WESTERNBLOT操作步驟圖

1、WESTERN BLOTTING過程圖解過程圖解 圖中綠色的是夾玻璃片的架子玻璃板對(duì)齊后放入架中，把兩側(cè)的夾子卡緊。要使短玻璃靠外，長玻璃靠內(nèi)。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。 圖示兩塊玻璃板放在一個(gè)架子上。配10分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。） 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠

2、充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面方法配4的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。如果有氣泡，可以用濾紙條將其吸出來 均勻插入梳子 梳子已經(jīng)插好。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。 濃縮膠干后，用手拿住梳子的兩邊均勻用力，拔起梳子 將玻璃板從夾子上取下，用水沖一下將玻璃板放入電泳槽中。小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外 插入另一塊玻璃板，也是小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊

3、一塊塑料板且有字的一面面向外 兩塊玻璃板都放好后夾緊（拇指按下夾子） 放入電泳槽中向內(nèi)槽中加電泳緩沖液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，就要重新把玻板查好，使內(nèi)外不交通。 電泳液至少要漫過內(nèi)側(cè)的小玻璃板。 測(cè)完蛋白含量后，所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5SDS 上樣緩沖液至終濃度為1。（上樣總體積一般不超過15l，加樣孔的最大限度可加20l樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性。加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品

4、溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染電泳時(shí)間一般1-2 h，電壓為100V較好，也可用60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。 取出轉(zhuǎn)移槽 取下玻璃板 兩塊玻璃板都已經(jīng)取下要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。） 將濃縮膠（濃縮膠影響操作）和分離膠上不用的部分切去在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜，將夾子打開使白的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡 。 在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊

5、在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。依次加膜、加膠，再在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。 合起夾子將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。 電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。 加上轉(zhuǎn)移緩沖液 蓋上蓋子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋 電轉(zhuǎn)移200mA 2-3h后，打開蓋子，取出夾子打開夾子，取出膜，如果所用marker是預(yù)染marker,可見marker已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上,如果不是預(yù)染marker，可以把膜轉(zhuǎn)完后將膜用1麗春紅染液染5min，于脫色搖床上搖，然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾干備用。 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中 室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。 按所需稀釋濃度滴加一抗（直接加在封閉液里）4 過夜或37 3h