīng)監(jiān)測(cè)的研究心臟移植后免疫排異反應(yīng)監(jiān)測(cè)的研究70細(xì)胞凋亡研究n亞二倍體nCD95(Fas, APO1)nAPO2.7nANNEXIN V-PIn斷裂點(diǎn)摻入71細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析-異倍體與凋亡峰異倍體與凋亡峰73凋亡檢測(cè) Annexin V-PI雙標(biāo)記GATESSAMPLE NAME : 1SAMPLE NUMBER: SAMPLE DATE: 10Sep99 SAMPLE TIME: 16:43:35 17Sep99 at 09:51:01Page 1SSC 60 50 40 30 20 100FS 60 50 40 30 20 100ACLG: 12835141566scaleGATESSAMPLE NAME : 1SAMPLE NUMBER: SAMPLE DATE: