第7章-生物制品

1、疫苗疫苗l疫苗疫苗的現(xiàn)代的現(xiàn)代定義定義為：一切通過注射或黏膜為：一切通過注射或黏膜途徑接種，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對特定致途徑接種，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對特定致病原的特異性抗體或細(xì)胞免疫，從而使機病原的特異性抗體或細(xì)胞免疫，從而使機體獲得體獲得保護或消滅該致病原保護或消滅該致病原能力的生物制能力的生物制品統(tǒng)稱為疫苗，包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸、品統(tǒng)稱為疫苗，包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸、活載體或感染因子?；钶d體或感染因子。l疫苗按生物來源一般分疫苗按生物來源一般分細(xì)菌及類毒素疫苗、細(xì)菌及類毒素疫苗、病毒性疫苗、蛋白疫苗、核酸疫苗病毒性疫苗、蛋白疫苗、核酸疫苗四大類。四大類。1 接種目的及作用l接種目的接種目的

2、 防止病原體進入機體防止病原體進入機體 建立抗感染免疫建立抗感染免疫l口服或注射疫苗口服或注射疫苗 激發(fā)宿主產(chǎn)生抗病原體的抗體激發(fā)宿主產(chǎn)生抗病原體的抗體 暴露于病原體也不會生病暴露于病原體也不會生病 進入機體的病原體被抗體失活進入機體的病原體被抗體失活2 疫苗的種類l 從疫苗研制技術(shù)又可將疫苗分為從疫苗研制技術(shù)又可將疫苗分為傳統(tǒng)疫苗傳統(tǒng)疫苗和和新新型疫苗型疫苗兩大類。兩大類。l2.1傳統(tǒng)疫苗傳統(tǒng)疫苗l 1）疫苗）疫苗 （1）活疫苗：減毒活疫苗（卡介苗）活疫苗：減毒活疫苗（卡介苗） （2）死疫苗（百日咳、霍亂等）死疫苗（百日咳、霍亂等）l 2）類毒素）類毒素 破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素破傷風(fēng)類毒素

3、、白喉類毒素2.2 新型疫苗新型疫苗l 1）亞單位疫苗）亞單位疫苗 一類保留病原體中有效免疫原成分，而除去無效成一類保留病原體中有效免疫原成分，而除去無效成分和有毒成分的疫苗。分和有毒成分的疫苗。 如：乙肝亞單位疫苗如：乙肝亞單位疫苗l 2）化學(xué)疫苗）化學(xué)疫苗 用化學(xué)方法提取病原體中有效免疫原成分制成的化用化學(xué)方法提取病原體中有效免疫原成分制成的化學(xué)純疫苗，比亞單位疫苗更為簡單。學(xué)純疫苗，比亞單位疫苗更為簡單。 如：肺炎鏈球菌莢膜多糖如：肺炎鏈球菌莢膜多糖l 3）多肽疫苗）多肽疫苗 人工合成的高免疫原性多肽片段制成的疫苗。人工合成的高免疫原性多肽片段制成的疫苗。 如：如： 乙型肝炎表面抗原的各

4、種合成肽段乙型肝炎表面抗原的各種合成肽段l 4）基因工程疫苗）基因工程疫苗 利用基因工程構(gòu)建重組基因序列，表達免疫原性強、利用基因工程構(gòu)建重組基因序列，表達免疫原性強、無毒性的多肽制成的疫苗。無毒性的多肽制成的疫苗。 如：乙型肝炎基因工程疫苗如：乙型肝炎基因工程疫苗l 5）DNA疫苗疫苗 用編碼抗原基因制成的疫苗。用編碼抗原基因制成的疫苗。 如流感病毒核蛋白如流感病毒核蛋白DNA疫苗疫苗l 通常也習(xí)慣地將通常也習(xí)慣地將遺傳重組疫苗、合成肽疫苗和抗獨特遺傳重組疫苗、合成肽疫苗和抗獨特型抗體疫苗型抗體疫苗包括在新型疫苗范疇。包括在新型疫苗范疇。 3 疫苗的基本成分、性質(zhì)和特征l 3.1 疫苗的基本

5、成分疫苗的基本成分 疫苗的基本成分疫苗的基本成分包括包括抗原、佐劑、防腐劑、抗原、佐劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、滅活劑穩(wěn)定劑、滅活劑及其他活性成分。及其他活性成分。 抗原抗原，是疫苗最主要的有效活性成分，它，是疫苗最主要的有效活性成分，它決定了疫苗的特異免疫原性。構(gòu)成抗原的三個決定了疫苗的特異免疫原性。構(gòu)成抗原的三個基本條件：基本條件：異物性異物性、特異性特異性和一定的和一定的理化特性理化特性。l 可用作抗原的生物活性物質(zhì)可用作抗原的生物活性物質(zhì)有：有：滅活病毒或細(xì)菌、滅活病毒或細(xì)菌、活病毒活病毒或細(xì)菌通過實驗室多次傳代得到的或細(xì)菌通過實驗室多次傳代得到的減毒株、減毒株、病毒或菌體提純物、有效蛋白成分

6、、類毒素、細(xì)病毒或菌體提純物、有效蛋白成分、類毒素、細(xì)菌多糖、合成多肽菌多糖、合成多肽以及近年來發(fā)展以及近年來發(fā)展DNA疫苗所用疫苗所用的的核酸核酸等。等。l 佐劑佐劑，能，能增強增強抗原的抗原的特異性免疫應(yīng)答特異性免疫應(yīng)答。目前常用。目前常用的有的有鋁佐劑鋁佐劑和和油制佐劑油制佐劑。l 3.2 疫苗的基本性質(zhì)疫苗的基本性質(zhì) 包括包括免疫原性、安全性、穩(wěn)定性免疫原性、安全性、穩(wěn)定性。l 免疫原性免疫原性：指疫苗接種進入機體后引起機體產(chǎn)生：指疫苗接種進入機體后引起機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的強度和持續(xù)時間。免疫應(yīng)答的強度和持續(xù)時間。l 影響的因素影響的因素包括機體的因素和疫苗的因素。從疫包括機體的因素和疫

7、苗的因素。從疫苗的角度看是由疫苗的抗原決定的。包括苗的角度看是由疫苗的抗原決定的。包括抗原的抗原的強弱、大小和穩(wěn)定性以及抗原的理化性質(zhì)強弱、大小和穩(wěn)定性以及抗原的理化性質(zhì)。4 疫苗制備的基本過程l 疫苗因種類不同，其制備方法也不相同，但總的來疫苗因種類不同，其制備方法也不相同，但總的來說，說，經(jīng)典疫苗制備經(jīng)典疫苗制備的基本過程包括：的基本過程包括：選擇適宜的培選擇適宜的培養(yǎng)基或細(xì)胞，進行菌、毒株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，養(yǎng)基或細(xì)胞，進行菌、毒株大量繁殖，收集培養(yǎng)物，提純，半成品檢定，稀釋，分裝，成品檢定提純，半成品檢定，稀釋，分裝，成品檢定。l 基因工程技術(shù)使疫苗研制方法發(fā)生了革命性的變化。疫苗制

8、備工藝流程疫苗制備工藝流程l4.1 病毒類疫苗制造方法病毒類疫苗制造方法4.1.1毒種的選擇和減毒毒種的選擇和減毒l 毒株必須滿足的條件毒株必須滿足的條件l 抗原性抗原性l 典型形態(tài)，感染特定組織典型形態(tài)，感染特定組織l 人工繁殖，不產(chǎn)生毒素人工繁殖，不產(chǎn)生毒素l 無毒力回復(fù)無毒力回復(fù) 不被病毒感染不被病毒感染4.1.2 病毒繁殖病毒繁殖l （1）活體動物培養(yǎng)：牛痘）活體動物培養(yǎng)：牛痘 牛皮下，乙腦牛皮下，乙腦 鼠腦等。鼠腦等。l （2）雞胚培養(yǎng)，較動物管理方便，易受支原體，）雞胚培養(yǎng)，較動物管理方便，易受支原體，沙門菌污染。沙門菌污染。l （3）組織培養(yǎng)，廣泛用于病毒培養(yǎng)。）組織培養(yǎng)，廣泛用

9、于病毒培養(yǎng)。l （4）細(xì)胞培養(yǎng)。）細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型l 貼附生長型細(xì)胞貼附生長型細(xì)胞l 為能附著于底物（支持物）表面生長的細(xì)胞。包括非淋巴為能附著于底物（支持物）表面生長的細(xì)胞。包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞都屬于這一類型。當(dāng)組織的細(xì)胞和許多異倍體體系的細(xì)胞都屬于這一類型。當(dāng)這類細(xì)胞從活體體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)時，必須貼附于底物這類細(xì)胞從活體體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)時，必須貼附于底物才能生長。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型和成纖維細(xì)胞型。才能生長。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型和成纖維細(xì)胞型。VEGF929兔腎原代細(xì)胞l 懸浮生長型細(xì)胞懸浮生長型細(xì)胞l 少數(shù)細(xì)

10、胞類型在體外培養(yǎng)是不需要附著于底物而于懸浮狀少數(shù)細(xì)胞類型在體外培養(yǎng)是不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長，來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤態(tài)下即可生長，來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞均屬于這一類型。細(xì)胞（包括雜交瘤細(xì)胞）和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞均屬于這一類型。這些細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中生長良好，可以是單個細(xì)胞或細(xì)小這些細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中生長良好，可以是單個細(xì)胞或細(xì)小的細(xì)胞團，細(xì)胞呈圓形。細(xì)胞懸浮生長于培養(yǎng)基中，細(xì)胞的細(xì)胞團，細(xì)胞呈圓形。細(xì)胞懸浮生長于培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長空間大，具有能夠提供增殖生長空間大，具有能夠提供增殖大量細(xì)胞、傳代方便、易大量細(xì)胞、傳代方便、易于

11、收獲于收獲的優(yōu)點。的優(yōu)點。SP20l 維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的最佳條件最佳條件 在大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的過程中，最在大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的過程中，最根本的是使細(xì)胞的培養(yǎng)條件達到最優(yōu)化，根本的是使細(xì)胞的培養(yǎng)條件達到最優(yōu)化，盡可能消除或減輕環(huán)境對細(xì)胞的影響，維盡可能消除或減輕環(huán)境對細(xì)胞的影響，維持細(xì)胞持細(xì)胞高存活力高存活力和和高效表達高效表達，同時又要充，同時又要充分考慮細(xì)胞表達產(chǎn)物的后續(xù)純化。分考慮細(xì)胞表達產(chǎn)物的后續(xù)純化。l 配制細(xì)胞生長最適合的培養(yǎng)基配制細(xì)胞生長最適合的培養(yǎng)基 常用維持液和生長液常用維持液和生長液 Eagle、RPM1640,DEME等作為維持液，加入牛血清為等作為維持

12、液，加入牛血清為生長液。生長液。l 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 影響細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素有影響細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素有:CO2、溶氧、溶氧(DO)、溫度、溫度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基成分等。成分等。l細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境l最適最適CO2水平為水平為4%10%，l溶氧維持在溶氧維持在20%50%，l溫度大多數(shù)在溫度大多數(shù)在37，lpH值在值在7.07.4之間。之間。l控制細(xì)菌污染，加入青霉素、鏈霉素控制細(xì)菌污染，加入青霉素、鏈霉素l培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間24天。天。l葡萄糖是細(xì)胞培養(yǎng)過程中主要的能量來源，必須葡萄糖是細(xì)胞培養(yǎng)過程中主要的

13、能量來源，必須維持在一定水平。維持在一定水平。l4.1.3 疫苗的滅活疫苗的滅活l 原則：充分破壞疫苗的毒力，盡量減少疫苗免疫力損失。原則：充分破壞疫苗的毒力，盡量減少疫苗免疫力損失。l 含有大量動物組織的疫苗，含有大量動物組織的疫苗，0.20.4的甲醛或酚溶液；的甲醛或酚溶液；細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗，0.02-0.05甲醛甲醛l 滅活的溫度和時間：生物學(xué)性質(zhì)和熱穩(wěn)定性滅活的溫度和時間：生物學(xué)性質(zhì)和熱穩(wěn)定性l4.1.4 疫苗的純化疫苗的純化l 去除存在的動物組織，降低接種不良反應(yīng)。去除存在的動物組織，降低接種不良反應(yīng)。l4.1.5 凍干凍干l 升華，不使疫苗融解。疫苗穩(wěn)定性提高升華，不

14、使疫苗融解。疫苗穩(wěn)定性提高1倍以上。倍以上。乙型肝炎疫苗的制備l 乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）屬嗜肝屬嗜肝DNA病病毒科（毒科（hepadnaviridae）。）。 l HBV的發(fā)現(xiàn)源于表面抗原的研究。的發(fā)現(xiàn)源于表面抗原的研究。 1963年年Blumberg首先在澳大利亞土著人血清中發(fā)現(xiàn)一種新抗原，稱為澳大首先在澳大利亞土著人血清中發(fā)現(xiàn)一種新抗原，稱為澳大利亞抗原（利亞抗原（Australia antigen）；直至）；直至1968年確定這種年確定這種抗原與血清型肝炎密切相關(guān)，稱為肝炎相關(guān)抗原抗原與血清型肝炎密切相關(guān)，稱為肝炎相關(guān)抗原（hepatit

15、is associated antigen，HAA）；）；1970年年D.S. Dane在肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)具有傳染性的顆粒，即在肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)具有傳染性的顆粒，即Dane顆粒（顆粒（Danes particle）。從而）。從而HBV被確認(rèn)。被確認(rèn)。l HBV是是乙型肝炎乙型肝炎病原體，主要經(jīng)輸血、注射、性行為病原體，主要經(jīng)輸血、注射、性行為和母嬰傳播。起病徐緩，部分患者可轉(zhuǎn)為慢性，少數(shù)還可和母嬰傳播。起病徐緩，部分患者可轉(zhuǎn)為慢性，少數(shù)還可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。導(dǎo)致肝硬化和肝癌。乙肝病毒發(fā)病區(qū)域乙型肝炎病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)與結(jié)構(gòu) 完整的完整的HBV顆粒亦稱顆粒亦稱Dane顆粒，直徑為顆粒，直徑為

16、42nm，具有雙層核殼結(jié)構(gòu)：具有雙層核殼結(jié)構(gòu)：核心顆粒核心顆粒：直徑為：直徑為28nm。 顆粒內(nèi)部：顆粒內(nèi)部：DNA和和DNA多聚酶多聚酶。 顆粒表面（內(nèi)衣殼）：含顆粒表面（內(nèi)衣殼）：含有有HBcAg 和和HBeAg 。外殼（包膜）外殼（包膜）：厚：厚7nm。 脂質(zhì)雙層：含有脂質(zhì)雙層：含有HBsAg、PHSAr 和和PreSAg蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)乙肝病毒傳染途徑乙肝病毒檢測HBV感染血清標(biāo)志及其臨床意義感染血清標(biāo)志及其臨床意義HBsAgHBeAg抗抗HBc 抗抗HBe抗抗HBs結(jié)結(jié) 果果 解解 釋釋IgMIgG-+感染過感染過HBV或接種過乙肝疫苗或接種過乙肝疫苗,有免疫力有免疫力+-/+-肝功正常

17、為無癥狀攜帶者肝功正常為無癥狀攜帶者;肝功肝功異常為正患乙肝異常為正患乙肝;+-+-（小三陽）正患乙肝（小三陽）正患乙肝,肝炎趨向肝炎趨向好轉(zhuǎn)，有傳染性好轉(zhuǎn)，有傳染性+/-+-正患肝炎正患肝炎,或趨于恢復(fù)，有傳染或趨于恢復(fù)，有傳染性性+/-（大三陽）正患乙肝（大三陽）正患乙肝,病毒復(fù)制病毒復(fù)制,傳染性強傳染性強-+/-+乙型肝炎恢復(fù)期乙型肝炎恢復(fù)期乙肝疫苗的制備血源疫苗乙肝疫苗的制備血源疫苗 特點特點: (1)血源取得困難血源取得困難; (2)疫苗需經(jīng)安全試驗疫苗需經(jīng)安全試驗,故費用大故費用大,生產(chǎn)周期達生產(chǎn)周期達65周周. (3)現(xiàn)已淘汰。現(xiàn)已淘汰。乙肝疫苗的制備人工合成多肽疫苗乙肝疫苗的制

18、備人工合成多肽疫苗l 工藝過程工藝過程:人工合成人工合成HBsAg的的P25多肽多肽,并在并在124與與137位半胱氨酸殘基之間引入位半胱氨酸殘基之間引入-S-S-,使成環(huán)狀多肽使成環(huán)狀多肽,用其免疫動物后用其免疫動物后,50%出現(xiàn)抗體應(yīng)答。出現(xiàn)抗體應(yīng)答。l 特點特點:純凈純凈,不會污染其他病毒不會污染其他病毒,無傳染性無傳染性,原材料來原材料來源方便源方便,但目前生產(chǎn)成本高但目前生產(chǎn)成本高,難以大量生產(chǎn)。難以大量生產(chǎn)。乙肝疫苗的制備基因工程疫苗乙肝疫苗的制備基因工程疫苗工藝路線工藝路線:l(1) 將將HBV的的DNA片段插入到質(zhì)粒并引入片段插入到質(zhì)粒并引入到到E.coli中中,使其復(fù)制表達抗

19、原物質(zhì)。使其復(fù)制表達抗原物質(zhì)。l(2) 將將HBV的的DNA片段插入到牛痘病毒片段插入到牛痘病毒,再再由此病毒重組體感染細(xì)胞由此病毒重組體感染細(xì)胞,可分泌可分泌HBsAg。l(3)用一含用一含HbsAg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中國倉鼠卵巢的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中國倉鼠卵巢細(xì)胞細(xì)胞(CHO),在該細(xì)胞中表達在該細(xì)胞中表達HbsAg蛋白蛋白,釋釋放于培養(yǎng)液中放于培養(yǎng)液中,從培養(yǎng)液中提純抗原蛋白。從培養(yǎng)液中提純抗原蛋白。 目前大規(guī)模生產(chǎn)的表達系統(tǒng)有釀酒酵母、目前大規(guī)模生產(chǎn)的表達系統(tǒng)有釀酒酵母、畢赤酵母和漢遜酵母等基因工程疫苗，其畢赤酵母和漢遜酵母等基因工程疫苗，其次為次為CHO細(xì)胞基因工程疫苗，還有細(xì)胞基因工程疫苗，還有HB

20、sAg+PreS2或或HBsAg+PreS1+ PreS2（CHO細(xì)胞和酵母表達系統(tǒng)）。細(xì)胞和酵母表達系統(tǒng)）。4.2 細(xì)菌類疫苗和類毒素的一般制造方法細(xì)菌類疫苗和類毒素的一般制造方法l細(xì)菌類疫苗和類毒素均由細(xì)菌培養(yǎng)開始，細(xì)菌類疫苗和類毒素均由細(xì)菌培養(yǎng)開始， 制備的主要程序相似。制備的主要程序相似。 細(xì)菌類疫苗對菌體進一步加工細(xì)菌類疫苗對菌體進一步加工 類毒素對細(xì)菌分泌的外毒素加工類毒素對細(xì)菌分泌的外毒素加工疫苗和類毒素制備工藝流程4.2.1 菌種的選擇菌種的選擇l 抗原性抗原性l 典型形態(tài)，培養(yǎng)特性和理化特性典型形態(tài)，培養(yǎng)特性和理化特性l 易于在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)易于在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)l 培養(yǎng)過

21、程中毒性小或無毒力回復(fù)培養(yǎng)過程中毒性小或無毒力回復(fù)l 制備類毒素時，在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量的制備類毒素時，在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量的典型毒素典型毒素l 4.2.2培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求l碳、氮源和無機鹽等必需外，有時需添加生長因子。碳、氮源和無機鹽等必需外，有時需添加生長因子。l結(jié)核桿菌以甘油為碳源，百日咳桿菌需要谷氨酸，胱氨結(jié)核桿菌以甘油為碳源，百日咳桿菌需要谷氨酸，胱氨酸為氮源。酸為氮源。l 4.2.3 培養(yǎng)條件控制培養(yǎng)條件控制 氧分壓、溫度、氧分壓、溫度、pH、避光、滲透壓、避光、滲透壓l 4.2.4 殺菌殺菌l徹底殺死細(xì)菌不影響防病效力徹底殺死細(xì)菌不影響防病效力l 4.2.5 稀釋

22、、分裝和凍干稀釋、分裝和凍干l含防腐劑的含防腐劑的NS稀釋，無菌分裝。稀釋，無菌分裝?？ń槊缫呙缟a(chǎn)工藝卡介苗疫苗生產(chǎn)工藝l1.簡介：簡介：l牛型結(jié)核桿菌牛型結(jié)核桿菌l卡默德和介蘭經(jīng)歷卡默德和介蘭經(jīng)歷13年獲得減毒株年獲得減毒株l2.制備工藝制備工藝l表面培養(yǎng)表面培養(yǎng)l培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度37-39，時間，時間10-12d,生產(chǎn)的卡生產(chǎn)的卡介苗活力高，用培養(yǎng)介苗活力高，用培養(yǎng)6-8d的幼齡苗，有利的幼齡苗，有利于制備凍干品。于制備凍干品。白喉疫苗的生產(chǎn)工藝白喉疫苗的生產(chǎn)工藝l1.簡介簡介l1923年年Roman制得白喉毒素的類毒素制得白喉毒素的類毒素l2.生產(chǎn)工藝生產(chǎn)工藝l菌種：高效價毒素，菌種：

23、高效價毒素，1896年分離的年分離的Pw8l培養(yǎng)產(chǎn)毒培養(yǎng)產(chǎn)毒l產(chǎn)毒培養(yǎng)基：胰酶牛肉消化液培養(yǎng)基產(chǎn)毒培養(yǎng)基：胰酶牛肉消化液培養(yǎng)基l培養(yǎng)：深層培養(yǎng)法，溫度，培養(yǎng)：深層培養(yǎng)法，溫度，pH，碳源，碳源l脫毒脫毒 l毒素經(jīng)甲醛加溫處理后，去除毒性而保留毒素經(jīng)甲醛加溫處理后，去除毒性而保留其抗原性，形成其抗原性，形成類毒素類毒素l溫度、溫度、pH、甲醛濃度及毒素自身的影響、甲醛濃度及毒素自身的影響l脫毒后精制和精制后脫毒脫毒后精制和精制后脫毒la.原制毒素脫毒原制毒素脫毒l質(zhì)量穩(wěn)定，毒素逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象少；但含有大量質(zhì)量穩(wěn)定，毒素逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象少；但含有大量培養(yǎng)基殘留物質(zhì)，進一步提純有困難，脫培養(yǎng)基殘留物質(zhì)，進一步提純

24、有困難，脫毒體積大，不利于操作。毒體積大，不利于操作。lb.精制毒素脫毒精制毒素脫毒l脫毒體積小，工藝緊湊利于操作，且可獲脫毒體積小，工藝緊湊利于操作，且可獲得高純度制品。但易發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。得高純度制品。但易發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。l白喉類毒素的精制白喉類毒素的精制l去除細(xì)菌代謝的產(chǎn)物及培養(yǎng)基中殘留的有去除細(xì)菌代謝的產(chǎn)物及培養(yǎng)基中殘留的有機物、無機鹽等非特異性雜質(zhì)，提高白喉機物、無機鹽等非特異性雜質(zhì)，提高白喉類毒素的純度，降低接種副反應(yīng)。類毒素的純度，降低接種副反應(yīng)。l活性炭、硫酸銨分段沉淀法活性炭、硫酸銨分段沉淀法5核酸疫苗核酸疫苗l概念概念l 它是利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白它是利

25、用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白的的外源基因外源基因（DNA）與）與質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組后，直接導(dǎo)入后，直接導(dǎo)入動動物細(xì)胞物細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。以達到預(yù)防和治療疾病的目的。發(fā)展歷史l 1990年年Wolff等偶然發(fā)現(xiàn)給小鼠肌肉注射外源性重組質(zhì)粒等偶然發(fā)現(xiàn)給小鼠肌肉注射外源性重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達所編碼后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達所編碼蛋白。蛋白。l 1991年年Willams等發(fā)現(xiàn)外

26、源基因輸入體內(nèi)的表達產(chǎn)物可誘等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。l 1992年年Tang等將表達人生長激素基因的質(zhì)粒等將表達人生長激素基因的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。念。l 1993年年Ulmer等證實小鼠肌肉注射含有編碼甲型流感病毒等證實小鼠肌肉注射含有編碼甲型流感病毒核蛋白（核蛋白（NP）的重組質(zhì)粒后，可有效地保護小鼠抗不同）的重組質(zhì)粒后，可有效地保護小鼠抗不同亞型、分離時間相隔亞型、分離時間相隔34年的流感病毒的攻擊。隨后的大量年的流感病毒的攻擊。隨后的大量

27、動物實驗都說明在合適的條件下，動物實驗都說明在合適的條件下，DNA接種后既能產(chǎn)生細(xì)接種后既能產(chǎn)生細(xì)胞免疫又能引起體液免疫。胞免疫又能引起體液免疫。l 1994年在年在日內(nèi)瓦日內(nèi)瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的酸疫苗。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的第三次第三次革命革命。核酸疫苗的制備核酸疫苗的制備l核酸疫苗的構(gòu)建核酸疫苗的構(gòu)建l工程菌的發(fā)酵：深層液體培養(yǎng)工程菌的發(fā)酵：深層液體培養(yǎng)l菌體細(xì)胞的收集和細(xì)菌裂解菌體細(xì)胞的收集和細(xì)菌裂解l菌體收集：離心菌體收集：離心l細(xì)菌裂解：煮沸法、細(xì)菌裂解：煮沸法、SDS裂解法等

28、裂解法等l質(zhì)粒的初步抽提質(zhì)粒的初步抽提l變性后成為單鏈環(huán)狀變性后成為單鏈環(huán)狀DNA,將溶液的將溶液的pH調(diào)回調(diào)回中性時，容易復(fù)性并溶于液相中性時，容易復(fù)性并溶于液相l(xiāng)質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的純化的純化l去除細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)和去除細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)和RNAl質(zhì)粒的濃縮：乙醇沉淀質(zhì)粒的濃縮：乙醇沉淀l核酸疫苗的質(zhì)量監(jiān)控核酸疫苗的質(zhì)量監(jiān)控l濃度測定濃度測定l純度測定純度測定l限制性內(nèi)切酶圖譜分析限制性內(nèi)切酶圖譜分析l影響核酸疫苗效果的主要因素影響核酸疫苗效果的主要因素l質(zhì)粒載體的骨架結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體的骨架結(jié)構(gòu)l給藥劑量和導(dǎo)入細(xì)胞的效率給藥劑量和導(dǎo)入細(xì)胞的效率l抗原蛋白在宿主細(xì)胞的表達效率抗原蛋白在宿主細(xì)胞的表達效率l免疫次數(shù)、注射方式和給藥途徑免疫次數(shù)、注射方式和給藥途徑l核酸疫苗的接種方法核酸疫苗的接種方法l直接注射法直接注射法l基因槍轟擊法基因槍轟擊法l細(xì)菌或病毒攜帶法細(xì)菌或病毒攜帶法l口服、滴鼻或噴鼻法口服、滴鼻或噴鼻法muscleDNA疫苗表達抗原VIII III IV12gene(DNA)RNAantigen(protein)u基因指導(dǎo)其編碼抗原的產(chǎn)生u抗原激活免疫反應(yīng)%產(chǎn)生抗體%細(xì)胞免疫DNA疫苗特性u表達病毒抗原的抗原性與觀察的自然感染相類似u有效激發(fā)CD8+ ，CTLs