乙酰半胱氨酸分析

1、 乙 酰 半 胱 氨 酸 顆 粒46檢查項目方法（列明方法編號）放行標(biāo)準(zhǔn)限度貨架期標(biāo)準(zhǔn)限度性狀為可溶性細(xì)顆粒；氣芳香，味酸甜（SOP/YC005-01-01性狀）為可溶性細(xì)顆粒；氣芳香，味酸甜為可溶性細(xì)顆粒；氣芳香，味酸甜鑒別HPLC法（SOP/YC005-01-01鑒別）在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致酸度中國藥典2010年版二部附錄H（SOP/YC005-01-01酸度）2.03.02.03.0干燥失重中國藥典2010年版二部附錄L（SOP/YC005

2、-01-01干燥失重）不得過2.0%不得過2.0%溶化性中國藥典2010年版二部附錄N顆粒劑-溶化性（SOP/YC005-01-01溶化性）全部溶化或輕微渾濁，不得有異物全部溶化或輕微渾濁，不得有異物裝量差異中國藥典2010年版二部附錄N顆粒劑-裝量差異（SOP/YC005-01-01裝量差異）符合規(guī)定符合規(guī)定有關(guān)物質(zhì)HPLC法（SOP/YC005-01-01有關(guān)物質(zhì)）L-胱氨酸（雜質(zhì)A）、L-半胱氨酸（雜質(zhì)B）、N,S-二乙酰-L-半胱氨酸（雜質(zhì)D）的量均不超過0.5%，N,N-二乙酰-L-胱氨酸（雜質(zhì)C）的量不超過0.5%，雜質(zhì)總量不得過1.0%L-胱氨酸（雜質(zhì)A）、L-半胱氨酸（雜質(zhì)B）

3、、N,S-二乙酰-L-半胱氨酸（雜質(zhì)D）的量均不超過0.5%，N,N-二乙酰-L-胱氨酸（雜質(zhì)C）的量不超過1.0%，雜質(zhì)總量不得過1.5%微生物限度中國藥典2010年版二部附錄 J微生物限度檢查法（SOP/YC005-01-01 微生物限度檢查）細(xì)菌數(shù)1000個/g，霉菌和酵母菌數(shù)100個/g，大腸埃希菌不得檢出細(xì)菌數(shù)1000個/g，霉菌和酵母菌數(shù)100個/g，大腸埃希菌不得檢出含量HPLC法（SOP/YC005-01-01含量測定）95.0%105.0%90.0%110.0%1性狀本品應(yīng)為可溶性細(xì)顆粒；氣芳香，味酸甜。1.2鑒別(1)取本品適量（約相當(dāng)于乙酰半胱氨酸0.2g），加水20ml

4、溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，并用水稀釋至40ml,作為供試品溶液；另取乙酰半胱氨酸對照品0.2g，同法制備作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄B）試驗，吸取上述兩種溶液各5l，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4:1:5）混合并平衡10分鐘的上層液為展開劑，展開后，取出，在熱氣流下吹干，再于碘蒸氣中顯色，供試品溶液所顯主斑點的位置和顏色應(yīng)與對照品溶液的主斑點相同。（2）HPLC法：在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。以上（1）、（2）兩項可選做一項。1.3 檢查酸度檢查方法：取本品，加水制成10%的溶液，

5、依法測定（2010年版二部附錄H），pH值應(yīng)為2.03.0。干燥失重檢查方法：取本品，在70干燥4小時，減失重量不得過2.0%（2010年版二部附錄L）。溶化性檢查方法：取供試品10g,加熱水200ml，攪拌5分鐘，可溶顆粒應(yīng)全部溶化或輕微渾濁，但不得有異物。裝量差異檢查方法：應(yīng)符合規(guī)定（2010年版二部附錄N顆粒劑-裝量差異）。有關(guān)物質(zhì)檢查方法：HPLC法色譜條件：色譜柱：C18 流動相：硫酸銨緩沖液（取硫酸銨5.00g、庚烷磺酸鈉4.04g，用水稀釋至1000ml，用7mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0）：甲醇（93：7） 柱溫：30 檢測波長：205nm流速：1.0ml/min 進(jìn)樣

6、體積：10l理論塔板數(shù)：按乙酰半胱氨酸峰計算不低于1000。測定法：取含量測定項下的細(xì)粉適量（約相當(dāng)于乙酰半胱氨酸25mg），精密稱定，置50ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液；另取胱氨酸（雜A）對照品和半胱氨酸（雜B）對照品適量，精密稱定，（雜A需加1M鹽酸使溶解），加流動相分別溶解稀釋制成每1ml中約含有2.5g的溶液，搖勻，作為雜質(zhì)A，雜質(zhì)B對照溶液；取自身對照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分峰的峰高約為滿量程的20%；精密量取雜A與雜B對照溶液各20

7、l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；再精密量取供試品溶液20l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分保留時間的5倍。供試品溶液色譜圖中，如有與雜A和雜B保留時間一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計算，均不得過0.5%；雜C的峰面積 (雜C相對保留時間約為1.6) 除以校正因子（校正因子=1.21）之后不得大于自身對照溶液的主峰面積1.0倍（1.0%），雜D的峰面積 (雜D相對保留時間約為1.8-2.0) 除以校正因子（校正因子=0.78）之后不得大于自身對照溶液的主峰面積的0.5倍（0.5%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于自身對照溶液主峰面積的1.5倍（1.5%）。計算公式： AXCRVxWR 雜A/雜

8、B(%) 100% ARMXK 式中：AX為供試品溶液相應(yīng)雜質(zhì)的峰面積；AR為雜質(zhì)對照溶液的主峰面積；MX為供試品的稱取量，mg；CR為雜質(zhì)對照品的濃度，mg；R為雜質(zhì)對照品自身的含量；W為平均袋重，mg；K為每袋的標(biāo)示含量，mg。 AX 雜質(zhì)C(%)= 1% 1.21AR 式中：AX為 雜質(zhì)C的峰面積； AR為自身對照溶液的主峰面積； AX 雜質(zhì)D(%)= 1% 0.78AR 式中：AX為 雜質(zhì)D的峰面積； AR為自身對照溶液的主峰面積； AX 其他單個雜質(zhì)(%)1% AR 式中：AX為供試品溶液其他單個雜質(zhì)的峰面積； AR為自身對照溶液的主峰面積；雜質(zhì)總和(%)=雜A(%)+ 雜B(%)+

9、雜C(%)+ 雜D(%)+其他單個雜質(zhì)的和(%)微生物限度 含量測定 檢查方法：HPLC法色譜條件：色譜柱：C18 流動相： 0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液（用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值3.0） 柱溫：30 檢測波長：214nm流速：1.0ml/min 進(jìn)樣體積：20l理論塔板數(shù)：按乙酰半胱氨酸峰計算不低于1000。測定法 ：取本品10袋，將內(nèi)容物全量轉(zhuǎn)移至500ml量瓶中，加焦亞硫酸鈉溶液（12000）適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25ml，置100ml量瓶中，用焦亞硫酸鈉溶液（12000）稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取乙

10、酰半胱氨酸對照品約50mg,精密稱定，置100ml量瓶中，加焦亞硫酸鈉溶液（12000）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。 計算公式： AXMRRVX 含量（%） = 100% ARVRK式中：AX為供試品溶液的峰面積；AR為對照品溶液的峰面積；MR為對照品的稱取量，g；VR為對照品稀釋體積，ml；VX為供試品稀釋體積，ml；R為乙酰半胱氨酸對照品的含量；K為乙酰半胱氨酸顆粒的規(guī)格，g。分析方法的驗證按照化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導(dǎo)原則、化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程技術(shù)指導(dǎo)原則、化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則、化學(xué)藥物殘留溶劑研究技術(shù)指導(dǎo)原

11、則以及2010年版中華人民共和國藥典附錄中有關(guān)的指導(dǎo)原則提供方法學(xué)驗證資料，進(jìn)行方法學(xué)驗證，結(jié)果如下：含量測定方法學(xué)驗證結(jié)果項目驗證結(jié)果專屬性空白輔料基本無干擾線性和范圍在108.44g/ml1084.40g/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，R=0.9998定量限、檢測限主成分的定量限為0.856ng,峰面積的RSD%=2.75，保留時間的RSD%=0.76準(zhǔn)確度在80%120%濃度范圍內(nèi)，回收率為：99.21%-104.75%，平均回收率為101.74%，RSD為1.77%精密度重復(fù)性：平均值為99.95%，RSD為0.61%中間精密度：平均值為99.93%，RSD為0.06%溶液

12、穩(wěn)定性測試液在5小時內(nèi)穩(wěn)定耐用性參數(shù)的微小調(diào)整對結(jié)果均無顯著影響方法的確定 參考乙酰半胱氨酸顆粒（中國藥典2010版第二部）的含量測定方法,照高效液相色譜法（中國藥典2010年版二部附錄V D）對本品的含量測定條件進(jìn)行了試驗。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液（用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值3.0）為流動相；檢測波長為214nm。理論板數(shù)按乙酰半胱氨酸峰計算不低于1000。測定法：取本品10袋，將內(nèi)容物全量轉(zhuǎn)移至500ml量瓶中，加焦亞硫酸鈉溶液（12000）適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25ml，置100ml（0.1g規(guī)格）或200

13、ml（0.2g規(guī)格）量瓶中，用焦亞硫酸鈉溶液（12000）稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取20ml注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取乙酰半胱氨酸對照品約50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加焦亞硫酸鈉溶液（12000）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。儀器、試劑及色譜條件儀器：島津SPD-10AVP紫外可變波長檢測器島津LC-10ATVP高壓恒流泵HW2000 色譜工作站試劑：磷酸氫二鉀 分析純 南京化學(xué)試劑有限公司 水 純化水 自制 磷酸 分析純 南京化學(xué)試劑有限公司 焦亞硫酸鈉 分析純 國藥集團(tuán)色譜條件：色譜柱： C18

14、柱，5m，4.6mm250mm；流動相：0.05mol/L磷酸氫二鉀溶液（用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值3.0）；檢測波長：214nm； 流速：1.0ml/min；檢測波長的確定取乙酰半胱氨酸對照品適量，精密稱定，用焦亞硫酸鈉溶液（12000）稀釋制成每1ml含乙酰半胱氨酸10g的溶液；照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010版二部附錄A），于190nm400nm掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酰半胱氨酸對照品為末端吸收。參照乙酰半胱氨酸顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（中國藥典2010年版二部），選用214nm為含量的測定波長。見附件5，第1頁?？瞻纵o料干擾稱取處方量空白輔料約0.225g，置50ml量瓶中，用焦亞硫酸鈉溶液（12000）

15、溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。取空白輔料溶液20l注入液相色譜儀，記錄譜圖。見附件5，第2、3頁。結(jié)果顯示：空白輔料不干擾本品含量的測定。含量測定線性試驗精密稱取乙酰半胱氨酸對照品27.11mg，精密稱定，置25ml容量瓶中，加焦亞硫酸鈉溶液（12000）溶解并稀釋至刻度、搖勻，作為貯備液。分別精密量取貯備液適量置合適量瓶中，用焦亞硫酸鈉溶液（12000）稀釋制成一系列濃度的供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液及貯備液各20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖譜見本資料附圖第15-20頁，結(jié)果見表

16、1。表1 乙酰半胱氨酸顆粒含量測定線性試驗濃度（g/ml）峰面積回歸方程12平均108.44 599590593048596319y = 4888.1x +99053R = 0.9998271.10144690214478081447355433.76219175621866042189180542.20282005428070442813549813.304071612406285240672321084.40539138853739705382679結(jié)果表明：乙酰半胱氨酸在濃度108.44g/ml1084.40g/ml范圍內(nèi)峰面積A與濃度C呈良好的線性關(guān)系。定量限取乙酰半胱氨酸對照品適量，

17、用焦亞硫酸鈉溶液（12000）配成一定濃度的溶液。按倍倍稀釋的辦法，信噪比S/N=10，取20l 注入色譜儀，記錄色譜圖，得到定量限為0.856ng（檢測濃度為0.0428g /ml）。附件6，第73-77頁。 回收率試驗精密稱取乙酰半胱氨酸原料適量作為主藥，取50袋處方量輔料，分別加入50袋處方量的80%、100%、120%的主藥，混合均勻，配制模擬樣品，精密稱取此樣品適量各3份，按含量測定方法測定，計算回收率。圖譜見本資料附圖第22-34頁，結(jié)果見表2。表2 乙酰半胱氨酸顆粒含測回收率試驗結(jié)果(n=9)編 號加入量（mg）測得總量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）80%120

18、.9821.14100.78101.741.77221.3422.08103.47321.3822.13103.55100%125.7225.79100.29226.0126.23100.83325.8927.12104.75120%130.6430.4099.21230.7931.25101.52331.2631.66101.29結(jié)果：本法回收率好，輔料對含量測定不干擾。精密度試驗 重復(fù)性試驗取本品（批號：110606），照含量測定項下方法制備樣品，平行6份，測定含量。結(jié)果見表35，圖譜見本資料附圖第35-45頁。表3 乙酰半胱氨酸顆粒含量測定重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）次 數(shù)123456含 量

19、（%）99.9099.1699.8599.69100.06101.02平均含量（%）99.95RSD（%）0.61中間精密度試驗取本品（批號：110606），分別照含量測定項下乙酰半胱氨顆粒的含量測定方法， 由不同分析人員在不同日期內(nèi)依法測定，測定結(jié)果見表4，圖譜見本資料附圖第50-65頁表4 乙酰半胱氨酸顆粒含量測定中間精密度試驗(n=3)天數(shù)(天)123人 員AAB色譜柱含量（%）99.9599.8699.97平均值（%）99.93RSD （%）0.06結(jié)果表明：用本法測定乙酰半胱氨酸顆粒含量中間精密度良好，方法可行。 溶液穩(wěn)定性試驗照含量測定項下方法配制樣品溶液，考察其溶液穩(wěn)定性，分別于

20、0、1、2、3、4、5、6小時依法測定，樣品的含量測定結(jié)果見表5，圖譜見本資料附圖第35-40、46-49頁。表5 乙酰半胱氨酸顆粒含量測定溶液穩(wěn)定性試驗時間（h）0123456含量（%）99.90100.0199.9298.6699.7099.9894.23平均（%）98.91結(jié)果表明：含量測定溶液在5小時內(nèi)穩(wěn)定。耐用性試驗按照中國藥典2010年版附錄的要求對本方法含量進(jìn)行耐用性試驗考察，主要考察了不同柱溫、不同流速、不同流動相比例、不同pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱等的變化對測定結(jié)果的影響情況。主要考察含量測定供試品溶液中，主峰的理論塔板數(shù)、拖尾因子、保留時間、主藥的含量，實驗結(jié)

21、果見表6至表14，圖譜見本資料附圖第66-103頁。表6 耐用性試驗條件列表耐用性研究項目試驗方法的條件確認(rèn)的耐用性范圍色譜柱溫度302535波長214209219流速1.0ml/min0.8ml/min1.2ml/min色譜柱C18柱（5m，4.6mm250mm）不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱3根pHpH3.00.2表7 耐用性試驗結(jié)果-不同柱溫條件主峰的理論板數(shù)主峰的拖尾因子樣品測定含量（%）25-1115661.2410521108.4130-1120491.24 110.2030-2120471.20108.7635-1126021.19105.7335-2118651.19105.06表8 耐用性試驗結(jié)果-不同波長條件主峰的理論板數(shù)主峰的拖尾因子樣品測定含量（%）209nm-1108451.24101.82209nm-2109421.23101.27214nm-1126