秀麗隱桿線蟲(chóng)

1、分類號(hào) 編號(hào)煙 臺(tái) 大 學(xué)畢 業(yè) 論 文利用秀麗隱桿線蟲(chóng)篩選抗白色念珠菌活性物質(zhì)Screening anti-Candida albicans substances using Caenorhabditis elegans利用秀麗隱桿線蟲(chóng)篩選抗白色念珠菌活性物質(zhì)摘要：以秀麗隱桿線蟲(chóng)作為模型生物進(jìn)行抗菌物質(zhì)篩選。用白色念珠菌感染線蟲(chóng)后，采用不同濃度的已知抗菌藥物治療，觀察線蟲(chóng)存活情況，確定合適用藥濃度；采用微擬球藻提取物對(duì)白色念珠菌感染線蟲(chóng)治療，觀察線蟲(chóng)存活情況，與已知抗菌藥物作用效果對(duì)比，從而篩選出可用于治療白色念珠菌活性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加1020mg/L的氟康唑?qū)Ω腥景咨钪榫男沱愲[桿線

2、蟲(chóng)治療效果較好，在一定劑量范圍內(nèi)，治療效果和劑量成線性關(guān)聯(lián)；微擬球藻提取物不具備抗菌活性。關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲(chóng)；白色念珠菌；抗菌物質(zhì)Abstract: In the study, Caenorhabditis elegans were used as model organism to screen antibacterial agents. C.elegans were infected by Candida albicans and treated by different concentrations of antibacterial agents which had been know

3、n and extracts from Nannochloropsis OZ-1, observating the survival situation and comparing the effects of the two antibacterial agents, thus, the bioactive substance could be screened which cured the Candida albicans. The result showed that Candida albicans could be treated by 1020 mg/L Fluconazole,

4、 moreover within the scope of the dose, treatment effect and the dose of a linear correlation. And the results showed that extracts from Nannochloropsis OZ-1 did not have antibacterial activity.Key words: C.elegans；Candida albicans；Antibacterial substances目錄1 文獻(xiàn)綜述11.1 秀麗隱桿線蟲(chóng)11.2 秀麗隱桿線蟲(chóng)研究進(jìn)展11.2.1 環(huán)境毒

5、理學(xué)的研究21.2.2 程序性細(xì)胞死亡的研究21.2.3 秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型的建立21.2.4 抗菌物質(zhì)作用機(jī)制的研究21.2.5 病菌致病機(jī)制和線蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究31.3 白色念珠菌31.4 抗菌物質(zhì)的篩選41.5 實(shí)驗(yàn)研究意義52 材料和方法62.1 材料62.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品62.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器62.1.3 線蟲(chóng)和菌株72.1.4 培養(yǎng)基72.1.5 試劑72.2 方法72.2.1 線蟲(chóng)培養(yǎng)和保存72.2.2 線蟲(chóng)同步化82.2.3 線蟲(chóng)真菌感染82.2.4 線蟲(chóng)抗感染治療82.2.5 觀察83 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析93.1 氟康唑用藥濃度的選擇93.2 篩選可用于治療白色念珠菌的微擬球藻提

6、取物94 結(jié)論12致謝13參考文獻(xiàn)141 文獻(xiàn)綜述1.1 秀麗隱桿線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)1（Caenorhabditis elegans）（圖1）是一種多細(xì)胞真核生物，個(gè)體很小，以細(xì)菌為食，可獨(dú)立生存在溫度恒定環(huán)境中，對(duì)人、動(dòng)植物沒(méi)有危害。成蟲(chóng)1 mm左右，通體透明，在普通顯微鏡下可觀察。秀麗隱桿線蟲(chóng)有很少的雄性個(gè)體，大多數(shù)為雌雄同體。秀麗隱桿線蟲(chóng)生命周期很短，從卵到成蟲(chóng)需要3.5 d，平均壽命約為23周2。雌雄同體個(gè)體產(chǎn)卵孵化后，會(huì)經(jīng)歷四個(gè)幼蟲(chóng)期（L1-L4），L4期生有精子，并在成蟲(chóng)期產(chǎn)卵。雄性也能使雌雄同體受精，且雌雄同體優(yōu)先選擇雄性的精子。當(dāng)族群擁擠或食物不足時(shí)，秀麗隱桿線蟲(chóng)會(huì)進(jìn)入dauer

7、幼蟲(chóng)期，dauer能對(duì)抗逆環(huán)境，而且不會(huì)老化。秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組測(cè)序完成，是第一個(gè)完成的多細(xì)胞動(dòng)物基因序列測(cè)定的動(dòng)物，它的基因組序列40%以上與人類同源。秀麗隱桿線蟲(chóng)有5對(duì)常染色體和1對(duì)性染色體，其遺傳背景清晰。圖1 秀麗隱桿線蟲(chóng)Fig.1 Caenorhabditis elegans1.2 秀麗隱桿線蟲(chóng)研究進(jìn)展秀麗隱桿線蟲(chóng)最開(kāi)始被用于研究發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)，隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展，對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的廣泛研究，人們發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)器官發(fā)育及細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵性的基因，也證明了這些基因同樣存在于高等動(dòng)物中。這些研究開(kāi)辟了研究人體細(xì)胞的分化及演變的道路，有利于研究很多疾病的發(fā)病機(jī)制。Brenner1選取了秀

8、麗隱桿線蟲(chóng)線蟲(chóng)作為生物模型，開(kāi)啟了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。秀麗隱桿線蟲(chóng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生命周期短、基因測(cè)序完成等優(yōu)點(diǎn)，使其作為一種模型生物得到廣泛應(yīng)用。秀麗隱桿線蟲(chóng)作為優(yōu)秀的模型生物不僅用于抗菌藥物的體內(nèi)研究，還被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、基因組學(xué)、環(huán)境生物學(xué)、人類疾病模型的復(fù)制和干預(yù)。1.2.1 環(huán)境毒理學(xué)的研究隨著環(huán)境污染的嚴(yán)重，線蟲(chóng)開(kāi)始運(yùn)用于環(huán)境毒理學(xué)的研究，環(huán)境中的重金屬、電輻射等毒素對(duì)人類的健康狀況產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅，線蟲(chóng)可以用來(lái)研究它們的作用機(jī)制，評(píng)估其危害性。線蟲(chóng)模型如果能模擬毒素的作用機(jī)制，那么線蟲(chóng)將更加廣泛的用于環(huán)境毒理學(xué)的研究3。1.2.2 程序性細(xì)胞死亡的研究秀麗隱桿線蟲(chóng)為程序性細(xì)胞死亡研究奠

9、定了基礎(chǔ)。Horvitz等4在秀麗隱桿線蟲(chóng)身上發(fā)現(xiàn)了基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡的存在，他們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)基因ced-3和ced-4，認(rèn)為它們是發(fā)生細(xì)胞死亡的前提。后來(lái)，他們又發(fā)現(xiàn)了ced-9與ced-3和ced-4相互作用來(lái)阻止細(xì)胞死亡。對(duì)于程序性的細(xì)胞死亡的認(rèn)識(shí)，使我們對(duì)一些疾病的發(fā)病機(jī)制有了新的理解，調(diào)控程序性的細(xì)胞死亡的功能性缺陷導(dǎo)致的疾病大體分為兩種，一種是由細(xì)胞病理性丟失過(guò)多，另一種是清除有害細(xì)胞的機(jī)能受損。對(duì)疾病本身的認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)為疾病的治療提供了思路，科學(xué)家現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)始利用程序性細(xì)胞死亡的機(jī)理來(lái)研究治療惡性腫瘤的新辦法5。1.2.3 秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型的建立研究細(xì)菌致病機(jī)制是用線蟲(chóng)模型

10、研發(fā)抗菌藥物的基礎(chǔ)。線蟲(chóng)是一種簡(jiǎn)單的模型生物，可以被很多病菌感染。周雨蒙等6建立了線蟲(chóng)耐藥銅綠假單胞菌感染模型，在用抗生素治療線蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可以排除毒性高、體內(nèi)外相關(guān)性差的化合物，此模型為篩選得到具有良好體內(nèi)效果的新型抗菌化合物或生物活性物質(zhì)打下了基礎(chǔ)。陳麗紅等7建立了銅綠假單胞菌線蟲(chóng)感染模型，確立了合適的銅綠假單胞菌培養(yǎng)時(shí)間和線蟲(chóng)的感染時(shí)間，并研究了多種抗生素對(duì)線蟲(chóng)的存活時(shí)間的影響，可以用于未知物質(zhì)用量相當(dāng)于等狀態(tài)下抗生素用量的計(jì)算。1.2.4 抗菌物質(zhì)作用機(jī)制的研究細(xì)菌的毒力的減弱是研發(fā)抗菌物質(zhì)的一個(gè)靶點(diǎn)，Ho等8通過(guò)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)研究發(fā)現(xiàn)，雷洛昔芬可以強(qiáng)烈的抑制銅綠假單胞菌的毒力的

11、產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)使用此藥物對(duì)野生型銅綠假單胞菌進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)生的綠膿菌素水平明顯下降。這些結(jié)果表明雷洛昔芬可能會(huì)被用于開(kāi)發(fā)新型的療法以此來(lái)靶向治療銅綠假單胞菌的感染?，F(xiàn)在關(guān)于銅綠假單胞菌中的拮抗細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究是一大熱點(diǎn)。以抑制QS系統(tǒng)為靶標(biāo)的分子抑制物，可用于研發(fā)新的抗菌物質(zhì)。Sarabhai等9利用秀麗隱桿線蟲(chóng)模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)訶子的果實(shí)中的鞣花酸衍生物具有拮抗QS系統(tǒng)，阻斷了細(xì)菌細(xì)胞間的信號(hào)傳遞作用。它的機(jī)制是，減少了QS系統(tǒng)中兩個(gè)重要的基因的表達(dá)，同時(shí)減弱了革蘭氏陰性菌的信號(hào)分子AHL的表達(dá)，最后減弱了野生型銅綠假單胞菌的毒力并增加了它的生物膜對(duì)妥布霉素的敏感性。1.2.5 病菌致

12、病機(jī)制和線蟲(chóng)免疫機(jī)制的研究不同的病菌對(duì)線蟲(chóng)的的致病機(jī)制并不一樣，線蟲(chóng)自身也具有免疫機(jī)制。目前發(fā)現(xiàn)，可以感染線蟲(chóng)的病菌都是通過(guò)生理途徑進(jìn)行感染的。Irazoqui等10研究了銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌感染線蟲(chóng)的致病機(jī)制。銅綠假單胞菌侵占線蟲(chóng)腸道，產(chǎn)生與毒力因子有關(guān)的囊泡，在腸道細(xì)胞累積高電子密度生物被膜樣物質(zhì)，使腸道細(xì)胞變異。而金黃色葡萄球菌迅速感染細(xì)胞，破壞腸道絨毛，溶解線蟲(chóng)細(xì)胞。金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)熱滅后仍可以感染線蟲(chóng)，這是因?yàn)槠淇梢苑置谟腥苎钚缘臒岫玖σ蜃?。McEwan等11研究出銅綠假單胞菌會(huì)引起秀麗隱桿線蟲(chóng)腸道的天然免疫力。線蟲(chóng)沒(méi)有專門(mén)免疫細(xì)胞，線蟲(chóng)腸道上皮細(xì)胞充當(dāng)防御系統(tǒng)，當(dāng)銅綠假

13、單胞菌積累在線蟲(chóng)腸道處，會(huì)增加線蟲(chóng)的機(jī)體損傷或抗微生物相關(guān)基因的表達(dá)量。ToxA（外毒素A）是銅綠假單胞菌所表達(dá)的一種細(xì)菌毒素，線蟲(chóng)感染了銅綠假單胞菌后，ToxA可以抑制線蟲(chóng)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，線蟲(chóng)通過(guò)識(shí)別ToxA激活體內(nèi)免疫基因的表達(dá)來(lái)抵抗銅綠假單胞菌的感染。1.3 白色念珠菌白色念珠菌（Candida albicans）（圖2）又稱白假絲酵母菌，是一種真菌，廣泛的存在于自然界，也存在于人體的口腔、上呼吸道等地，在正常機(jī)體中一般數(shù)量較少，不會(huì)引起疾病，是一種條件致病菌。白色念珠菌細(xì)胞呈圓形或卵圓形，直徑36 um，革蘭染色為陽(yáng)性，出芽方式繁殖，真菌細(xì)胞出芽生成假菌絲，假菌絲長(zhǎng)短不一，假菌絲收縮

14、斷裂又成為芽生的菌絲。在適宜的培養(yǎng)基上芽生孢子及假菌絲生長(zhǎng)，在假菌絲間其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌在沙保氏培養(yǎng)基上呈乳白色偶見(jiàn)淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)后則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺。白色念珠菌感染和致病機(jī)制有附著、發(fā)芽、蛋白酶、菌落轉(zhuǎn)換，可以侵犯人體許多部位，如皮膚、黏膜等，會(huì)引起皮膚念珠菌病、黏膜念珠菌病、內(nèi)臟念珠菌病。最早用于治療酵母菌感染的特異性活性藥物是多霉菌素，它是上世紀(jì)中期分離的一種聚烯類抗生素，此后又有很多抗真菌藥物被研發(fā)出來(lái)，氟康唑是一種常用的抗白色念珠菌藥物，抗菌譜較廣，其機(jī)制主要為高度選擇性干擾真菌的細(xì)胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細(xì)胞膜

15、上麥角固醇的生物合成，達(dá)到抑菌效果。 圖2 白色念珠菌Fig. 2 Candida albicans 1.4 抗菌物質(zhì)的篩選抗生素的廣泛應(yīng)用，使越來(lái)越多的病菌具有了耐藥性，而新型的抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)時(shí)間變的更長(zhǎng)，新型的抗菌物質(zhì)的研發(fā)進(jìn)入了瓶頸，開(kāi)發(fā)新型的抗菌物質(zhì)成為一個(gè)非常重要的任務(wù)。體外抗菌實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，但存在一些問(wèn)題，為走出這種困境可以通過(guò)活體生物感染模型來(lái)解決。傳統(tǒng)的動(dòng)物模型耗時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)高、操作復(fù)雜，具有很多缺點(diǎn)，而線蟲(chóng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生命周期短、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，另外其基因組序列40%以上與人類同源，許多基因和生物機(jī)制方面的高保守性，使線蟲(chóng)成為體內(nèi)藥物篩選的優(yōu)秀模型。它可避免小白鼠模型的高成本

16、、時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，又可以提供相對(duì)完整的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停虼丝梢院艽蟪潭冉档退幬锖Y選的成本，適用于大規(guī)模的藥物篩選12。Moy等13建立了糞腸球菌感染的秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)抗感染物質(zhì)篩選模型。他們?cè)?6孔板上進(jìn)行篩選，篩選了1000多種天然產(chǎn)物還有6000余種合成化合物，篩選發(fā)現(xiàn)9種提取物和16種化合物可以使被糞腸球菌感染的線蟲(chóng)的壽命延長(zhǎng)。他們雖然利用線蟲(chóng)活體篩選抗菌物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法很先進(jìn)，但是也有很多缺點(diǎn)，有很多人工操作需要重復(fù)進(jìn)行，還需要通過(guò)顯微鏡觀=觀察判斷線蟲(chóng)死亡狀況，比較耗費(fèi)人力和時(shí)間。隨后，他們對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)，建立了全自動(dòng)化和更微型化的384孔板采集分析的高通量篩選系統(tǒng)。他們采用這個(gè)系統(tǒng)篩

17、選了37000個(gè)天然提取物和化合物，發(fā)現(xiàn)了28種沒(méi)有被報(bào)道過(guò)的具有抗菌活性的物質(zhì)14。Okoli等15建立了線蟲(chóng)白色念珠菌感染模型的高通量篩選抗真菌物質(zhì)的系統(tǒng)。他們用這個(gè)系統(tǒng)篩選了1900多種生物活性化合物和1280余種小分子合成化合物，篩選出了19種化合物具有抗真菌活性。Breger等16建立了白色念珠菌秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型，篩選了1200余種已知藥理活性的化合物，他們發(fā)現(xiàn)了15個(gè)化合物能延長(zhǎng)被感染的秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命，而且可以抑制白色念珠菌在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)形成假菌絲。用白色念珠菌秀麗隱桿線蟲(chóng)模型篩選發(fā)現(xiàn)的抗真菌藥物在結(jié)構(gòu)上和現(xiàn)在的抗真菌藥物不具有相似性，可能存在不同作用機(jī)制，這為發(fā)現(xiàn)新型

18、的復(fù)合型抗真菌藥物指明了方向。楊再昌等17采用金黃色葡萄球菌秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型、銅綠假單胞菌秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型，篩選了43種中草藥的體內(nèi)抗菌療效，發(fā)現(xiàn)8種中草藥具有體內(nèi)抗菌作用。對(duì)9種提取物進(jìn)行體外抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在1600 ug/ml時(shí)，除黃連外，其余8種提取物無(wú)抗菌活性，但是濃度低于1600 ug/ml時(shí)對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)生保護(hù)作用。利用秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型進(jìn)行抗感染物質(zhì)篩選具有體外篩選不具備優(yōu)勢(shì)，它可以發(fā)現(xiàn)體外沒(méi)有抗菌活性但體內(nèi)有活性的物質(zhì)，以及一些新型抗感染機(jī)制的化合物，還可以篩選去除有毒化合物和體內(nèi)無(wú)效的化合物18。1.5 實(shí)驗(yàn)研究意義秀麗隱桿線蟲(chóng)作為一種模型生物為篩選抗菌物質(zhì)提供了良好的平

19、臺(tái)，為新型抗菌物質(zhì)的研發(fā)提供了一個(gè)良好的工具，在研發(fā)新型抗菌藥的過(guò)程中諸多問(wèn)題也可以通過(guò)對(duì)感染的活體動(dòng)物模型研究來(lái)解決。因此，利用秀麗隱桿線蟲(chóng)模型進(jìn)行抗感染藥物篩選具有重要意義19。雖然線蟲(chóng)與人類基因有高度的保守性，作為模型生物在抗菌物質(zhì)體內(nèi)研究中表現(xiàn)出很大優(yōu)勢(shì)，然而，線蟲(chóng)與人類在生理等方面還是有很大差異，線蟲(chóng)不能在37下存活，線蟲(chóng)不具備免疫系統(tǒng)，所以還需要進(jìn)行其他的哺乳動(dòng)物模型進(jìn)行抗菌物質(zhì)篩選。線蟲(chóng)還具有很強(qiáng)的解毒系統(tǒng)，這是因?yàn)榧?xì)胞色素P450基因的原因，因此這就限制了一些可以調(diào)節(jié)宿主防御的化合物的發(fā)現(xiàn)。目前，秀麗隱桿線蟲(chóng)只能用于初選抗感染藥物，新藥物的研發(fā)還需要后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。我

20、們應(yīng)該正確認(rèn)識(shí)秀麗隱桿線蟲(chóng)在抗菌物質(zhì)篩選研究中的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，然后設(shè)計(jì)合理周密的實(shí)驗(yàn)方案，確保線蟲(chóng)模型和人類疾病的某些一致性，只有這樣才能發(fā)揮線蟲(chóng)模型這個(gè)體內(nèi)抗感染藥物篩選和體外抗感染研究橋梁的作用20。本論文利用秀麗隱桿線蟲(chóng)來(lái)篩選抗白色念珠菌的活性物質(zhì)，選取了常用抗真菌藥物氟康唑進(jìn)行抗感染治療，驗(yàn)證了秀麗隱桿線蟲(chóng)模型的可行性。另選取了微擬球藻提取物，對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行抗感染治療，以此來(lái)探究微擬球藻提取物是否具有抗菌療效。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品表1 實(shí)驗(yàn)藥品Table 1 List of experimental regents試劑名稱純度級(jí)別生產(chǎn)廠家蛋白胨-上海東海制藥廠氯化鈉

21、AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司瓊脂-北京康倍斯科技有限公司膽固醇-北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司磷酸氫二鉀AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司磷酸二氫鉀AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司硫酸鎂AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司氯化鈣AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司磷酸氫二納AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司葡萄糖AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司酵母浸粉-北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司胰蛋白胨-北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司乙醇（95%）AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司次氯酸鈉AR天津市富宇精細(xì)化工有限公司酵母浸粉2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器表2 實(shí)驗(yàn)儀器與生產(chǎn)廠家Table 2 List

22、 of experimental instruments儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家精密天平BSM-220.3上海卓精電子科技有限公司立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-75S11上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠單人單面凈化工作臺(tái)SW-CJ-1FD蘇州凈化設(shè)備有限公司臺(tái)式高速離心機(jī)TGL-16江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠振蕩培養(yǎng)箱BS-1E（A）東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司2.1.3 線蟲(chóng)和菌株 N2野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)（購(gòu)自CGC）、尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50（購(gòu)自CGC）、白色念珠菌（濱州醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)）。2.1.4 培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)基 1000 ml的培養(yǎng)基加入2.5 g蛋白胨，3 g NaCl，17 g瓊脂，97

23、5 ml蒸餾水，滅菌后分別加入單獨(dú)滅菌的l mol/L K2HPO4 - KH2PO4緩沖液（pH6.0）25 ml，1 mol/L MgSO4 1 ml，1 mol/L CaCl2 1 ml，1 ml膽固醇溶液（5 mg/ml），用于線蟲(chóng)培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基 1000 ml培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 2.5 g，瓊脂17 g,用于大腸桿菌OP50培養(yǎng)。沙保氏培養(yǎng)基 1000 ml培養(yǎng)基中含40 g葡萄糖和10 g蛋白胨，pH 4.06.0，用于真菌培養(yǎng)。YPD液體培養(yǎng)基 900 ml蒸餾水中含10 g酵母提取物和20 g蛋白胨，100 ml蒸餾水中含20 g葡萄糖，分

24、開(kāi)滅菌，滅菌后合并，用于液體培養(yǎng)白色念珠菌。2.1.5 試劑M9緩沖液 1000 ml的M9緩沖液含6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4.7H2O，現(xiàn)用現(xiàn)配。線蟲(chóng)裂解液 每5 ml含有3.4 ml蒸餾水，0.6 ml NaClO，1 ml 8 mol/L NaOH，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.2 方法2.2.1 線蟲(chóng)培養(yǎng)和保存秀麗隱桿線蟲(chóng)培養(yǎng)時(shí)選用大腸桿菌OP50作為其食物，在NGM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)培養(yǎng)。挑取大腸桿菌OP50單菌落于 LB液體培養(yǎng)基中，37 過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，制成菌懸液。吸取少量菌懸液涂布到NGM平板，培養(yǎng)24h。用M9緩沖液清洗線蟲(chóng)，靜置后去掉上

25、清液，沉淀物接種到NGM培養(yǎng)基上，放于20 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，可看到培養(yǎng)基上有大量線蟲(chóng)21。實(shí)驗(yàn)室中可將線蟲(chóng)放入30 %甘油中，在-80 下保存22。2.2.2 線蟲(chóng)同步化 選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的平板，用M9緩沖液將蟲(chóng)體洗于玻璃管中，等蟲(chóng)體沉降后吸去上清液，加入線蟲(chóng)裂解液，旋渦震蕩5 min至蟲(chóng)體裂解，將其轉(zhuǎn)移至離心管中800 r/min離心1 min，吸去上清液，加入M9緩沖液，重復(fù)離心2次，吸去上清液，得到蟲(chóng)卵，將其放入新的NGM平板的大腸桿菌OP50菌苔上，20 生長(zhǎng)2天，得到同步化的L4時(shí)期線蟲(chóng)。2.2.3 線蟲(chóng)真菌感染 選取白色念珠菌單菌落于50 ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ，

26、振蕩培養(yǎng)24 h，吸取80 ul菌液于沙保氏平板，涂布，30 培養(yǎng)24 h，得到白色念珠菌感染平板。將同步化的L4時(shí)期線蟲(chóng)從大腸桿菌OP50菌苔用M9緩沖液洗下，將其轉(zhuǎn)移至沙保氏平板生長(zhǎng)的白色念珠菌菌苔上進(jìn)行感染，培養(yǎng)10 min。2.2.4 線蟲(chóng)抗感染治療 將經(jīng)過(guò)感染的線蟲(chóng)從白色念珠菌菌苔上洗下，M9緩沖液清洗后，加入M9緩沖液，轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng),每個(gè)孔中加入300ul含有線蟲(chóng)的M9緩沖液。第一列孔為陰性對(duì)照，不加入任何物質(zhì)，其后各孔加入不同劑量的藥物，使各孔中的藥物濃度有所差異，對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行抗菌治療。每次實(shí)驗(yàn)做3組平行。 另取一經(jīng)過(guò)白色念珠菌感染線蟲(chóng)，將其用M9緩沖液洗下，加入M9緩沖液

27、，轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng)。第一列孔為陰性對(duì)照，不加入任何物質(zhì)，其后各孔加入不同劑量的微擬球藻提取物，對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行抗菌治療。每次實(shí)驗(yàn)做3組平行。2.2.5 觀察 將96孔板置于顯微鏡觀察，活線蟲(chóng)呈正弦狀（圖3a），而死亡線蟲(chóng)呈直線型（圖3b），記錄存活的線蟲(chóng)數(shù)量。每個(gè)孔的線蟲(chóng)的存活率單獨(dú)計(jì)算，然后取三個(gè)孔的的平均值。 a. 線蟲(chóng)存活狀態(tài) b. 線蟲(chóng)死亡狀態(tài)圖3 秀麗隱桿線蟲(chóng)感染前后狀態(tài)Fig. 3 Different status of C.elegans before and after bacterial infection 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析3.1 氟康唑治療效果實(shí)驗(yàn)選用臨床常用的抗真菌藥物氟康

28、唑?qū)Ω腥景咨钪榫?0 min的線蟲(chóng)進(jìn)行治療。根據(jù)氟康唑藥品使用說(shuō)明，人體的正常用藥血液中含量為45 mg/L60 mg/L。本實(shí)驗(yàn)初步選用藥物濃度為2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L，連續(xù)觀察記錄線蟲(chóng)存活情況，直到第六天對(duì)照組死亡，結(jié)果如圖4所示。圖4 不同濃度的氟康唑?qū)Ω腥揪€蟲(chóng)的療效Fig.4 Effect of different concentrations of fluconazole on infection elegans 由圖4可知，不同濃度的氟康唑?qū)Ω腥景咨钪榫木€蟲(chóng)療效不同。濃度較低時(shí)，治療效果相對(duì)較差，隨著氟康唑濃度的增加，治

29、療效果越好，但并不是濃度越高越好，濃度過(guò)高對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)生一定的毒副作用，會(huì)導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡。線蟲(chóng)感染白色念珠菌10 min以后，添加1020 mg/L的氟康唑治療效果比較好，在一定劑量范圍內(nèi)，治療效果與劑量成線性關(guān)聯(lián)。3.2 篩選可用于治療白色念珠菌的微擬球藻提取物用95%乙醇浸提微擬球藻浸粉，得到乙醇浸膏，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到3種萃取相和水相，用得到的正丁醇萃取相上大孔樹(shù)脂D101，分別用40%、60%、80%乙醇洗脫得到洗脫液。本次實(shí)驗(yàn)用的微擬球藻提取物為水相提取物和正丁醇相40%、60%、80%乙醇洗脫液。采用40%乙醇洗脫液進(jìn)行抗菌治療，分別加入5ul、10ul、20ul劑

30、量進(jìn)行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲(chóng)存活狀況，直到線蟲(chóng)死亡，結(jié)果如圖5所示。圖5 40%乙醇洗脫液對(duì)感染線蟲(chóng)的療效Fig. 5 Effect of the 40% ethanol eluent on infection elegans 采用60%乙醇洗脫液進(jìn)行抗菌治療，分別加入5ul、10ul、20ul劑量進(jìn)行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲(chóng)存活狀況，直到線蟲(chóng)死亡，結(jié)果如圖6所示。圖6 60 %乙醇洗脫液對(duì)感染線蟲(chóng)的療效Fig. 6 Effect of the 60 % ethanol eluent on infection elegans采用80%乙醇洗脫液進(jìn)行抗菌治療，分別加入5ul、10ul、20ul劑量

31、進(jìn)行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲(chóng)存活狀況，直到線蟲(chóng)死亡，結(jié)果如圖7所示。圖7 80%乙醇洗脫液對(duì)感染線蟲(chóng)的療效Fig.7 Effect of the 80% ethanol eluent on infection elegans乙醇洗脫液中含有一定量的乙醇，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定影響，因此用乙醇做一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，觀察線蟲(chóng)存活情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)線蟲(chóng)存活無(wú)明顯影響，因此可以排除乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。采用水相提取物進(jìn)行抗菌治療，分別加入2.5ul、5ul、10ul、20ul劑量進(jìn)行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲(chóng)存活狀況，直到線蟲(chóng)死亡，結(jié)果如圖8所示。圖8 水相提取物對(duì)感染線蟲(chóng)的療效Fig.8 Effect of the aque

32、ous extract on infection elegans由以上4個(gè)圖可知，微擬球藻的正丁醇萃取相40%、60%、80%乙醇洗脫液，與對(duì)照組相比較不具有抗菌療效；水相提取物與對(duì)照組相比，同樣不具有抗菌效果，加入量過(guò)多還會(huì)引起線蟲(chóng)死亡。4 結(jié)論氟康唑是一種常用的抗白色念珠菌藥物，抗菌譜較廣，其機(jī)制主要為高度選擇性干擾真菌的細(xì)胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細(xì)胞膜上麥角固醇的生物合成，達(dá)到抑菌效果。本次實(shí)驗(yàn)分別選用氟康唑和微擬球藻提取物對(duì)感染了白色念珠菌的秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行治療。選用氟康唑?qū)Ω腥揪€蟲(chóng)進(jìn)行治療，在一定劑量范圍內(nèi)，治療效果與劑量呈線性關(guān)系，添加1020 mg/L的氟康唑治療效果

33、較好。選用微擬球藻提取物對(duì)感染線蟲(chóng)進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)不具備抗菌療效。致謝參考文獻(xiàn)1 Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegansJ. Genetics, 1974, 77: 7194. 2 趙晴, 蔣湉湉. 秀麗隱桿線蟲(chóng)研究綜述J. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(19): 1009210095.3 賈熙華, 曹誠(chéng). 秀麗隱桿線蟲(chóng)在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和進(jìn)展J. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 44(7): 687694 .4 Ellis HM, Horvitz HR. Genetic control of programmed cell death i

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