體外診斷試劑研制常用技術(shù)指標(biāo)之分析性能評估

1、體外診斷試劑研制常用技術(shù)指標(biāo)之分析性能評估1.1 靈敏度WWW.ABIGEN.CN1.1.1 分析靈敏度：試劑盒的靈敏度即最低檢出量是指在統(tǒng)計學(xué)意義上能與零劑量區(qū)別的量。一般用95%可信限計算：重復(fù)測定零劑量點（n±10）,計算反應(yīng)量的均（x_）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）,以x_+2SD（夾心法試劑盒）或均值x_-2SD（競爭抑制法試劑盒）的反應(yīng)量計算出相應(yīng)的濃度，即為該試劑盒的分析靈敏度，這是我們醫(yī)療器械注冊資料所需提供的內(nèi)容。1.1.2功能靈敏度：將低值樣本倍比稀釋后重復(fù)測定（n±10）,計算反應(yīng)量的變異系數(shù)（CV%）,CV%大于20%時所對應(yīng)的劑量點，即為該試劑盒的功能靈敏度。

2、1.2 特異性特異性檢驗通常有兩種標(biāo)定方法：WWW.ABIGEN.CN1.2.1 交叉反應(yīng)率：一定濃度的結(jié)構(gòu)類似物在本試劑盒上的測定結(jié)果（物質(zhì)的量）與該類似物的量的比值的百分率。如:1000pmol/L的結(jié)構(gòu)類似物，在某試劑盒上測定結(jié)果是5pmol/L,其交叉反應(yīng)率=5pmol/L/1000pmol/L*100%=0.5%。1.2.2 實際測量值：對于不能用物質(zhì)的量表示的被測物，如糖蛋白激素FSH、LH、TSH和HCG,這4種激素具有相同的a亞單位，僅僅是a亞單位上部分氨基酸不同，實際操作中很容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，而這4種激素又分別有各自的同形異構(gòu)物，其量的表達方法還不能用物質(zhì)的量（mol/L，n

3、g/mL）表示，而只能借助于生物測定的活性單位（U/L，mIU/L）表示，而每一種激素的活性單位（IU）又有完全不同的生物學(xué)意義，相互之間沒有任何關(guān)聯(lián)，即并且每一種激素定義的單位意義完全不同，不同來源相同質(zhì)量的某一種激素的活性單位也不同它們之間的交叉反應(yīng)絕對不能用交叉反應(yīng)率表示，因此往往選擇實測值表示。WWW.ABIGEN.CN1.2.3 選擇交叉反應(yīng)對照物：當(dāng)交叉反應(yīng)的測量結(jié)果高于我們期待的結(jié)果時，可以從兩個方面分析：首先，該試劑盒抗體確實與這一交叉反應(yīng)因子存在交叉反應(yīng)，如FSH在結(jié)構(gòu)上與另外3種激素僅僅是a亞單位上個別氨基酸的不同，其特征抗體與其它位點有一定程度的結(jié)合的可能性是存在的，這種

4、非特異結(jié)合被限制在一定范圍內(nèi)是可以接受的。在另一方面，如果選擇的交叉反應(yīng)對照物中含有少量的被測物，如:欲考察FSH試劑盒對LH的交叉反應(yīng)，選擇的LH抗原中含有少量的FSH，高濃度的這種抗原在FSH試劑盒中的測量結(jié)果很可能高于所期待的結(jié)果，應(yīng)充分認識到這種結(jié)果并不是由于FSH抗體的交叉反應(yīng)引起的。因此，當(dāng)交叉反應(yīng)的測量結(jié)果高于我們期待的結(jié)果時，可以選擇另一來源的交叉反應(yīng)對照物重新測試以排除由于抗原不純而引起的對該試劑盒抗體交叉反應(yīng)的誤解。1.2.4 交叉反應(yīng)物對測定結(jié)果的影響：多大的交叉反應(yīng)是可能接受的，主要取決于被測物和交叉反應(yīng)物在人體內(nèi)的相對含量。如3，5，3'-三碘甲腺原氨酸（Tr

5、iindonhyroxine,T3）和甲狀腺素（Thyroxine，T4），因為血清中T4的含量是T3的近千倍，所以對于測量T4的試劑盒而言，與T3存在10%以下的交叉反應(yīng)率都不會影響T4的測定，而如果對于測量T3的試劑盒而言，即使與T4存在1%的交叉反應(yīng)率，都會嚴(yán)重影響T3的測定。1.2.5 其它影響因素：評價試劑盒時還應(yīng)注意其它因素，如：溶血、高血脂、抗凝劑、其它藥物、異嗜性抗體及自身免疫性疾病患者等對樣本測定結(jié)果的影響，這種影響對不同方法、不同檢測項目的影響程度是不一樣的，應(yīng)逐一充分認識。此部分內(nèi)容可放入抗干擾能力。1.3 劑量反應(yīng)曲線建立WWW.ABIGEN.CN定量標(biāo)記免疫分析的最主

6、要特征就是建立劑量反應(yīng)曲線，通過已知濃度的校準(zhǔn)物質(zhì)（自變量，X）和相應(yīng)的反應(yīng)量（因變量，Y）建立劑量一反應(yīng)關(guān)系，并同時測量待測品，通過待測樣品的反應(yīng)量（Y'），計算出未知樣品的濃度（X'），因此，這種劑量一反應(yīng)關(guān)系需要有良好的相關(guān)性，即統(tǒng)計學(xué)上的“相關(guān)系數(shù)（r）”（coefficientcorrelation），當(dāng)相關(guān)系數(shù)越趨近于1時，表明劑量反應(yīng)關(guān)系越密切。建立劑量反應(yīng)曲線時應(yīng)注意：1.3.1 選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型擬合如前所述，在評價試劑盒時，我們通常用雙對數(shù)（適用于非競爭性雙位點夾心法標(biāo)記免疫分析）數(shù)學(xué)模型和log-logit（適用于競爭法標(biāo)記免疫分析）數(shù)學(xué)模型。一般認為，經(jīng)

7、適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)轉(zhuǎn)換后的標(biāo)記免疫分析的劑量一反應(yīng)相關(guān)系數(shù)或其絕對值（r或|r|）應(yīng)不低于0.9900。 雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型：顧名思義，雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型因函數(shù)自變量（劑量）和因變量（反應(yīng)量）都經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換而得名。自然對數(shù)和常用對數(shù)對劑量反應(yīng)曲線的影響僅僅在于截距（A）的不同，通常我們?nèi)∽匀粚?shù)：lnY=A+B*lnX。大量的經(jīng)驗表明：多數(shù)夾心法標(biāo)記免疫分析（特別是微量或超微量分析，小于109克）經(jīng)雙對數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)換后，相關(guān)系數(shù)都能大于0.9900；對于微克級的被測物，選擇半對數(shù)函數(shù)有時能得到更好的相關(guān)系數(shù)。 log-logit數(shù)學(xué)模型：經(jīng)驗表明，對于抑制法標(biāo)記免疫分析，log-logi

8、t數(shù)學(xué)模型因其計算方法相對簡單，且大多數(shù)情況下可以得到較好的相關(guān)性，因此是評價這類試劑盒的首選數(shù)學(xué)模型。方程式：logitY=A+B*logX,式中：logitY=B/B0/（1B/B0）WWW.ABIGEN.CN對于這類試劑盒，還應(yīng)要求有效劑量值（ED25、ED50、ED75或ED20、ED50、ED80）應(yīng)在劑量一反應(yīng)曲線最高濃度點和最低濃度點之間，即25%（或20%）結(jié)合率（B/B0%）所對應(yīng)的劑量濃度點應(yīng)小于曲線最高劑量點，75%或（80%）結(jié)合率（B/B0%）所對應(yīng)的劑量濃度點應(yīng)大于曲線最低劑量點，使曲線在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)有足夠的落差。1.3.2 標(biāo)記免疫分析在選擇了特異抗體對特異抗

9、原的特定識別以后，劑量反應(yīng)曲線在適當(dāng)濃度的抗原、抗體配伍下，在一定范圍內(nèi)，應(yīng)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)或其絕對值（r或|r|）應(yīng)不低于0.9900。否則應(yīng)從如下幾個方面考慮： 抗體的濃度是否與抗原濃度相適應(yīng)； 選擇的劑量范圍是否合適； 選擇的函數(shù)方程是否合適。1.4精密度評價精密度是考察試劑盒對同一樣本重復(fù)測定時能否得到相同實驗結(jié)果的能力的指標(biāo)，通常用重復(fù)多次樣本測量結(jié)果的變異系數(shù)（CV%）表示，精密度評價是質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。1.4.1分析內(nèi)（intraassay）精密度：同一次實驗內(nèi)（同一塊微孔板上或?qū)嶒灄l件完全相同的情況下）同一樣本（如：質(zhì)控血清）重復(fù)測定（n±10）,測定結(jié)果

10、的變異系數(shù)（CV%）應(yīng)不高于10.0%。分析內(nèi)精密度的變化或異常升高，應(yīng)從方法學(xué)改進、實驗室條件改變、操作失當(dāng)?shù)确矫媾挪樵颉?.4.2分析間（interassay）精密度：分析間精密度涵蓋的內(nèi)容非常廣泛，至少應(yīng)包含入下內(nèi)容：同一試劑盒，不同批次之間；同一試劑盒，同一批次，不同實驗室之間；同一試劑盒，同一批次，同一實驗室，不同操作者之間；同一試劑盒，同一批次，同一操作者，有效期內(nèi)不同時間之間等。不同層次的分析間精密度的意義不盡相同，在評價試劑盒質(zhì)量時應(yīng)引起質(zhì)量控制工作者的足夠認識。評價分析間精密度時，同一樣本（如：質(zhì)控血清）在上述條件下重復(fù)測定（一般n±10）,測定結(jié)果的變異系數(shù)（C

11、V%）應(yīng)不高于15.0%。1.5準(zhǔn)確性評價WWW.ABIGEN.CN準(zhǔn)確性評價通常指測量結(jié)果趨近于真值的程度。但是，正如我們所認識到的，對于標(biāo)記免疫分析，特別是具有多種同形異構(gòu)體的大分子物質(zhì)而言，目前的分析方法還很難得到真值，因此，還沒有真正意義上的“準(zhǔn)確性評價”方法，目前通常是通過標(biāo)準(zhǔn)品核對實驗或回收率實驗進行考察。1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品核對實驗：試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品與相應(yīng)濃度的國際或國家標(biāo)準(zhǔn)品同時進行分析測定，要求兩條劑量一反應(yīng)曲線不顯著偏離平行（t測驗），以國際或國家標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，試劑盒內(nèi)校準(zhǔn)品的實測效價與標(biāo)示效價之比應(yīng)在0.9001.100之間。標(biāo)準(zhǔn)品核對實驗應(yīng)注意： 配制國際或國家標(biāo)準(zhǔn)品的稀

12、釋液應(yīng)與試劑盒校準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液相同，以保證兩條劑量一反應(yīng)曲線在相同反應(yīng)體系下反應(yīng)； 配制國際或國家標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍應(yīng)與試劑盒校準(zhǔn)物質(zhì)實際濃度范圍相當(dāng)，以保證反應(yīng)能在試劑盒工作范圍內(nèi)進行。1.5.2 回收率實驗WWW.ABIGEN.CN 添加回收率：選擇經(jīng)純化、分析過的，性能穩(wěn)定的已知高濃度的抗原定量加入低濃度被測樣本中，并進行分析測定，測定結(jié)果與已知理論濃度相比較，應(yīng)在90.0%110.0%范圍內(nèi)。 稀釋回收率：同樣選擇經(jīng)純化、分析過的，性能穩(wěn)定的已知高濃度的抗原，按照一定比例稀釋成系列溶液，并與試劑盒劑量反應(yīng)曲線同時測定，高濃度抗原系列與劑量反應(yīng)曲線相比較，應(yīng)不顯著

13、偏離平行（t測驗），效價比應(yīng)在0.9001.100之間。添加抗原溶液和稀釋液同樣應(yīng)與試劑盒校準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液相同，以保證反應(yīng)在相同體系下進行。注意：至少配制3個不同濃度添加到空白中的測試物，每一濃度配制2份樣品，每1次試驗對6份樣品重復(fù)測定3次，比較測定值和真實值求出回收率（%），即偏差。1.6檢測范圍（range）劑量-反應(yīng)曲線的工作范圍（workingrange）是指能達到一定精密度、準(zhǔn)確性和直線性時，測定方法適用的高低限度或量的區(qū)間，應(yīng)使其最精密的部分即曲線斜率最大的部分適合于臨床試驗測定需要的范圍。它既可以包括全部正常范圍（適合于高于和低于這個數(shù)值均有診斷意義的物質(zhì)，如血清胰島素、地高辛測

14、定），也可以在正常范圍的一端（即低于或者高于這個數(shù)值，不是兩者均有診斷意義的物質(zhì)，前者如血清雄烯二酮測定，后者如血清腫瘤標(biāo)志物分析）。1.7高劑量鉤變效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）WWW.ABIGEN.CN當(dāng)標(biāo)本中被測物濃度超過線性范圍上界時，所得結(jié)果反而降低或呈陰性，這種現(xiàn)象被形象地稱為高劑量鉤變效應(yīng)（HD-hookeffect）。由Miles等于1974年用雙位點IRMA測血清鐵蛋白時發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可以歸納為：在一步法試劑盒中是由于大量過?？乖c被捕獲抗原競爭結(jié)合限量的標(biāo)記二抗，二步法試劑盒與抗原的“質(zhì)”（表位數(shù)量及其重復(fù)表達數(shù)量）有關(guān)。固相捕捉抗體過量或有重復(fù)表達表位的抗原，呈飽和結(jié)合，

15、標(biāo)記二抗與抗原交叉重疊結(jié)合，產(chǎn)生立體效應(yīng)，使抗原“異構(gòu)”，與一抗的親和力減弱。洗滌時，標(biāo)記二抗體與抗原形成的復(fù)合物自固相脫離。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤變效應(yīng)的發(fā)生。使用時，可以將這些樣本進行稀釋，使其測量結(jié)果落在劑量反應(yīng)曲線內(nèi)，這一測量結(jié)果與稀釋倍數(shù)的乘積即為該樣本的原始濃度。1.8穩(wěn)定性評價試劑盒在有效期內(nèi)，在規(guī)定的條件下保存應(yīng)保持穩(wěn)定，各項性能指標(biāo)應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。穩(wěn)定性的實驗室檢驗，可以通過加速降解實驗進行，通常的做法是：有效期半年的試劑盒37°C放置3天，有效期1年的試劑盒37°C放置7天后檢驗，該項性能指標(biāo)均應(yīng)符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。目前國家食品

16、監(jiān)督管理局要求注冊提供的穩(wěn)定性資料包括至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的穩(wěn)定性研究資料。同時，穩(wěn)定性資料還應(yīng)包括模擬運輸情況以及開瓶穩(wěn)定性研究結(jié)果等。1.9健全性WWW.ABIGEN.CN健全性（validity）是免疫分析可靠性指標(biāo)之一。免疫化學(xué)分析原則上要求校準(zhǔn)試劑與被測物質(zhì)的免疫化學(xué)性質(zhì)相同，即使兩者之間的結(jié)構(gòu)有些差異，而它們的劑量-反應(yīng)曲線不互相偏離平行。一般采用含被測物質(zhì)的高值血清，按一定的比例稀釋，然后測定其含量。如果稀釋倍數(shù)與含量呈線性關(guān)系，那么這個分析具有良好的健全性。也可以在線性回歸之后，對校準(zhǔn)試劑（試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品）劑量-反應(yīng)曲線的斜率（bl）與高值血清稀釋曲線的

17、斜率（b2）的差別作顯著性測驗，以判斷這兩條曲線是否顯著偏離平行。健全性好壞可以證明未知雜質(zhì)或被測樣品中是否存在交叉反應(yīng)物質(zhì)。應(yīng)使用分析體系中的“零”制劑或分析緩沖液作為稀釋劑（diluents）來稀釋高值血清樣品，以保證稀釋樣品在理化狀態(tài)上與其它樣品的一致性。應(yīng)該注意的是：稀釋曲線應(yīng)做幾次重復(fù)實驗，以排除偶然因素的影響；稀釋曲線有時與劑量相關(guān)，尤其在偏離平行時要慎重地下結(jié)論。2定性標(biāo)記免疫分析方法分析性能評估的主要指標(biāo)2.1 陰性參考品符合率WWW.ABIGEN.CN2.1.1 建立陰性參考品：陰性參考品1套，一般應(yīng)不少于10種不同來源的，相對于該項測定是陰性的樣本，應(yīng)包含下述情況： 正常人

18、樣本，應(yīng)考慮到不同年齡組、不同種群的變化； 定量標(biāo)記免疫分析中特異性檢驗中的結(jié)構(gòu)類似物。2.1.2 陰性參考品符合率：評價試劑盒的陰性參考品符合率的理想情況應(yīng)為100%，即全部檢測呈陰性。若出現(xiàn)陽性或弱陽性，應(yīng)視具體情況具體分析。2.2 陽性參考品符合率2.2.1 建立陽性參考品：陽性參考品1套，至少應(yīng)包含5種不同來源的，各自有獨特代表性的陽性樣本，如強陽性樣本、弱陽性樣本，特別應(yīng)注意可能引起“HOOK”效應(yīng)的高濃度樣本。2.2.2 陽性參考品符合率：同樣，評價試劑盒的陽性參考品符合率的理想情況應(yīng)為100%，即全部檢測呈陽性。若出現(xiàn)陰性，應(yīng)視具體情況具體分析。2.3重現(xiàn)性/精密性WWW.ABI

19、GEN.CN定性標(biāo)記免疫分析試劑對于同一樣本重復(fù)測定（n±10）,應(yīng)取得一致的結(jié)果。即陰性樣本均應(yīng)呈陰性，陽性樣本均應(yīng)呈陽性。對于反應(yīng)結(jié)果被量化的定性試劑盒，陽性樣本反應(yīng)量的變異系數(shù)（CV%）應(yīng)不高于10.0%。2.4 cutoff值在篩查性試劑盒與診斷性試劑盒中的意義定性標(biāo)記分析試劑盒的所有分析結(jié)果都基于cutoff判定。因此，確定cutoff值對于定性標(biāo)記免疫分析試劑盒至關(guān)重要。建立cutoff值時應(yīng)選擇的個體應(yīng)考慮排除對被研究指標(biāo)有影響的因素，且樣本量應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義。習(xí)慣上以所選總樣本的80%、90%、95%（最常用）、99%的頻數(shù)為截斷點（cutoffpoint），相應(yīng)的劑量

20、即為cutoff值。篩查性試劑盒的試驗?zāi)康氖菑臒o癥狀的人群中找出可能患有某種疾病的患者，是要減少假陰性，就應(yīng)放寬百分位，通常選擇80%或90%的頻數(shù)為截斷點。而診斷性試劑盒是通過實驗室檢驗協(xié)助醫(yī)生確定患者是否患有某種疾病，要減少假陽性，就要適當(dāng)放寬假陰性，取95%或99%的頻數(shù)為截斷點。因此，同一試劑盒用于篩查性目的時和用于檢驗性目的時的cutoff值可能不同。2.5 穩(wěn)定性同定量試劑要求。3質(zhì)控血清的制備、標(biāo)定和應(yīng)用3.1制備WWW.ABIGEN.CN理想的質(zhì)控樣本至少應(yīng)包含下列特征：與被測物來源相同，有一定批量，規(guī)定條件下保存性質(zhì)穩(wěn)定，凍干品分裝支間差異小，無傳染性等。如，甲狀腺功能檢測的

21、質(zhì)控樣本，可以分別收集甲亢、甲低和正常人血清，混合后制備的質(zhì)控血清應(yīng)涵蓋被測物劑量反應(yīng)曲線的低、中、高三個區(qū)域。但實際操作時由于要求質(zhì)控樣本有一定的批量，可以供一段時間內(nèi)連續(xù)使用，并應(yīng)對血源進行生物安全性檢測，因此，收集臨床樣本制備質(zhì)控血清被認為不太現(xiàn)實。目前通常采用的是在正常人血清中定量添加被測物的方法制備質(zhì)控血清。具體方法是： 收集一定量的被測物人血清，或制備不含被測物血清，經(jīng)生物安全性檢驗呈陰性，離心、過濾、去雜質(zhì)，加防腐劑； 加入被測物高純品，分別在曲線低、中、高三個區(qū)域配制成三種濃度質(zhì)控血清； 分裝、冷干，得到質(zhì)控血清成品，-20°C保存，備用。3.2標(biāo)定和應(yīng)用選擇一定的分析系統(tǒng)，對質(zhì)控血清進行重復(fù)測定（n±20）,計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，一般以均值為質(zhì)控血清的靶值，均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差為質(zhì)控血清的測定上限和下限。實驗室在進行分析檢測時應(yīng)自覺使用質(zhì)控血清開展內(nèi)部質(zhì)量控制工作。按照規(guī)定，每次實驗中質(zhì)控血清數(shù)量應(yīng)為實驗總量的平方根。如，一塊96孔板的實驗中應(yīng)安排質(zhì)控血清數(shù)量910孔。每個點均應(yīng)為雙復(fù)孔，且安排在微孔板的上、下、左、中、右不同位置。3.3 記錄質(zhì)控結(jié)果和繪制質(zhì)控圖確定質(zhì)控血清的靶值是繪制質(zhì)控圖的基礎(chǔ)，分別繪制低、中、高三個質(zhì)控血清的質(zhì)控圖。以實驗次數(shù)為橫軸，以每