生物有機(jī)翻譯文獻(xiàn)

1、源于大蒜的巰基活性化合物抑制上皮細(xì)胞的鈉通道Patrick Krumma, Teresa Giraldez b, Diego Alvarez de la Rosa c, Wolfgang G. Clauss a, Martin Fronius a, Mike Althaus a,前言上皮細(xì)胞的鈉通道（ENaC）是影響跨膜運(yùn)輸鈉的一個(gè)關(guān)鍵因素，因此也影響到了有機(jī)體內(nèi)鹽和水的平衡。ENaC活動(dòng)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的很多疾病，如高血壓、鹽浪費(fèi)綜合征、囊腫性纖維化、肺水腫和腸功能紊亂。因此，鑒別影響ENaC活性的新奇的化合物是非常重要的。本文就對(duì)大蒜特有的有機(jī)硫化合物是否對(duì)ENaC有影響進(jìn)行了研究。人類的E

2、NaC在爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)異源表達(dá)，他們的活性是由兩個(gè)電極電壓鉗技術(shù)測(cè)量跨膜電流來判斷。從5g大蒜里提取的新鮮化合物減少了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的ENaC的橫跨膜電流在10分鐘內(nèi)，這個(gè)效果與使用的化合物量有關(guān)而且是不可逆的。這是完全敏感的對(duì)抑制ENaC的阿米洛利，但對(duì)控制卵母細(xì)胞不明顯。通過二硫蘇糖和L-半胱氨酸阻斷大蒜的作用表明有巰基活性化合物的參與。大蒜有機(jī)硫化合物烯丙基半胱氨酸、蒜氨酸和二烯丙基硫化物對(duì)ENaC沒有影響。通過對(duì)比，源于大蒜的巰基活性化合物蒜素顯著的抑制了ENaC。這些數(shù)據(jù)表明源于大蒜的巰基活性化合物能抑制ENaC。1介紹ENaC是一種異質(zhì)鈉選擇性離子通道，它由三個(gè)亞基組成、和。EN

3、aCs廣泛表達(dá)于脊椎動(dòng)物的上皮細(xì)胞，并且代表了跨上皮吸收鈉的限速步驟。鈉的跨膜運(yùn)輸通過上皮細(xì)胞產(chǎn)生滲透壓梯度，從而推動(dòng)水的滲透跨膜運(yùn)動(dòng)。ENaCs因此成為調(diào)節(jié)有機(jī)體內(nèi)鹽水平衡的關(guān)鍵因素。在腎臟中，ENaCs表達(dá)于遠(yuǎn)端腎單位和皮質(zhì)集合管，在那里他們負(fù)責(zé)鈉從原尿的吸收，因此參與了調(diào)控全身鹽分和水分的動(dòng)態(tài)平衡以及血容量和血壓。在肺部，在氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)的ENaCs調(diào)節(jié)呼吸道液的量和成分，并促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞中肺泡液體的清除。在小腸內(nèi)，ENaCs表達(dá)于對(duì)醛固酮敏感的結(jié)腸中，并且促進(jìn)吸收溝中的鈉和水。這表明，ENaCs對(duì)許多器官的生理作用是非常重要的，也暗示了他們的活動(dòng)必須被精確調(diào)控。在病理情況下，這將

4、變得尤為明顯。受損的ENaC的調(diào)節(jié)與人類疾病相關(guān)：在腎臟中，一種高血壓的遺傳形式被稱為利德爾的綜合征是由于基因突變，從而導(dǎo)致質(zhì)膜中ENaCs數(shù)量的增加。與之相比，突變引起的ENaC功能喪失導(dǎo)致鹽耗綜合征遺傳性假性低醛固酮癥 1型。在肺部，增加呼吸道ENaC的活性，可以促進(jìn)囊性纖維化肺疾病，然而，在遠(yuǎn)端肺ENaC的活動(dòng)衰退與肺水腫的形成有關(guān)。在腸道內(nèi)，ENaC的活性受損會(huì)導(dǎo)致腹瀉。發(fā)現(xiàn)新化合物，從而影響ENaC的活動(dòng)，與上述疾病的生物醫(yī)學(xué)研究密切相關(guān)，同時(shí)，也是發(fā)展一種新型藥理工具的先決條件。一個(gè)工廠，已深入調(diào)查研究了該化合物及其藥理潛力，發(fā)現(xiàn)是大蒜。在日常生活中，大蒜是一種被廣泛使用的調(diào)味品。

5、幾個(gè)世紀(jì)以來，大蒜已被確認(rèn)可以作為一種天然的藥物治療各種疾病，如感染或心血管疾病。大蒜能有這樣的益處，是因?yàn)槠渚哂锌寡趸雇蛔?，抗增殖，抗菌和免疫調(diào)節(jié)的性能。由于其抗菌作用，目前，大蒜正在被研究看其是否能夠治療囊腫性纖維化。在這方面，重要的是探討大蒜化合物對(duì)ENaC的假定影響，由于ENaC的活性較低會(huì)導(dǎo)致囊性纖維化的肺部疾病，并且減少呼吸道ENaC的活性，可以考慮作為治療本病的分子工具。大蒜及其化合物也被認(rèn)為，可以降低血脂，血漿粘度，血小板聚集，血壓等心血管疾病的危險(xiǎn)系數(shù)?；贓NaCs在腎臟和血壓的長(zhǎng)期調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系，可以假設(shè)，通過大蒜降低血壓，可能是與腎ENaC活性互動(dòng)的結(jié)果。這些例子表

6、明，各種不同的細(xì)胞和分子作用歸因于大蒜，這可能是病理?xiàng)l件下，也與放松管制的ENaC的活動(dòng)有關(guān)。因此，本文研究了大蒜及其主要化合物對(duì)ENaC活性的假定影響。2材料和方法2.1 ENaC的異源表達(dá)和微電極記錄如前所述，去濾泡膜的光滑的爪蟾卵母細(xì)胞生長(zhǎng)到階段V / VI時(shí)，用cRNA編碼培養(yǎng)用作人類ENaC的三個(gè)亞基、和。RNA濃度為5 ng /l每亞基，每個(gè)爪蟾卵母細(xì)胞被注入18.4nl的體積。注射后24-48小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。卵母細(xì)胞被放置在透明玻璃室內(nèi)，通過重力驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)灌注卵母細(xì)胞林格氏液，該溶液含有90mM的NaCl，1 mM的KCl，2mM的CaCl，10mM的4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙烷

7、磺酸鈉鹽（HEPES），pH7.4。玻璃毛細(xì)血管外徑為1.2毫米，被拉到微電極，并填充有1M的KCl。模電壓通過雙電極電壓鉗放大器鉗位到60mV，跨膜電流（IM）用條狀圖表記錄儀進(jìn)行連續(xù)記錄。2.2 準(zhǔn)備新鮮的大蒜萃取物生物有機(jī)大蒜購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的廚房打大蒜壓榨機(jī)，將5g新鮮的大蒜壓榨進(jìn)卵母細(xì)胞林格液中，將這個(gè)溶液冰浴1h，每10min旋轉(zhuǎn)一次。待提取物均勻分布后過濾，得到干凈、水溶的大蒜提取物。大蒜提取物必須每次實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備新鮮的，然后用卵母細(xì)胞格林溶液稀釋至工作濃度（1:100到1：1000）。2.3化學(xué)試劑和藥品的應(yīng)用DTT和L-半胱氨酸購(gòu)于Sigma公司，直接用于卵母細(xì)胞格林溶

8、液，濃度分別為10mM和20mM。實(shí)驗(yàn)記錄過程中，有相同濃度的甘露醇存在，以排除滲透的副作用。蒜素和DATS購(gòu)于LKT實(shí)驗(yàn)室，SAC，DAS，DADS，蒜素和阿米洛利購(gòu)于Sigma公司。SAC用卵母細(xì)胞格林溶液溶解至終濃度為1mM，蒜素用卵母細(xì)胞格林溶液溶解至濃度為1M， -20儲(chǔ)存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋為1mM。蒜素乙醇原液濃度為10mM，-80儲(chǔ)存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋為100M，與從5g大蒜中提取的提取物濃度近似相等。DAS和DADS每次實(shí)驗(yàn)前由原液制備，用DMSO溶解。DATS的制備是由1M的原液用乙醇稀釋而來，原液儲(chǔ)存于-80。所有的DADS的終濃度都為1mM。實(shí)驗(yàn)時(shí)有些加了適當(dāng)?shù)娜軇―MSO和乙醇）

9、幫助溶解。所有的藥物都是在實(shí)驗(yàn)前不久用卵母細(xì)胞格林溶液新鮮配制的。在卵母細(xì)胞中表達(dá)的ENaC通過重力驅(qū)動(dòng)灌注系統(tǒng)灌注藥物。大蒜素和DATS實(shí)驗(yàn)，將含藥的溶液注入卵母細(xì)胞的腔中，再停止灌注（由于數(shù)量藥物有限）。孵育10min，將阿米洛利灌注到腔內(nèi)，用藥物溶劑乙醇控制進(jìn)行。2.4數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)值表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照試驗(yàn)的平均值，采用學(xué)生T測(cè)試，沒有對(duì)照實(shí)驗(yàn)的，采用未對(duì)照的學(xué)生T測(cè)試。當(dāng)兩個(gè)以上的團(tuán)體進(jìn)行了比較，采用單向方差邦弗朗尼的多次對(duì)比試驗(yàn)。用微軟excel 2003或Graphpad 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)量表明，從至少兩個(gè)和n個(gè)不同的青蛙卵母細(xì)胞作為每個(gè)實(shí)驗(yàn)的供體。P0.

10、05的被認(rèn)為是重要的，數(shù)據(jù)后面以星號(hào)標(biāo)記。3結(jié)果3.1大蒜提取物抑制ENaC通過微電極記錄非洲爪蟾卵母細(xì)胞共同表達(dá)的三個(gè)亞基、和來研究大蒜對(duì)人體ENaC的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)開始前，卵母細(xì)胞用特定的ENaC抑制劑阿米洛利（10M）灌注，洗脫阿米洛利后，跨膜電流（IM）增加，阿米洛利存在和被洗脫后IM的差值代表ENaC的介導(dǎo)阿米洛利敏感電流（Iami）。大蒜提取物的應(yīng)用大大減少了IM值，從1.360.27A到0.340.09A，（n= 11，P 0.05），10min后達(dá)到穩(wěn)定條件。隨后增加阿米洛利來評(píng)估剩余的Iami，在大蒜提取物存在下的Iami與基線Iami相比大量減少。由于大蒜的作用相當(dāng)慢，故而

11、用不暴露大蒜提取物的ENaC表達(dá)卵母細(xì)胞進(jìn)行了相應(yīng)的控制。一般來說，表達(dá)于卵母細(xì)胞的ENaCIM隨著時(shí)間的推移緩慢下降，在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的ENaCs中，這是一個(gè)眾所周知的現(xiàn)象。因此，10分鐘后的Iami分?jǐn)?shù)總是歸于基準(zhǔn)Iami。與沒有大蒜提取物控制記錄相比，有大蒜提取物的Iami顯著降低64。大蒜提取物的作用是不可逆的，因?yàn)樵谙闯?0min后Iami沒有增加。在大蒜提取物存在下，標(biāo)準(zhǔn)Iami是0.290.04，洗出10分鐘后是0.220.03（n =9，P 0.05）。此外，大蒜提取物的作用呈劑量依賴性，在1:100至1:1000內(nèi)稀釋。在阿米洛利存在下，大蒜提取物的作用被很大程度的阻塞。之

12、前的IM值為0.130.05A，暴露于大蒜提取物10min后，IM值為0.080.04A（n =7，P 0.05）。大蒜提取物對(duì)原本的卵母細(xì)胞也無(wú)作用。總之，這些數(shù)據(jù)表明，大蒜提取物有劑量依賴性和不可逆抑制爪蟾卵母細(xì)胞異源表達(dá)的ENaCs。3.2大蒜提取物中的硫醇活性物質(zhì)參與ENaC的抑制隨后進(jìn)行了調(diào)查，大蒜中的哪種化合物負(fù)責(zé)所觀察到的ENaC的抑制，大蒜中含有多種有機(jī)硫化合物，這可能會(huì)影響ENaC的活性通過與半胱氨酸殘基通道的相互作用，在通道門控中發(fā)揮了重要作用。這個(gè)假設(shè)一致，應(yīng)清理大蒜提取物的效果，通過高濃度自由L-半胱氨酸。20mM的L-半胱氨酸存在時(shí)，大蒜提取物失去作用。用半胱氨酸改性

13、試劑DTT作用時(shí)也得到了類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，源于大蒜的硫醇活性可能化合物參與了對(duì)ENaC的抑制作用。與之相比，當(dāng)ENaC被大蒜提取物抑制后，用DTT作用，阿米洛利敏感電流沒有顯著增加，說明接觸大蒜提取物后，DTT不能回復(fù)ENaC的活性。3.3大蒜化合物蒜素抑制ENaC大蒜中的典型有機(jī)硫化合物是S-烯丙基-L-半胱氨酸，蒜氨酸，蒜素，二烯丙基硫化物。蒜氨酸位于大蒜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并通過蒜氨酸經(jīng)酶轉(zhuǎn)化成蒜素，然而蒜氨酸經(jīng)酶位于細(xì)胞的液泡中。因此，需要粉碎大蒜，讓蒜氨酸經(jīng)酶與蒜氨酸接觸引發(fā)轉(zhuǎn)換成蒜素。蒜素和它的分解衍生物二烯丙基硫化物（DAS，DADS和DATS），使它有了獨(dú)特的刺鼻的氣味。按

14、它們對(duì)ENaC的抑制能力，對(duì)這些化合物進(jìn)行了篩選。S-烯丙基-L-半胱氨酸，蒜氨酸和二烯丙基硫化物對(duì)ENaC沒有抑制作用。然而，來源于大蒜提取物的目前的濃度（100M）的蒜素導(dǎo)致ENaC活性銳減，與普通大蒜提取物抑制相比，減少了77%?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，大蒜中的巰基活性化合物，有機(jī)硫化合物，如大蒜素，抑制了ENaC。4.討論這里所給出的數(shù)據(jù)表明，大蒜的劑量依賴性和不可逆的抑制表達(dá)于爪蟾卵母細(xì)胞的ENaCs，這種抑制作用對(duì)巰基改性劑是敏感的，巰基改性劑可以通過目前濃度的大蒜中的有機(jī)硫化合物蒜素模仿。大蒜素是一種高活性物質(zhì)，能迅速通過細(xì)胞膜擴(kuò)散，并已被證明與離子通道，如TRPA1，或細(xì)胞內(nèi)的含巰

15、基的分子，如谷胱甘肽，相互作用。通過大蒜素抑制酶，如蛋白酶，對(duì)半胱氨酸殘基進(jìn)行改性。巰基群體對(duì)ENaC的功能也是重要的，ENaC的每個(gè)亞基包含有細(xì)胞外loop環(huán)中的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞內(nèi)C和N-末端的半胱氨酸殘基。特別是細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸是通道功能的關(guān)鍵，因?yàn)橥蛔兓蚋男赃@些殘基能抑制ENaC的活性。如前所述，可能是通過蒜素改性半胱氨酸最終導(dǎo)致了對(duì)ENaC的抑制。這個(gè)現(xiàn)象是被實(shí)驗(yàn)事實(shí)所證實(shí)的，當(dāng)有過量巰基組存在時(shí)，大蒜提取物失去作用，L-半胱氨酸和DTT實(shí)驗(yàn)也可以證明。此外，大蒜的作用不能被細(xì)胞外使用DTT所逆轉(zhuǎn)，這點(diǎn)就使細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸殘基改性更利于細(xì)胞外的loop環(huán)。通過大蒜素改性ENaC亞基

16、細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸殘基，代表大蒜如何可降低ENaC活性的分子機(jī)制。另外，大蒜素可通過修飾酶，反過來調(diào)節(jié)ENaC的活動(dòng)，這將與大蒜作用的慢時(shí)程一致。幾個(gè)世紀(jì)以來，大蒜是被公認(rèn)的治療各種疾病的天然藥物，包括心血管疾病。有益效果是由于大蒜有減少心血管疾病，如血脂，血壓，血漿粘度和血小板聚集等危險(xiǎn)因素的能力。尤其是大蒜對(duì)血壓調(diào)節(jié)的影響，是我們正在進(jìn)行研究的一個(gè)主要焦點(diǎn)。有各種各樣的研究調(diào)查了大蒜對(duì)血壓和高血壓的作用，包括臨床試驗(yàn)。然而，對(duì)于大蒜是否確實(shí)降低了血壓或高血壓，是很難做出決定性結(jié)論的，這主要是由于臨床試驗(yàn)方法的缺陷和缺乏詳細(xì)的分子數(shù)據(jù)，而缺乏的這些正是解釋假定的大蒜具有抗高血壓作用所需要的。大

17、蒜化合物，如蒜素或它的代謝產(chǎn)物對(duì)腎臟內(nèi)ENaC的干擾將會(huì)減少鈉和水的滯留。這可以解釋大蒜治療各種疾病的有益作用，如與受損鈉和水平衡有關(guān)的鹽依賴性高血壓，大蒜可作為一種天然療法。然而，重要的一點(diǎn)是大蒜的生物利用率。據(jù)報(bào)道，在所篩選的化合物中，只有蒜素能夠模擬大蒜的作用，而代謝產(chǎn)物蒜素，二烯丙基硫化物卻沒有這樣的效果。由于大蒜素的反應(yīng)活性高，其在體內(nèi)的半衰期極短，有關(guān)蒜素在大蒜內(nèi)負(fù)責(zé)的生物效應(yīng)有相當(dāng)大的疑問。蒜氨酸酶，這種酶負(fù)責(zé)蒜素的形成，可能通過胃液的pH值被滅活。相比之下，大蒜素在胃液中穩(wěn)定，但在血液中不穩(wěn)定。此外，攝入市售大蒜產(chǎn)品后，人體血液中的大蒜素是檢測(cè)不到的。這些數(shù)據(jù)表明，大蒜素是不太

18、可能成為大蒜中的生物活性化合物，而且蒜素是否能夠到達(dá)原尿和最終的ENaC還是可疑的。因此，必須明確指出，雖然大蒜的ENaC抑制可能意味著假定其抗高血壓作用機(jī)制，生物化學(xué)突出了大蒜介導(dǎo)的ENaC抑制，不利于有關(guān)的生理觀察。然而，大蒜素的代謝物除二烯丙基硫化物以外，可能存在于體液并且影響腎臟ENaCs。不論其生理意義，僅發(fā)現(xiàn)大蒜素抑制ENaC也是藥物化學(xué)的一個(gè)有趣的出發(fā)點(diǎn)。大蒜素是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的，結(jié)構(gòu)可以修飾的，以提高其生物利用度的有機(jī)硫化合物。例如，這樣的修飾可以旨在提高在胃腸道通行的穩(wěn)定性和增加腎臟的滲透性。另外一個(gè)挑戰(zhàn)是將大蒜素精確的運(yùn)送到特定的細(xì)胞和組織，以抵消由于其高活性帶來的毒副作用。在這方面，值得注意的是米