第五章.分子生物學(xué)的研究方法-電泳、雜交

1、分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院1第五章第五章 分子生物學(xué)研究的主要方法分子生物學(xué)研究的主要方法序：重組序：重組DNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧第一節(jié)第一節(jié) DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)RNA提取提取第三節(jié)第三節(jié) DNA與蛋白質(zhì)互作與蛋白質(zhì)互作第四節(jié)第四節(jié) 基因組技術(shù)基因組技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)組技術(shù)蛋白質(zhì)組技術(shù)第六節(jié)第六節(jié) 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù)pDNA提取分離提取分離p核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳pPCR基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增p基因定點(diǎn)誘變基因定點(diǎn)誘變p核酸序列分析核酸序列分析p核酸分子雜交核酸分子雜交pDNA分子切割與連接分子切割與連

2、接分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院2序：重組序：重組DNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧p重組DNA技術(shù)的誕生（一）重組DNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ) 1. 40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院3分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院42、50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院53、50年代末和60年代:“中心法則”、操縱子學(xué)說、破譯遺傳密碼分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院6（二）關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組（二）關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組DNA技

3、術(shù)奠定基礎(chǔ)技術(shù)奠定基礎(chǔ)lDNA分子的切割與連接技術(shù)分子的切割與連接技術(shù)lDNA序列分析序列分析l載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立lSouthern雜交、和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸凝雜交、和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸凝膠電泳。膠電泳。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院7p重組重組DNADNA技術(shù)的定義及步驟技術(shù)的定義及步驟（一）重組（一）重組DNA技術(shù)技術(shù)1、重組、重組DNA技術(shù)（技術(shù)（recombinant DNA technology): 按照人的意愿，在體外對(duì)按照人的意愿，在體外對(duì)DNA分子進(jìn)行重組，分子進(jìn)行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞

4、中穩(wěn)再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中穩(wěn)定地增殖、表達(dá)，以大量獲得相關(guān)基因的產(chǎn)物定地增殖、表達(dá)，以大量獲得相關(guān)基因的產(chǎn)物或新品種新產(chǎn)物。或新品種新產(chǎn)物。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院8無性繁殖無性繁殖分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院9重組重組DNA技術(shù)的一般步驟技術(shù)的一般步驟目的基因獲得目的基因獲得功能研究功能研究轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院10第一節(jié)第一節(jié) DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)一、一、 DNA提取分離提取分離1溶液溶液I溶菌液：溶菌液：溶菌酶：溶菌酶：葡萄糖：增加溶液的粘度

5、，維持滲透壓，防止葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用受機(jī)械剪切力作用 EDTA：（：（1）螯合）螯合Mg2、Ca2等，抑制脫氧核糖核酸酶；（等，抑制脫氧核糖核酸酶；（2）有利）有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。 2溶液溶液IINaOHSDS液：液：NaOH：核酸在：核酸在pH大于大于5，小于，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。的溶液中，是穩(wěn)定的。 SDS：（：（1）溶解膜脂質(zhì)與蛋白。（）溶解膜脂質(zhì)與蛋白。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）與蛋）與蛋白質(zhì)結(jié)合成為白質(zhì)

6、結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。 提取液提取液離心離心組織組織上清液上清液沉淀沉淀TE溶液溶液無水乙醇無水乙醇離心離心RNase分子生物學(xué)研究方法分子生物學(xué)研究方法 西北師大西北師大 生科院生科院113. 溶液溶液III：3molL NaAc（pH4.8）溶液）溶液(質(zhì)粒質(zhì)粒DNA）p調(diào)回調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。在。p高鹽有利于染色體高鹽有利于染色體DNA、RNA（中和核酸上的電荷）以及（中和核酸上的電荷）以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀（鈉鹽與蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀

7、（鈉鹽與SDS蛋白復(fù)合物作用蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物）。后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物）。 4無水乙醇沉淀無水乙醇沉淀DNA：一般實(shí)驗(yàn)中，是加一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇倍體積的無水乙醇與與DNA相混合，其乙醇的最終含量占相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用左右。因而也可改用95乙醇。乙醇。 5NaAc或或NaCl至最終濃度達(dá)至最終濃度達(dá)0.10.25 mol/L： 中和中和DNA分子分子上的負(fù)電荷，減少上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力。分子之間的同性電荷相斥力。 分子生物學(xué)研究方法分子生物學(xué)研究方法 西北師大西北師大 生科院生科院126RN

8、ase、SDS與與KAc/飽和酚、氯仿：飽和酚、氯仿：SDS可使可使RNase成為成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀惯@些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。 7T-E緩沖液緩沖液:DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa7.2）和硼酸系統(tǒng)（）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等都可）等都可作作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子與的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子與Ca2產(chǎn)生產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀沉淀.8.Tri

9、s-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)）的緩沖系統(tǒng):不存在金屬離子的干擾作不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而系統(tǒng)，而TE緩緩沖液中的沖液中的EDTA更能穩(wěn)更能穩(wěn) 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院13二、核酸的凝膠電泳二、核酸的凝膠電泳 1.基本原理基本原理 2.瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 3.脈沖電場(chǎng)凝膠電泳脈沖電場(chǎng)凝膠電泳分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院141 原理原理電泳及遷移率電泳及遷移率核苷酸鏈為多聚帶電陰離子核苷酸鏈為多聚帶電陰離子無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)無反應(yīng)活性的

10、穩(wěn)定的介質(zhì)電泳遷移率電泳遷移率+分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院152 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳n瓊脂糖為瓊脂糖為線性多糖聚合物線性多糖聚合物，紅色海藻產(chǎn)物瓊脂，紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固，中提取而來。瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固，密度由濃度決定的。密度由濃度決定的。n分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān):瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠分辨分辨 范圍為范圍為0250kb之間之間.分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院16不同濃度瓊脂糖凝膠的分辨能力不同濃度瓊脂糖凝膠的分辨能力 凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度 分

11、離分離DNA片段的大小范圍（片段的大小范圍（bp） 0.3瓊脂糖 50 00010000.7瓊脂糖 20 00010001.4瓊脂糖 6 0003004.0瓊脂糖 100010010瓊脂糖 5002520瓊脂糖 501分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院17電泳槽結(jié)構(gòu)電泳槽結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院18電泳裝置電泳裝置分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院19常用的指示劑有常用的指示劑有溴酚蘭溴酚蘭和和二甲苯青二甲苯青及及銀染色銀染色. 指示劑指示劑溴酚蘭溴酚蘭在堿性液體中在堿性液體中 呈紫蘭色，在呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%

12、和和2%瓊脂糖凝膠電泳中，遷移率分別與瓊脂糖凝膠電泳中，遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和和0.15Kb的雙鏈線性的雙鏈線性DNA片段大致相同。片段大致相同。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院20溴化乙錠（溴化乙錠（EB）DNA：紫外光下紫外光下 紅色熒光紅色熒光二甲苯青二甲苯青:水溶液呈蘭色，在水溶液呈蘭色，在 1%和和1.4%瓊脂糖中瓊脂糖中遷移速率分別與遷移速率分別與2Kb和和1.6Kb的雙鏈線性的雙鏈線性DNA相似相似.指示劑一般與蔗糖、甘油組成指示劑一般與蔗糖、甘油組成載樣緩沖液載樣緩沖液. 增加樣增加樣 品密度品密度.在電泳中形成肉眼可見的指在電泳中形

13、成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測(cè)核示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置酸電泳的速度和位置.使樣品呈色，加樣操作更方便使樣品呈色，加樣操作更方便 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院21溴化乙錠染色溴化乙錠染色溴化乙錠溴化乙錠（ethidium bromide，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱EtBr）在一切可能的部位在一切可能的部位同同DNA分分子子結(jié)合，卻結(jié)合，卻不能同瓊脂糖凝膠或聚丙不能同瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠結(jié)合烯酰胺凝膠結(jié)合,并在并在300nm紫外光照紫外光照射下放射出橘紅色的光，可顯現(xiàn)凝膠射下放射出橘紅色的光，可顯現(xiàn)凝膠中中0.05ug的微量的微量DNA 方法：方法：加入凝膠中，凝膠浸泡加入凝膠

14、中，凝膠浸泡重要的特性：重要的特性：熒光強(qiáng)度同熒光強(qiáng)度同DNA片段的片段的大小或數(shù)量大小或數(shù)量成正比。成正比。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院22分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院23銀染銀染銀離子銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如還原劑如甲醛甲醛 使使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色黑褐色.主要主要用于用于聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳染色凝膠電泳染色. 也用于也用于瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠染色染色.其其靈靈敏度比敏度比EB高高200倍倍.但銀染色后，但銀染色后，

15、DNA不宜回收不宜回收 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院24LMP瓊脂糖回收瓊脂糖回收DNA分子分子LMP瓊脂糖：瓊脂糖：一種熔點(diǎn)為一種熔點(diǎn)為6265 的瓊脂衍生物，的瓊脂衍生物，熔解后，在熔解后，在37可保持液體狀態(tài)數(shù)小時(shí)，在可保持液體狀態(tài)數(shù)小時(shí)，在25可持續(xù)保持液體狀態(tài)約可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10分鐘。分鐘?；厥栈厥誅NA：將凝膠將凝膠65加熱，加入過量的酚加熱，加入過量的酚，離離心，上清液中便含有除去了瓊脂糖的心，上清液中便含有除去了瓊脂糖的DNA。另外，一旦另外，一旦LMP瓊脂糖已經(jīng)熔化，并保持瓊脂糖已經(jīng)熔化，并保持在在37下，就可直接下，就可直接進(jìn)行酶催反應(yīng)進(jìn)行酶催

16、反應(yīng)。據(jù)此，可以對(duì)電泳分離的。據(jù)此，可以對(duì)電泳分離的DNA酶切片段進(jìn)行第酶切片段進(jìn)行第二種酶切反應(yīng)。二種酶切反應(yīng)。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院25分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院26變性膠電泳變性膠電泳q方法方法q用途用途分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院27分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院283 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳脈沖電場(chǎng)凝膠電泳DNA大分子的分離大分子的分離：瓊脂糖凝膠不能分離大于：瓊脂糖凝膠不能分離大于750kb的的DNA。常規(guī)凝膠，超過一定大小范圍的所有的雙常規(guī)凝膠，超過一定大小范圍的所有的雙鏈鏈DNA分子

17、，都按相同速率遷移。分子，都按相同速率遷移。 1984，Schwartz 和和Cantor：脈沖電場(chǎng)凝：脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（膠電泳（pulsedfield gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱PFGE）技術(shù)，可分離整條染色體。技術(shù)，可分離整條染色體。大分子量大分子量DNA需更多次數(shù)更換構(gòu)型和方位，需更多次數(shù)更換構(gòu)型和方位，以便按新方向游動(dòng)。遷移速率慢，可分離以便按新方向游動(dòng)。遷移速率慢，可分離到到107bpDNA大分子。大分子。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院29“電泳電泳”思考題思考題v電泳的原理是什么電泳的原理是什么v請(qǐng)說出以下電泳用膠的區(qū)別：普通請(qǐng)說出以下電

18、泳用膠的區(qū)別：普通DNA分離、測(cè)序膠、分離、測(cè)序膠、Southern 雜交雜交v比較分子量相同的三種不同構(gòu)型的比較分子量相同的三種不同構(gòu)型的DNA（直鏈線形、閉合直鏈線形、閉合環(huán)形、開鏈環(huán)形）在同一電場(chǎng)中的電泳遷移率環(huán)形、開鏈環(huán)形）在同一電場(chǎng)中的電泳遷移率v比較溴化乙錠染色和銀染的區(qū)別比較溴化乙錠染色和銀染的區(qū)別v說明電泳技術(shù)在基因工程中的作用說明電泳技術(shù)在基因工程中的作用返回第二章分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院30三、三、 核酸分子雜交核酸分子雜交 1.Southern DNA印跡雜交印跡雜交 2.Northern RNA印跡雜交印跡雜交 3.Western印跡雜交印跡

19、雜交 4.菌落菌落(或噬菌斑或噬菌斑)雜交雜交 5.斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交返回第二章分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院311 Southern blot1 Southern blot根據(jù)根據(jù)毛細(xì)管作用毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段片段轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移并結(jié)合移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈標(biāo)記的單鏈DNA或或RNA探針探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由印跡雜交技術(shù)。由于它是由

20、ESouthern于于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫做年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫做Southern DNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院32Southern blotSouthern blot原理模式原理模式變變性性膠膠電電泳泳轉(zhuǎn)膜放射性探針雜交放射自顯影 回收DNA 漂洗分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院33Southern blotSouthern blot轉(zhuǎn)移裝置圖轉(zhuǎn)移裝置圖分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院34分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院35分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北

21、師大 生科院生科院36探針制備及標(biāo)記探針制備及標(biāo)記探針探針 - -單鏈探針：?jiǎn)捂溙结槪?末端標(biāo)記末端標(biāo)記lKlenow:標(biāo)記3端，補(bǔ)平和置換反應(yīng)lT4 polymerase:標(biāo)記3端 3-5外切活性強(qiáng)，特別適用于3突出末端lKinase:標(biāo)記5端 正反應(yīng) 3232P-ADP + 5-OHNNNN5P NNNNP-ADP + 5-OHNNNN5P NNNN 交換反應(yīng)：過量過量3232P-ADPP-ADP+ +5-5-p NNNN5p NNNN53232P NNNN 5P NNNN 5l末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記3DNA片段，Oligo,隨機(jī)DNAssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探針RNA探針，RNA

22、 polymerase分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院37DNA聚合酶法制備探針聚合酶法制備探針分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院38隨機(jī)引物法制備探針隨機(jī)引物法制備探針分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院391）. 生物素標(biāo)記核酸探針生物素標(biāo)記核酸探針Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。等。2）. 地高辛（地高辛（Dig）標(biāo)記核酸探針標(biāo)記核酸探針非放射性標(biāo)記探針非放射性標(biāo)記探針分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院40分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院

23、41分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院42分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院43分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院44分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院452 Northern blot2 Northern blot類似于類似于Southern blot,Southern blot,但用于檢測(cè)但用于檢測(cè)RNARNA的分子雜交技術(shù)，用的分子雜交技術(shù)，用于分析總于分析總RNARNA或或mRNAmRNAv電泳緩沖液電泳緩沖液 甲醛甲醛buf(5buf(5) ) 0.1mM MOPS(Ph 2.0) (3-(N- 0.1mM MO

24、PS(Ph 2.0) (3-(N-瑪琳代瑪琳代) )丙磺酸丙磺酸) ) 40 40 mMmM NaAcNaAc 5mM EDTA(pH 8.0) 5mM EDTA(pH 8.0) DEPC H DEPC H2 2O O 制膠制膠 甲醇（甲醇（MW 30.03MW 30.03）通常為通常為37%37%水溶液，水溶液，12.312.3M(pH4.0)M(pH4.0) 終濃度，終濃度，1 1bufbuf + 2.2M + 2.2M甲醇甲醇分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院46v 上上 樣樣 預(yù)處理 RNA （up to 30g）4.5l+5buf 2.0l 甲醛 3.5 l 甲酰胺

25、 10 l 65 15min loading buf 50%甘油，1mM EDTA（pH 8.0） 0.25% BPB 0.255 二甲苯 TFFv 電電 泳泳 loading之前，預(yù)電泳5min 5V/cm 電泳1-2hr之后，混合正負(fù)極電泳液分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院47v 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 膜膜 q預(yù)處理 DEPC H2O洗滌去除甲醛如果膠濃度10% 或 厚度0.5cm 或 底物2.5kb，需用0.05M NaOH處理20min，部分水解RNA無RNase H2O洗滌，20SSC浸泡45minq轉(zhuǎn)移，同Southern返回第二節(jié)返回第二節(jié)分子生物學(xué)分子生物學(xué) 西北師大西北師大 生科院生科院483 Western blot3 Western blot基本原理基本原理同其它blot方式，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，與Southern的關(guān)鍵區(qū)別在于探針性質(zhì)：抗體抗體的要求：抗體的要求：v 單克隆抗體 但并非都合適，由