考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)含量doc

1、考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）法）測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 掌握考馬斯亮藍(lán)染色法定量掌握考馬斯亮藍(lán)染色法定量測定蛋白質(zhì)的原理與方法。測定蛋白質(zhì)的原理與方法。 2. 熟練分光光度計(jì)的使用和熟練分光光度計(jì)的使用和操作方法。操作方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250測定蛋白質(zhì)含量屬于測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。染料結(jié)合法的一種。 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250在酸性溶液中呈棕在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在紅色，最大吸收峰在465nm；當(dāng)它與蛋白；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合成復(fù)合物時(shí)變?yōu)樗{(lán)色，質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合成復(fù)合

2、物時(shí)變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收峰移至其最大吸收峰移至595nm，而且消光系數(shù)，而且消光系數(shù)更大。更大?？捡R斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在下呈紅色，最大光吸收在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)色素結(jié)合物在合物在595nm波長下有最大波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。含量成正比。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250的的結(jié)合十分迅速，約結(jié)合十分迅速，約2min即可即可反應(yīng)完全，其復(fù)合物在反應(yīng)完全，其復(fù)合物在1h內(nèi)內(nèi)保持穩(wěn)定。保持穩(wěn)定?？捡R斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R250

3、與蛋白與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條所以可以用來對電泳條帶染色。帶染色。 在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) (11000g/ml）,蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在蛋白質(zhì)染料復(fù)合物在595nm處的光吸收與蛋白處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。 由于蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很由于蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度（最低檢出量為質(zhì)測定的靈敏度（最低檢出量為1g）。）。【器材與試劑】【器材與試劑】（一）器

4、材（一）器材 1. 可見光分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì) 2. 刻度移液管刻度移液管 3. 移液槍移液槍 （二）試劑（二）試劑 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考馬斯亮藍(lán)試劑考馬斯亮藍(lán)試劑 3. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液 （1mg /mL） 4. 待測蛋白質(zhì)溶液待測蛋白質(zhì)溶液 1.如黑板上表格操作如黑板上表格操作2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A595nm為縱坐為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.算出待測蛋白質(zhì)濃度？算出待測蛋白質(zhì)濃度？ 定義定義: 分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸分光光度法是利用物質(zhì)所特有的

5、吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù)。收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的分析檢測技術(shù)。 特點(diǎn)特點(diǎn): 靈敏、精確、快速和簡便，在復(fù)雜組靈敏、精確、快速和簡便，在復(fù)雜組分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測出其中所含的分系統(tǒng)中，不需要分離，即能檢測出其中所含的極少量物質(zhì)。極少量物質(zhì)。 應(yīng)用應(yīng)用: 生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法之一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定一，廣泛用于糖，蛋白質(zhì)，核酸，酶等的快速定量檢測。量檢測。 分光光度計(jì)的分類分光光度計(jì)的分類紅外分光光度計(jì)紅外分光光度計(jì):可見光分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì):紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì):測定波長范圍為測定波長

6、范圍為大于大于760 nm的的紅外光區(qū)紅外光區(qū) 測定波長范圍為測定波長范圍為400 760 nm的的可見光區(qū)可見光區(qū)測定波長范圍為測定波長范圍為200400 nm的的紫外光區(qū)紫外光區(qū)可見光譜可見光譜可見光范圍內(nèi)波長和顏色的關(guān)系可見光范圍內(nèi)波長和顏色的關(guān)系分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu) 無論哪一類分光光度計(jì)都包括：光源、單無論哪一類分光光度計(jì)都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示度計(jì)各部件的次序如圖所示: 入射光入射光強(qiáng)度強(qiáng)度 Io透射光透射光強(qiáng)度強(qiáng)度 I樣品池樣品池 檢測器檢測器及儀表及儀表單色器單色器光源

7、光源光照射到物質(zhì)上，物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)決定光照射到物質(zhì)上，物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)決定哪些特定波長的光被吸收。這一現(xiàn)象符哪些特定波長的光被吸收。這一現(xiàn)象符合符合朗伯比耳定律。合符合朗伯比耳定律。入射光強(qiáng)度入射光強(qiáng)度 Io樣品濃度樣品濃度c光程光程 b透射光強(qiáng)度透射光強(qiáng)度 I當(dāng)一束平行單色光當(dāng)一束平行單色光(I0)照射有色溶液時(shí)，光的一部照射有色溶液時(shí)，光的一部分被吸收，一部分透過溶液分被吸收，一部分透過溶液(I)朗伯朗伯比爾定律比爾定律: A=lg(1/T)=Kbc A為吸光度為吸光度;T為透光度為透光度,是透射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度（是透射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度（I/I0);c為吸光物質(zhì)的濃度為吸光物質(zhì)的濃度; b為吸收層厚度為吸收層厚度(光程）光程）. 物理意義物理意義當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一吸光物質(zhì)時(shí)當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一吸光物質(zhì)時(shí),