小鼠骨髓染色體制備及觀察(1)

1、整理課件1實(shí)驗(yàn)三 小白鼠骨髓染色體制備及觀察v1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求u 掌握動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體制備技術(shù) u 學(xué)會(huì)動(dòng)物細(xì)胞的滴片方法 u 觀察小白鼠染色體的形態(tài)特征和染色體數(shù)目 整理課件22、實(shí)驗(yàn)原理v 小鼠骨髓細(xì)胞v 秋水仙素可破壞骨髓細(xì)胞分裂過程中紡錘體的形成，把分裂細(xì)胞阻截在中期。v 通過對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的低滲、固定、滴片、染色等處理，可觀察到小鼠染色體。v 這種骨髓染色體制片方法簡(jiǎn)單，取材容易，不需無菌條件，方便易行。 整理課件33、實(shí)驗(yàn)材料v實(shí)驗(yàn)動(dòng)物u健康小鼠(Mus musculus 2n=40)，體重約1820g，雌雄不限。 v試劑 u甲醇、冰乙酸、石炭酸品紅、秋水仙素、KCl、生理鹽水

2、 整理課件43、實(shí)驗(yàn)材料v實(shí)驗(yàn)器材u恒溫培養(yǎng)箱、普通離心機(jī)、顯微鏡、分析天平、離心管(510 mL)、吸管注射器(5 mL)、100 mL燒杯、u載玻片 （冰片）整理課件53、實(shí)驗(yàn)材料v溶液配制：(1)0.01秋水仙素：稱10 mg秋水仙素，溶于100 mL生理鹽水中。(2)低滲溶液：稱5.59克KCl溶于1,000 mL蒸餾水中，其濃度為0.075M。2%檸檬酸鈉溶液：稱2.28克檸檬酸鈉溶于100ml蒸餾水中。Giemsa溶液整理課件64、實(shí)驗(yàn)方法v主要實(shí)驗(yàn)步驟u 秋水仙素注射u 解剖小鼠u 離心u 低滲u 固定u 制備細(xì)胞懸浮液u 滴片u 空氣干燥 u 染色 u 水洗 u 顯微鏡觀察結(jié)果

3、 整理課件7方法與步驟v取材前34 h，向腹腔內(nèi)注射秋水仙素。注射濃度隨動(dòng)物種類不同而異。秋水仙素的主要作用是使分裂細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，增加中期分裂相的比例。 整理課件8腹腔內(nèi)注射秋水仙素34小時(shí)后，斷頭處死小鼠。整理課件9取出小鼠的后肢骨，注意不要將股骨剪斷，否則容易造成骨髓細(xì)胞的流失。整理課件10滴加適量生理鹽水進(jìn)行沖洗，并仔細(xì)地將皮膚、肌肉等組織清除干凈。整理課件11加入適量低滲液，用剪刀將骨充分剪碎，并用吸管吹打，使骨髓細(xì)胞全部釋放出來。亦可用注射器抽取檸檬酸銨溶液沖洗骨髓，效果佳整理課件12將獲得的液體收集到離心管中，離心后去上清液，加低滲液至8ml左右，室溫下靜置2030分鐘，

4、進(jìn)行低滲。低滲結(jié)束后，加入1ml左右的Carnoys固定液進(jìn)行預(yù)固定，輕輕混勻后，離心。整理課件131000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清，加入固定液，混勻后，室溫放置25分鐘，再次離心去上清，重復(fù)固定一次，離心后，向沉淀中加入1ml固定液，將細(xì)胞重懸。整理課件14預(yù)冷的玻片預(yù)冷的玻片整理課件15滴片后，將片子晾干，滴加適量Giemsa染液染色1015分鐘，棄去染液，水洗，鏡檢。整理課件16實(shí)驗(yàn)結(jié)果苯酚品紅染色效果整理課件17結(jié)果顯示在顯微鏡尋找分散良好的中期分裂相。小白鼠染色體一般呈“U”形，都為近端著絲粒染色體。染色體數(shù)2n=40。圖示為吉姆薩染色效果整理課件185、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論v繪制

5、小鼠骨髓細(xì)胞染色體圖 v統(tǒng)計(jì)小鼠染色體數(shù)目v如果有條件時(shí)，要進(jìn)行顯微攝影，然后進(jìn)行組型分析 整理課件19 使用檸檬酸鈉的原因使用檸檬酸鈉的原因： 在臨床上采取新鮮血液時(shí)在臨床上采取新鮮血液時(shí),需要加入一些消毒需要加入一些消毒過的檸檬酸鈉過的檸檬酸鈉,就能起到防止血液凝固的作用就能起到防止血液凝固的作用,所所以檸檬酸鈉被稱為抗凝血?jiǎng)Ｒ詸幟仕徕c被稱為抗凝血?jiǎng)?枸櫞酸根與血中鈣離子形成難解離的絡(luò)合物，枸櫞酸根與血中鈣離子形成難解離的絡(luò)合物，鈣離子是凝血過程中所需的物質(zhì)之一，血液中鈣離子是凝血過程中所需的物質(zhì)之一，血液中鈣離子減少，而使血液凝固受阻。鈣離子減少，而使血液凝固受阻。 整理課件20低滲

6、的作用：低滲的作用： 低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液，例如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀溶液，例如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀（0.65M）、氯化鉀（）、氯化鉀（0.075M）等。低滲效果取決于低）等。低滲效果取決于低滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時(shí)間。低滲處理是憑滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時(shí)間。低滲處理是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，同時(shí)可使粘附于染借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，同時(shí)可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開，以便能在一個(gè)平面上觀察所有染色色體的核仁物質(zhì)散開，以便能在一個(gè)平面上觀

7、察所有染色體形態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中一般選用體形態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中一般選用0.075M KCl為低滲液（具體為低滲液（具體情況取決于實(shí)際操作），其優(yōu)點(diǎn)有：染色體輪廓清楚，情況取決于實(shí)際操作），其優(yōu)點(diǎn)有：染色體輪廓清楚，可染色性強(qiáng)，染色時(shí)間短，用于顯帶染色時(shí)能充分顯示可染色性強(qiáng)，染色時(shí)間短，用于顯帶染色時(shí)能充分顯示帶型特點(diǎn)。低滲處理為帶型特點(diǎn)。低滲處理為37，1525分鐘，以預(yù)實(shí)驗(yàn)條分鐘，以預(yù)實(shí)驗(yàn)條件為準(zhǔn)。件為準(zhǔn)。整理課件21思考題v1KCl溶液低滲處理與滴片過程在染色體制溶液低滲處理與滴片過程在染色體制片中有何聯(lián)系，對(duì)制片結(jié)果各有何影響？片中有何聯(lián)系，對(duì)制片結(jié)果各有何影響？v2骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制作時(shí)，為什么要采骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制作時(shí)，為什么要采用冰片滴片？冰片滴片時(shí)滴液高度有什