生物分離工程 電泳和電色譜技術

1、生物分離工程生物分離工程電泳和電色譜技術電泳和電色譜技術學習總體要求學習總體要求 掌握電泳概念，電泳速度及凝膠電泳，了解掌握電泳概念，電泳速度及凝膠電泳，了解其他幾種常見電泳原理及特點，操作及應用。其他幾種常見電泳原理及特點，操作及應用。 電泳及電泳分離電泳及電泳分離n電泳電泳 電泳是荷電溶質（電解質）在電場作用下發(fā)電泳是荷電溶質（電解質）在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。生定向泳動的現(xiàn)象。n電泳分離電泳分離 利用荷電溶質在電場中泳動速度的差別進行利用荷電溶質在電場中泳動速度的差別進行分離的方法，稱為電泳分離。分離的方法，稱為電泳分離。電泳分類電泳分類n根據(jù)電泳原理分類根據(jù)電泳原理分類 區(qū)帶電泳

2、；區(qū)帶電泳； 等電點電泳（等電聚焦）；等電點電泳（等電聚焦）； 等速電泳；等速電泳；n根據(jù)電泳載體分類根據(jù)電泳載體分類 凝膠電泳；凝膠電泳； 自由流電泳；自由流電泳； 電色譜電色譜 電泳與色譜原理相結合可以派生多種復合分電泳與色譜原理相結合可以派生多種復合分離方法離方法n電泳色譜電泳色譜(electrophoretic chromatography) 將溶質的電泳遷移與色譜分離相結合將溶質的電泳遷移與色譜分離相結合n電色譜電色譜(electrochromatography) 利用電滲作為驅動流動相流動，分離作用源于溶質利用電滲作為驅動流動相流動，分離作用源于溶質在固定相和流動相間的分配平衡特性

3、在固定相和流動相間的分配平衡特性基礎理論基礎理論 n識記識記：電泳、遷移率、電滲流概念：電泳、遷移率、電滲流概念n理解理解：了解自由溶液中的電泳速度和凝膠中的：了解自由溶液中的電泳速度和凝膠中的電泳速度電泳速度電解質在電場中運動電解質在電場中運動陰離子陽離子自由溶液中電泳速度自由溶液中電泳速度 n荷電溶質在電場中所受的靜電引力荷電溶質在電場中所受的靜電引力f與溶質的與溶質的荷電荷數(shù)荷電荷數(shù)z及電場強度及電場強度E成正比，其表示為成正比，其表示為n荷電溶質在自由溶液中受到的阻力荷電溶質在自由溶液中受到的阻力f為為 n當兩者之間達到平衡后，當兩者之間達到平衡后， fE Ze6efr v ff06e

4、eZEvu Er 電解質溶質遷移率電解質溶質遷移率真實電泳速度真實電泳速度 在實際過程中，根據(jù)雙電層理論，荷電溶質的在實際過程中，根據(jù)雙電層理論，荷電溶質的表面附近存在距表面由高到低的反離子分布。表面附近存在距表面由高到低的反離子分布。當荷電溶質的表面電位（當荷電溶質的表面電位（0）很小時，電位）很小時，電位沿表面附近半徑方向的變化可用如下的指數(shù)函沿表面附近半徑方向的變化可用如下的指數(shù)函數(shù)表示，數(shù)表示， 0 xe121322 10Bk Te NI真實電泳速度真實電泳速度n考慮到雙電層中電位分布情況，帶電粒子的考慮到雙電層中電位分布情況，帶電粒子的遷移率變?yōu)檫w移率變?yōu)?1r061eZfrurr

5、1r1.5fr1fr204 reZu 06eZur 凝膠濃度的表示法凝膠濃度的表示法n電泳分離中常用的聚丙烯酰胺凝膠是由丙稀酰胺單體和交聯(lián)劑N, N-甲叉雙丙稀酰胺在催化劑和引發(fā)劑的作用下共聚調制，凝膠濃度可用如下公式表示 %100mbaTg100%gbcab凝膠濃度：交聯(lián)濃度：丙烯酰胺單體質量；交聯(lián)劑單體質量；緩沖液質量；abm凝膠中的電泳速度凝膠中的電泳速度 n當一定交聯(lián)濃度時，聚丙稀酰胺凝膠中電泳遷移速率和凝膠濃度之間有如下關系 grTKuu0loglog為與交聯(lián)劑濃度有關的凝膠延遲系數(shù)；為外插到Tg0時的遷移率；rK0u電滲流速度電滲流速度n電滲流是荷電固體表面誘導的雙電層中反離電滲流

6、是荷電固體表面誘導的雙電層中反離子在電場作用下發(fā)生定向遷移引起的。子在電場作用下發(fā)生定向遷移引起的。n電滲流可用下式表示：電滲流可用下式表示：0wLEv+-凝膠電泳學習要點凝膠電泳學習要點n理解理解：凝膠電泳原理，等速電泳的原理特點，：凝膠電泳原理，等速電泳的原理特點，以及分離操作和分離特性以及分離操作和分離特性凝膠電泳定義凝膠電泳定義n凝膠電泳是利用凝膠分子篩作用使分子大小凝膠電泳是利用凝膠分子篩作用使分子大小不同的電解質得到分離的電泳分離方法。不同的電解質得到分離的電泳分離方法。凝膠電泳原理n原理原理 在凝膠電泳過程中，不同分子量的荷電溶質在遷移過程中在凝膠電泳過程中，不同分子量的荷電溶質

7、在遷移過程中的的泳動速度泳動速度是不同的。是不同的。相對分子量較大相對分子量較大的溶質受凝膠阻滯作的溶質受凝膠阻滯作用較大，泳動速度慢；相反，用較大，泳動速度慢；相反，分子量小分子量小的溶質泳動速度較快。的溶質泳動速度較快。經(jīng)過一定時間的電泳后，根據(jù)溶質相對分子質量的不同，凝經(jīng)過一定時間的電泳后，根據(jù)溶質相對分子質量的不同，凝膠中形成數(shù)條含不同溶質的區(qū)帶，實現(xiàn)溶質間的分離。膠中形成數(shù)條含不同溶質的區(qū)帶，實現(xiàn)溶質間的分離。n凝膠電泳所使用的凝膠種類和濃度根據(jù)待分離料液凝膠電泳所使用的凝膠種類和濃度根據(jù)待分離料液中溶質的相對分子量而異。中溶質的相對分子量而異。n凝膠電泳的特點是凝膠柱中凝膠濃度和凝

8、膠電泳的特點是凝膠柱中凝膠濃度和pHpH值均一。值均一。不連續(xù)凝膠電泳形式不連續(xù)凝膠電泳形式 n不連續(xù)凝膠電泳的凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組不連續(xù)凝膠電泳的凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成。成。n上層凝膠濃度在上層凝膠濃度在2-3% Tg，其凝膠孔徑很大，凝膠，其凝膠孔徑很大，凝膠對溶質的泳動基本上無阻滯作用，表現(xiàn)為對溶質的泳動基本上無阻滯作用，表現(xiàn)為等速泳動等速泳動，溶質在此層得到濃縮；溶質在此層得到濃縮；n下層凝膠濃度在下層凝膠濃度在5-25% Tg ，凝膠具有一定的孔徑，凝膠具有一定的孔徑，各組分根據(jù)荷電量和遷移率的差別得到分離。因此，各組分根據(jù)荷電量和遷移率的差別得到分離。因此，上層稱為

9、濃縮層或濃縮膠；下層稱為分離層或分離上層稱為濃縮層或濃縮膠；下層稱為分離層或分離膠。膠。 等速電泳的原理等速電泳的原理 n在上層凝膠層中，以遷移率最大的陰離子為前導離在上層凝膠層中，以遷移率最大的陰離子為前導離子（一般為強電解質離子，子（一般為強電解質離子，Cl-）；遷移率最小的陰）；遷移率最小的陰離子為末尾離子（一般為甘氨酸）；離子為末尾離子（一般為甘氨酸）；n電泳開始前，將含有目標蛋白質的料液加入到前導電泳開始前，將含有目標蛋白質的料液加入到前導離子和末尾離子之間；料液區(qū)的離子和末尾離子之間；料液區(qū)的pH值高于前導離子值高于前導離子區(qū)的區(qū)的pH值；值；n在前導離子區(qū)，前導離子的濃度與反離子

10、的濃度一在前導離子區(qū)，前導離子的濃度與反離子的濃度一定時，由于定時，由于pH值不變，其泳動速度為一定值；值不變，其泳動速度為一定值；n末尾離子根據(jù)其處位置的末尾離子根據(jù)其處位置的pH值所產生的解離度和離值所產生的解離度和離子遷移率將向陽極（帶負電荷）或陰極（帶正電荷）子遷移率將向陽極（帶負電荷）或陰極（帶正電荷）移動；移動；等速電泳的原理等速電泳的原理(續(xù)續(xù))n料液中移動速度最快的組分料液中移動速度最快的組分A（pH高）首先進入前高）首先進入前導離子區(qū)，但由于前導離子區(qū)導離子區(qū)，但由于前導離子區(qū)pH值較低，溶質的解值較低，溶質的解離度減?。ㄋ鶐ж撾姾勺兩?，離度減小（所帶負電荷變少，pH降低），

11、泳動速度降低），泳動速度減慢。因此，其被排擠出前導離子區(qū)，從而在前導減慢。因此，其被排擠出前導離子區(qū)，從而在前導離子區(qū)和混合料液區(qū)交界處組分濃度增加；離子區(qū)和混合料液區(qū)交界處組分濃度增加；n同時，為了與反離子保持電中性，該處溶液同時，為了與反離子保持電中性，該處溶液pH值降值降低；低；n在此降低的在此降低的pH值下，其它組分不能與組分值下，其它組分不能與組分A以相同以相同的速度泳動而拖后；的速度泳動而拖后；n隨著時間的推移，所有的溶質都開始形成獨自的區(qū)隨著時間的推移，所有的溶質都開始形成獨自的區(qū)帶，顯示與該區(qū)帶內的弱酸離子和反離子濃度相應帶，顯示與該區(qū)帶內的弱酸離子和反離子濃度相應的的pH值。

12、值。等速電泳的特點等速電泳的特點n各個組分間形成相互連接的獨自區(qū)帶，顯示各個組分間形成相互連接的獨自區(qū)帶，顯示各自與對離子相應的各自與對離子相應的pH值；值；n提高前導離子的濃度可以使溶質得到濃縮；提高前導離子的濃度可以使溶質得到濃縮；n采用適當?shù)牡头肿觾尚噪娊赓|，在目標蛋白采用適當?shù)牡头肿觾尚噪娊赓|，在目標蛋白質前后作間隔物，可使目標蛋白與其它蛋白質前后作間隔物，可使目標蛋白與其它蛋白質完全分離；質完全分離；不連續(xù)凝膠的分離操作不連續(xù)凝膠的分離操作 不連續(xù)凝膠層的上部和下部分別使用不連續(xù)凝膠層的上部和下部分別使用pH值不同值不同的緩沖液，其中上部緩沖液根據(jù)待分離蛋白質等電點的緩沖液，其中上部

13、緩沖液根據(jù)待分離蛋白質等電點選定。選定。n上層濃縮層采用上層濃縮層采用pH 6.8的緩沖液，下層分離層采用的緩沖液，下層分離層采用pH 8.3的緩沖液；的緩沖液；n上層中，料液中蛋白質夾在前導離子和末尾離子之間上層中，料液中蛋白質夾在前導離子和末尾離子之間在濃縮層內等速泳動，達到等速電泳狀態(tài)后進入下層在濃縮層內等速泳動，達到等速電泳狀態(tài)后進入下層分離凝膠；分離凝膠；n下層中蛋白質受到高濃度凝膠的分子篩作用，末尾離下層中蛋白質受到高濃度凝膠的分子篩作用，末尾離子會超過蛋白質，蛋白質依據(jù)荷電量和分子大小分離；子會超過蛋白質，蛋白質依據(jù)荷電量和分子大小分離； 影響不連續(xù)凝膠分離的因素影響不連續(xù)凝膠分

14、離的因素n緩沖液的緩沖液的pH值、組成值、組成 調節(jié)調節(jié)pH值可以改變荷電量值可以改變荷電量Z；n分離膠的濃度或交聯(lián)度分離膠的濃度或交聯(lián)度 調節(jié)凝膠濃度可改變遷移率；調節(jié)凝膠濃度可改變遷移率；n外加電壓外加電壓等電點聚焦學習要點等電點聚焦學習要點n理解理解：等電點聚焦的原理及特點：等電點聚焦的原理及特點 等電點聚焦定義等電點聚焦定義 等電聚焦是利用蛋白質和氨基酸等兩性電等電聚焦是利用蛋白質和氨基酸等兩性電解質具有等電點，在等電點的解質具有等電點，在等電點的pH值下蛋白質值下蛋白質呈電中性，不發(fā)生泳動的特點進行電泳分離的呈電中性，不發(fā)生泳動的特點進行電泳分離的方法。方法。 形成連續(xù)梯度的化合物形

15、成連續(xù)梯度的化合物 IEF的關鍵是調配穩(wěn)定的連續(xù)的關鍵是調配穩(wěn)定的連續(xù)pH值梯度，一般采值梯度，一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其帶有許多正負電用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其帶有許多正負電荷，這類物質具有與蛋白質相近似的等電點范圍，緩荷，這類物質具有與蛋白質相近似的等電點范圍，緩沖能力強，沖能力強，pH值梯度穩(wěn)定。其結構如下值梯度穩(wěn)定。其結構如下 在無外加電場作用時，作為載體的兩性電解質溶液的pH值大約是該溶液pH值范圍的平均值。 穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度的形成梯度的形成 在電場作用下，組成溶液的在電場作用下，組成溶液的無機鹽電解質無機鹽電解質（如硫酸鈉等）（如硫酸鈉等）在陽極聚焦在陽極聚焦硫酸

16、硫酸而在陰極聚焦而在陰極聚焦氫氧化鈉氫氧化鈉。如果此時有載體存。如果此時有載體存在于溶液中，則它們在陽極的酸性介質中就會得到質子而帶在于溶液中，則它們在陽極的酸性介質中就會得到質子而帶正電，在陰極的堿性介質中則失掉質子而帶負電。這樣載體正電，在陰極的堿性介質中則失掉質子而帶負電。這樣載體就會受其附近的電極所排斥而向相反方向移動。設其中有一就會受其附近的電極所排斥而向相反方向移動。設其中有一個酸性最強的兩性電解質個酸性最強的兩性電解質A（pI值最?。?，當它由陰極逐漸接值最?。斔申帢O逐漸接近陽極的硫酸時，就會失去電荷而停止運動。由于它有高的近陽極的硫酸時，就會失去電荷而停止運動。由于它有高的

17、緩沖能力，使環(huán)境溶液的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH值等于值等于A的等電點，的等電點，A所在的位所在的位置就是它的等電點，另有一個等電點稍高于兩性電解質置就是它的等電點，另有一個等電點稍高于兩性電解質A的物的物質質B，當向陽極運動靠近，當向陽極運動靠近A時，它不能超過時，它不能超過A，因為那里低于，因為那里低于它的等電點。于是它的等電點。于是B將帶正電荷而向陰極移動，它只能排在將帶正電荷而向陰極移動，它只能排在A的陰極側。的陰極側。IEF原理原理 蛋白質在電場作用下泳動到等于各自等蛋白質在電場作用下泳動到等于各自等電點的電點的pH值區(qū)域形成具有不同等電點的蛋白值區(qū)域形成具有不同等電點的蛋白質區(qū)帶；

18、質區(qū)帶； IEF特點特點n受溶質擴散影響小，受溶質擴散影響小，IEF可消除分子擴散引可消除分子擴散引起的分離度下降。起的分離度下降。n兩性電解質的加入對產品產生兩性電解質的加入對產品產生污染污染；npH梯度梯度穩(wěn)定性穩(wěn)定性不高；不高；n操作過程中易發(fā)生凝膠脫水起皺現(xiàn)象；操作過程中易發(fā)生凝膠脫水起皺現(xiàn)象；二維電泳學習要點二維電泳學習要點n理解理解：上述電泳原理和特點：上述電泳原理和特點n應用應用：了解上述電泳技術的適用范圍：了解上述電泳技術的適用范圍二維電泳定義二維電泳定義 二維電泳是同時利用分子的大小和等電點這二維電泳是同時利用分子的大小和等電點這兩種特性的差別進行蛋白質等生物大分子的兩種特性

19、的差別進行蛋白質等生物大分子的電泳分離方法。電泳分離方法。二維電泳原理二維電泳原理 在凝膠電泳槽的在凝膠電泳槽的y方向上具有濃度分布，而在方向上具有濃度分布，而在x方向上首先調配方向上首先調配pH值梯度，使溶質分子以等電點值梯度，使溶質分子以等電點聚焦的形式泳動到其等電點處。然后將適當聚焦的形式泳動到其等電點處。然后將適當pH值值的緩沖液滲透到凝膠中，在的緩沖液滲透到凝膠中，在y方向上加電場使溶質方向上加電場使溶質再次泳動。此時溶質之間的泳動速度受荷電量及分再次泳動。此時溶質之間的泳動速度受荷電量及分子量的影響，直至泳動到被高濃度凝膠所阻滯，相子量的影響，直至泳動到被高濃度凝膠所阻滯，相互之間

20、得到進一步分離。互之間得到進一步分離。二維電泳凝膠電泳等電點聚焦二維電泳特點二維電泳特點n分離度高，可分離等電點相差分離度高，可分離等電點相差0.01個個pH值的值的蛋白質；蛋白質；n處理量小，適用于分離微量的高純度目標產處理量小，適用于分離微量的高純度目標產物，用于科學研究；物，用于科學研究； 逆向作用層析電泳學習要點逆向作用層析電泳學習要點n理解理解：逆向作用層析電泳原理和特點：逆向作用層析電泳原理和特點n應用應用：了解逆向作用層析電泳技術的適用范圍：了解逆向作用層析電泳技術的適用范圍逆向作用層析電泳原理逆向作用層析電泳原理 逆向作用層析電泳是利用填充兩層具有不同排逆向作用層析電泳是利用填充兩層具有不同