α和β地貧苯丙酮尿癥遺傳性耳聾

1、Mediterranean anemia1.1 概述遺傳性貧血血紅蛋白的珠蛋白鏈（、鏈）的一種或幾種受到部分或完全抑制地貧分為、等4種類型以和地中海貧血較為常見*血紅蛋白分子是由四分子的珠蛋白和四分子亞鐵血紅素組成，珠蛋白約占96%。 *依發(fā)病機(jī)制和病因分類貧血血紅素異常紅細(xì)胞膜異常珠蛋白異常遺傳性紅細(xì)胞酶缺乏紅細(xì)胞異常紅細(xì)胞胞外環(huán)境異常免疫性溶血血管性溶血物理、化學(xué)、生物因素溶血性貧血失血性貧血造血原料異常造血調(diào)節(jié)異常造血細(xì)胞異常紅細(xì)胞生成減少性貧血珠蛋白異常合成量異常機(jī)構(gòu)異常異常血紅蛋白病廣泛分布于世界許多地區(qū)，東南亞即為高發(fā)區(qū)之一。我國、四川多見，長江以南各省區(qū)有散發(fā)病例，北方則少見。開

2、展人群普查和遺傳咨詢、做好婚前指導(dǎo)以避免地貧基因攜帶者之間聯(lián)姻；采用基因分析法進(jìn)行，避免重型地貧患者出生。輕型地貧無需特殊治療。中間型和重型地貧：一般治療、輸血和鐵治療、鐵螯合劑、脾切除、基因活化治療。1.2 病因珠蛋白的肽鏈、鏈基因的或造成編碼的肽鏈的合成障礙，導(dǎo)致血紅蛋白的組分改變地中海貧血是由珠蛋白基因的缺失和基因的點(diǎn)突變所致；地中海貧血是由珠蛋白基因的點(diǎn)突變和基因的缺失所致。正常人自父母雙方各繼承2個(gè)珠蛋白基因（/）合成足夠的珠蛋白鏈，各繼承1個(gè)珠蛋白基因合成足夠的珠蛋白鏈。地中海貧血人類珠蛋白基因簇位于16pter-p13.3（16號染色體短臂末端到短臂13區(qū)3帶 ）。地貧大多是由于

3、珠蛋白基因的缺失所致，少數(shù)由基因點(diǎn)突變造成。缺失型-地貧：占-地貧的95%以上，由基因缺失引起；非缺失型-地貧：占-地貧的約5%，由基因點(diǎn)突變引起。缺失型地中海貧血標(biāo)準(zhǔn)型-1或稱東南亞型（-SEA）標(biāo)準(zhǔn)型-2靜止型HbH病Hb Barts胎兒水腫綜合征點(diǎn)突變型地中海貧血一般只發(fā)生于1個(gè)基因上，占地貧的5%，目前至少發(fā)現(xiàn)68種。在中國南方地區(qū)主要見兩種：Hb Constant Spring (CS), Hb Quong Sze(QS)，點(diǎn)突變型地貧表型較缺失型地貧嚴(yán)重點(diǎn)突變大多位于功能較強(qiáng)的2基因2基因發(fā)生突變比缺失時(shí)鏈產(chǎn)量明顯減少點(diǎn)突變產(chǎn)生的某些異常血紅蛋白可形成不溶物直接損傷紅細(xì)胞有些非缺失

4、型-地貧純合子（ QS / QS 、CS/CS、 QS /CS）可以表現(xiàn)為HbH病；有些非缺失型HbH?。?-SEA/ QS 、-SEA/CS）的臨床表現(xiàn)比缺失型HbH?。?SEA/3.7、 -SEA/4.2 ）更為嚴(yán)重。地中海貧血人類珠蛋白基因簇位于11p15.5。地中海貧血（簡稱地貧）的發(fā)生主要是由于基因的點(diǎn)突變，少數(shù)因基因缺失。地貧的發(fā)生的分子病理相當(dāng)復(fù)雜，目前在全世界已發(fā)現(xiàn)了近200多種突變類型。中國人群中共發(fā)現(xiàn)約48余種，其中常見的6種占90%以上。輕型-地貧： 2個(gè)基因中有1個(gè)基因突變 基因型： N/T重型-地貧： 2個(gè)基因中有2個(gè)基因突變 基因型： T/T1.3 診斷方法臨床特點(diǎn)

5、、實(shí)驗(yàn)室檢查，結(jié)合陽性家族史，一般可作出診斷。有條件時(shí)可作基因診斷。少見類型和各種類型重疊型，進(jìn)行遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢查才能確診。篩查步驟：MCV(erythrocyte mean corpuscular volume)、MCH(mean corpuscular hemoglobin) 等Hb分析（HbA2/Hb?）血紅蛋白A2增多見于輕型珠蛋白生成障礙性貧血基因分析臨床上的基因檢查（如PCR-RDB）只能檢測已知突變的類型，有漏診可能,所以不能單純只做基因檢測。1、非侵入性產(chǎn)前診斷：為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法，最早于孕12周進(jìn)行。先用超聲檢查胎兒是否貧血。心胸比例（孕12-17周0.5；孕18-2

6、1周0.52）、大腦中動脈血流（MCV-PSV1.5MOM提示胎兒重度貧血）、胸腔腹腔積液、胎盤厚度、羊水過多等若提示胎兒貧血,再進(jìn)行侵入性檢查；若無提示胎兒貧血，不需要侵入性檢查。2、侵入性產(chǎn)前診斷：同地貧產(chǎn)前診斷方法侵入性產(chǎn)前診斷：絨毛穿刺術(shù)：10-14周，5-7天出診斷報(bào)告羊膜腔穿刺術(shù)：16-23周，5-7天出診斷報(bào)告臍靜脈穿刺術(shù)：23周后， 5-7天出診斷報(bào)告1.4 基因分析在中國地區(qū)普遍發(fā)生的-地貧分別由-SEA、- 3.7和- 4.2位點(diǎn)缺失引起的。根據(jù)這三種缺失型的缺失斷裂點(diǎn)，設(shè)計(jì)了三對引物分別檢測-3.7、-4.2和-SEA，只有當(dāng)樣品發(fā)生缺失時(shí)，相應(yīng)的上下游引物距離靠近，擴(kuò)增

7、出相應(yīng)條帶。將正常內(nèi)對照（用表示）設(shè)計(jì)在三種共同缺失的位置，以使當(dāng)發(fā)生任一種缺失時(shí)正常對照都不擴(kuò)增。四對引物要在同一管擴(kuò)增并通過電泳來判斷結(jié)果，設(shè)計(jì)引物位置時(shí)各PCR產(chǎn)物的條帶大小要有區(qū)別，最終-3.7、-4.2和-SEA的擴(kuò)增條帶分別約為：2.0kbp、1.8kbp、1.6kbp和1.3kbp。在中國人群中還存在的 - 珠蛋白基因點(diǎn)突變（T）類型，這是導(dǎo)致臨床地貧漏診的主要原因之一。作為地貧 3種缺失型檢測的補(bǔ)充，對懷疑地貧有漏診的患者進(jìn)行CS、QS和WS突變的診斷，確定具體的基因突變類型。缺失檢測結(jié)果缺失檢測結(jié)果T檢測結(jié)果膜條圖片檢測結(jié)果膜條圖片樣品基因型樣品基因型/三個(gè)位點(diǎn)N顯色，M不顯

8、色/-/-/-SEA/-SEA/三個(gè)位點(diǎn)N顯色，CSM顯色CS/一個(gè)CSM顯色,QSN,WSN顯色CS/CS/-SEACS/-SEA/-CS/-常見基因檢測結(jié)果的判定(以CS突變?yōu)槔?PCR體外擴(kuò)增結(jié)合DNA芯片反向點(diǎn)雜交技術(shù)，檢測人全血樣本中-珠蛋白基因上17個(gè)位點(diǎn)的18種突變。珠蛋白基因有三個(gè)外顯子，地貧突變的高頻發(fā)生區(qū)主要在從基因前調(diào)控區(qū)到第二個(gè)內(nèi)含子之間約1200bp內(nèi)，針對中國人常見的17個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩對引物，兩擴(kuò)增片段約為650bp和470bp，這兩對引物的擴(kuò)增片段包含了17個(gè)位點(diǎn)的基因信息。針對17個(gè)突變位點(diǎn)共設(shè)計(jì)了17個(gè)突變探針。同時(shí)設(shè)計(jì)了7個(gè)與突變探針（12個(gè)）對應(yīng)關(guān)系的正常

9、對照探針。還有5個(gè)少見的突變類型未設(shè)計(jì)正常對照（只能提供是否突變）。 定性、確定具體基因突變型（41-42M、654M、28M、71-72M、17M、EM、31M、IVS1-1M、27/28M、43M、32M、29M、30M、14-15M、CAP、IntM、IVS1-5M）*紅色為少見突變類型2.苯丙酮尿癥phenylketonuria , PKU2.1 概述一種常見的遺傳，常染色體隱性遺傳。發(fā)病率約為1/10 000，臨床表現(xiàn)不均一，主要臨床特征為智力低下、精神神經(jīng)癥狀、濕疹、皮膚抓痕征及色素脫失和鼠氣味等，最終成為癡呆。是數(shù)千種遺傳病中，少數(shù)幾種可以通過新生兒篩查，早期診斷治療，并可完全避

10、免智殘的疾病。因此,對新生兒早期進(jìn)行篩查,檢測血清(漿) 中Phe和Tyr的濃度兩個(gè)主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對診斷PKU具有重要意義。2.2 病因苯丙氨酸（ phenylalanine , Phe ）代謝途徑中的，苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成為酪氨酸，導(dǎo)致苯丙氨酸及其酮酸蓄積，并從尿中大量排出。苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase , PAH)先天性缺陷或突變四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin ,BH4) 輔因子的合成和BH4的再循環(huán)障礙由PAH缺乏導(dǎo)致者占97%-99%，與四氫生物蝶呤(BH4)合成缺陷有關(guān)者占1%-3%，并被稱為非經(jīng)典型PKU。其特征是人體苯丙氨

11、酸代謝異常，導(dǎo)致高苯丙氨酸血癥。GTP-CH：GTP cyclohydrolase，三磷酸鳥苷酸環(huán)化水解酶6-PTS：PTPS,6-Pyruvoyl-tetrahydropterin synthase，6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶DHPR： dihydropteridine reductase ，二氫生物蝶呤還原酶苯丙氨酸是人體必需的氨基酸之一。正常人每日需要的攝入量約為200-500mg，其中1/3供合成蛋白，2/3則通過肝細(xì)胞中苯丙氨酸羥化酶（PAH）的轉(zhuǎn)化為酪氨酸，以合成甲狀腺素、腎上腺素和黑色素等。2.3 診斷方法1新生兒期的診斷：依靠新生兒疾病篩查，陽性兒進(jìn)行復(fù)查，并用定量法（氨基酸分析

12、、高效液相法、熒光法）精確測定。2新生兒以后的診斷：根據(jù)臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢查。3實(shí)驗(yàn)室檢查：尿液檢查、熒光免疫法測定血中的Phe和Tyr、苯丙氨酸負(fù)荷實(shí)驗(yàn)、頭顱影像檢查：核磁共振（MRI）、尿喋呤分析。應(yīng)用高壓液相層析（PHLC）測定尿液中新蝶呤和生物蝶呤的含量，用以鑒別各型PKU。典典型型PKU：尿中蝶呤總排出量增高，新蝶呤與生物蝶呤比值正常。BH4缺乏癥：缺乏癥：DHPR缺乏：蝶呤總排出量增加，四氫生物蝶呤減少；6-PTS缺乏：新蝶呤排出量增加，其與生物蝶呤的比值增高；GTP-CH缺乏：蝶呤總排出量減少。圖 正常人、攜帶者和患者的苯丙氨酸負(fù)荷試驗(yàn)的結(jié)果Load test of phenyl

13、ananine in normal man, carrier and patient 1.菌環(huán)直徑：菌環(huán)直徑：提供苯丙氨酸可使在含抑制劑培養(yǎng)基上的枯草桿菌恢復(fù)生長，且生長環(huán)的直徑與苯丙氨酸的含量呈正比。與標(biāo)準(zhǔn)品比較菌環(huán)直徑，可得出樣品中苯丙氨酸的含量。 2. OD：苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸鹽，此反應(yīng)使存在于反應(yīng)混合物中的輔酶NAD+再生。產(chǎn)生的NADH 使加入的黃色Tetrazalium 鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成紫色物質(zhì)Formazane，OD570nm值與病人樣本中的苯丙氨酸濃度成正比。3. 熒光熒光：濾紙片上干燥血標(biāo)本的苯丙氨酸的一種化學(xué)方法定量檢測。從濾紙片上干燥

14、血標(biāo)本中洗脫出苯丙氨酸同印三酮形成一種熒光化合物。用熒光讀數(shù)儀讀數(shù)。2.4 基因分析PAH基因定位于12號染色體的長臂上，即12q22-q24.1。PAH基因除了缺失突變外，大多是點(diǎn)突變。迄今已發(fā)現(xiàn)430多種突變(在中國人中也已確定44種突變)，突變大多在外顯子區(qū)， 60%是錯(cuò)義突變。由于尚有30的PKU患者的基因突變類型還不清楚，因此間接診斷成為對這部分病例進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷的主要手段。PCR-RFLP、PCR-STR、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-PASA70%PKU的基因突變已被闡明，直接檢測PAH基因中的點(diǎn)突變是目前對PKU進(jìn)行基因診斷和產(chǎn)前診斷的主要途徑。采用PCR

15、/ASO(allele-specific oligonucleotide) 探針雜交法，目前中國人PKU常見的突變基因類型有7種，因此合成和應(yīng)用7組ASO探針可以鑒定出大多數(shù)PKU患者的基因突變類型。分別用正常序列寡聚核苷酸探針或突變序列的寡聚核苷酸與PCR產(chǎn)物雜交，正常純合子應(yīng)僅與正常序列探針雜交，PKU患者僅與突變序列探針雜交，而雜合子則與兩者均雜交。由于PKU存在遺傳異質(zhì)性，即致病突變有許多種，以某探針進(jìn)行篩查后，對可能存在的未知突變基因要進(jìn)一步分析。Hereditary Hearing Impairment3.1 概述基因和染色體異常所致的耳聾在每1000個(gè)新生兒中就有一位患有先天性耳

16、聾，其中60%以上是由遺傳因素引起的，遺傳性聾的群體發(fā)病率已超過27/1000，在所有耳聾病人中，遺傳性聾約占50%。遺傳性聾分為綜合征性遺傳性聾及非綜合征性遺傳性聾兩大類。前者指除了耳聾以外，同時(shí)存在眼、骨、腎、皮膚等部位的病變，這類耳聾占遺傳性聾的30%；后者只出現(xiàn)耳聾的癥狀，在遺傳性聾中占70%。3.2 病因父母的（包括染色體及位于其中的基因）而引起的耳聾，并且在于孫后代中以一定數(shù)量出現(xiàn)。常見的遺傳性耳聾有以下幾種：(1)常染色體隱性遺傳性聾：隱性遺傳性聾到目前為止占單基因突變的80。(2)常染色體顯性遺傳性聾：占遺傳性聾的10%-20%。(3)性連鎖遺傳致聾基因位于x染色體上，隨x染色

17、體傳遞。此類耳聾占基因性聾的1%-2% ，包括隱性遺傳和顯性遺傳。(4)線粒體基因突變發(fā)病率較低，呈母系遺傳。3.3 診斷方法想要明確耳聾是不是遺傳性耳聾，就要進(jìn)行。傳統(tǒng)的酶切，測序等方法不僅耗時(shí)長，而且一次只能檢測一個(gè)基因，也就是說除非能夠確定到底是由哪個(gè)基因?qū)е露@，否則檢測的費(fèi)用是十分昂貴且費(fèi)時(shí)的。但隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，基因檢測的技術(shù)也出現(xiàn)了突飛猛進(jìn)，基因芯片技術(shù)就是針對快速檢測而出現(xiàn)的技術(shù)。用特異性擴(kuò)增引物，結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析方法，檢測DNA樣本中線粒體基因1555位點(diǎn)的突變情況。DNA提取 PCR擴(kuò)增（PCR儀）酶切電泳（電泳儀）結(jié)果判定（凝膠成像儀）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為113bp，正常DNA經(jīng)Hae III酶切后產(chǎn)生111bp和2bp片段，突變個(gè)體（線粒體DNA 1555