第十章高效液相色譜法

1、1第十章第十章 高效液相色譜法高效液相色譜法2高效液相色譜法：高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。一、一、HPLC與經(jīng)典與經(jīng)典LC區(qū)別區(qū)別二、二、HPLC與與GC差別差別三、特點(diǎn)三、特點(diǎn)3主要區(qū)別：主要區(qū)別：固定相、輸液設(shè)備和檢測(cè)手段固定相、輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1經(jīng)典經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 柱效低（H，n） 常壓輸送流動(dòng)相 分析周期長(zhǎng) 無(wú)法在線檢測(cè)2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 柱效高（H，n） 高壓輸送流動(dòng)相 分析時(shí)間大大縮短 可以在線檢測(cè) 色譜泵進(jìn)

2、樣器 檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)4相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè) 主要差別：主要差別：分析對(duì)象、流動(dòng)相、操作條件分析對(duì)象、流動(dòng)相、操作條件的差別的差別1分析對(duì)象分析對(duì)象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品， 高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測(cè)高聚物的樣品不可檢測(cè) 占有機(jī)物的占有機(jī)物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，溶解后能制成溶液的樣品， 不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及

3、高分子分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子 和離子型樣品均可檢測(cè)和離子型樣品均可檢測(cè) 用途廣泛，用途廣泛，占有機(jī)物的占有機(jī)物的80%52流動(dòng)相差別流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體，流動(dòng)相為惰性氣體，組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用 輸送流動(dòng)相壓力為220MPaHPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用 輸送流動(dòng)相壓力為0.10.5MPa3操作條件差別操作條件差別 GC：加溫操作加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┦覝?；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?三、三、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用的特點(diǎn)和應(yīng)用“

4、三高三高” “一快一快” “一廣一廣”高柱效n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物，廣泛用于中藥成分分離）7第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀國(guó)產(chǎn)P600高效液相色譜儀安捷倫1260高效液相色譜儀8高效液相色譜儀組成高效液相色譜儀組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 9液相色譜流程圖液相色譜流程圖 色譜泵進(jìn)樣器 檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)10一、高壓輸液系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng)1、 貯液器貯液器（1）作用：）作用：提供足夠數(shù)量的符合要求的流動(dòng)相以完成分析工作。（2）要求：）要求：必須有足夠的容積，以備重復(fù)分析

5、時(shí)保證供液；脫氣方便；能耐一定壓力；所用的材質(zhì)對(duì)所使用的溶劑都是惰性的。配有溶劑過(guò)濾器 2、 脫氣裝置脫氣裝置（1）作用：）作用：防止流動(dòng)相從高壓柱流出時(shí)，釋放氣泡進(jìn)入檢測(cè)器而使噪音劇增。（2）方法：）方法：吹氦脫氣 超聲波脫氣 真空脫氣123、 高壓輸液泵高壓輸液泵 關(guān)鍵部件之一。（1）作用：）作用：將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜分離系統(tǒng)。（2）要求：）要求： 泵體材料能耐化學(xué)腐蝕；能在高壓（3060MPa）下連續(xù)工作；輸出流量穩(wěn)定（ 1%），無(wú)脈沖，重復(fù)性高（ 0.5%） ，而且輸出流量范圍寬；適用于梯度洗脫。（3）類型：）類型：恒壓泵、恒流泵。輸液泵操作注意事項(xiàng)：輸液泵操作注意事項(xiàng)

6、：防止固體微粒進(jìn)入泵體防止固體微粒進(jìn)入泵體流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完不超過(guò)規(guī)定的最高壓力不超過(guò)規(guī)定的最高壓力流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣154、梯度洗脫裝置、梯度洗脫裝置（1）作用：）作用：縮短時(shí)間，使各組分完全分離。（2）類型：）類型：高壓梯度：高壓梯度：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。低壓梯度：低壓梯度：一臺(tái)高壓泵, 通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。16（二）（二） 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使

7、用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)17進(jìn)樣方法進(jìn)樣方法1.1.手動(dòng)進(jìn)樣手動(dòng)進(jìn)樣 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)18進(jìn)樣方法進(jìn)樣方法1.1.自動(dòng)進(jìn)樣（自動(dòng)進(jìn)樣器）自動(dòng)進(jìn)樣（自動(dòng)進(jìn)樣器）19 （三）分離系統(tǒng)（三）分離系統(tǒng)主要部件為色譜柱，一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱及柱溫箱20（四）檢測(cè)系統(tǒng)（四）檢測(cè)系統(tǒng)1、紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。合物有響應(yīng)?？勺儾ㄩL(zhǎng)紫外檢測(cè)器（可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器（UVD）適于：適于：吸收紫外光的物

8、質(zhì)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm10mm，容積 8L）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。氘燈氘燈190-600nm光柵光柵流通池流通池測(cè)量測(cè)量光電二極管光電二極管參比參比光電二極管光電二極管分束器分束器21光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD) 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。222、蒸發(fā)光檢測(cè)器蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。233、示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器(RID) 除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器。除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器。原理：原理：每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)?？蛇B續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比。特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。244、熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器(FLD)適于