第10 章 高效液相色譜法

1、第10 章 高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography高效液相色譜法基本類型和應(yīng)用范圍高效液相色譜法基本類型和應(yīng)用范圍 液相色譜沒有揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制，流動(dòng)相對分離有很大影響，提供了一個(gè)改善分離的條件 分類： 分配色譜(partition chromatography) 吸附(液固)色譜(absorption chromatography, liquid- solid chromatography) 離子交換色譜(ion exchange chromatography) 尺寸排阻(凝膠)色譜(size exclusion chromatogra

2、phy, gel chromatography) 10-1 液相色譜的柱效一、液相色譜的速率理論一、液相色譜的速率理論I 渦流擴(kuò)散項(xiàng)； II 流動(dòng)相區(qū)域內(nèi)，流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)（見下頁）；III 分子擴(kuò)散項(xiàng)； IV 固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)； V 流動(dòng)相停滯區(qū)域內(nèi)的傳質(zhì)阻力（見下頁）。 2221()1sfsmpdMMSMepmpC dC dC DHuDuDDC dC d u(I)(II)(III)(IV)(V)II 項(xiàng)， 流動(dòng)相流經(jīng)同一區(qū)域，接近固定相的流速要比流動(dòng)中間的慢V 項(xiàng)， 進(jìn)入固定相微孔，就會(huì)減慢傳質(zhì)速率 H dp2 ，故減小填料粒度是提高柱效的有效的有效方法。二、柱外譜帶展寬二、柱外譜帶展寬

3、 流經(jīng)連接管道引起 , 線性流速， cm/s； r, 連接管半徑，cm;DM 溶質(zhì)在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)， cm2/s, 一般柱外管道的半徑小于3 mm.224exMr uHDu10-2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見右圖，一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號(hào)記錄下來，由

4、此得到液相色譜圖。 液相色譜儀液相色譜儀 高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動(dòng)相阻力很大，必須配備有高壓輸液系統(tǒng), 20-40 MPa。 一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成。 高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定( x l-20 ml/min)，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。 常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。 恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。一、高壓輸液系統(tǒng)高壓泵應(yīng)具有的性能足夠的輸出壓力恒定的輸出流量可調(diào)的輸出流量范圍平穩(wěn)的壓力二、進(jìn)樣系統(tǒng) 高效液相色譜柱比氣相色譜

5、柱短得多（約530 cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。進(jìn)樣方式 直接注射進(jìn)樣停流進(jìn)樣高壓六通閥進(jìn)樣三、 分離系統(tǒng)色譜柱 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。 柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其它金屬。 一般色譜柱長530 cm，內(nèi)徑為45 mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312 mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25 mm 以上。 一般在分離前備有一個(gè)前置柱（預(yù)柱），前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離

6、技的性能不受影響。常用分離柱常用分離柱 柱體為直型不銹鋼管，見下圖 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。四、檢測系統(tǒng) 要求： 靈敏度高， 噪音低， 線性范圍寬 相應(yīng)快 死體積小， 對溫度和流速變化不敏感。 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。 另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。 常用的

7、檢測器見表。紫外可見光、電化學(xué)檢測器的流通池比較紫外檢測器紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）；對流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。紫外光電二極管陣列檢測器紫外光電二極管陣列檢測器 光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，可獲得三維立體譜圖光電二極管陣列檢測器譜圖光電二極管陣列檢測器譜圖熒光檢測器熒光檢測器 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。示差折光檢測器示差折光檢測器 除紫

8、外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種； 五. 附屬系統(tǒng) 包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。 質(zhì)譜作為檢測器 (HPLC-MS) 紅外光譜作為檢測器 (HPLC-FTIR） 10-3 分配色譜分配色譜 一般可分液-液色譜和鍵合相色譜。液-液色譜固定液容易流失，目前應(yīng)用最廣泛的一種鍵合相色譜。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵

9、合固定相上進(jìn)行的。一、化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC SiOC b. b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC SiC d. d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN SiN 用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴（C8和C18。）和苯基等（

10、2）極性基團(tuán)極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán) 如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基， 季鍍鹽；作為陽離子交換 基團(tuán)的磺酸等。 根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正正相分配色譜相分配色譜和反相分配色譜反相分配色譜。如果采用流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。 如果采用流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。 相應(yīng)鍵合相色譜： 正相鍵合色譜 反相鍵合色譜 柱子可選

11、擇方式： 1. 1. 固定相極性與分析物匹配，選用極性不同的流動(dòng)相。固定相極性與分析物匹配，選用極性不同的流動(dòng)相。 2. 流動(dòng)相極性與分析物匹配，選用極性不同的固定相 3. 固定相極性與分析物質(zhì)極為相似，僅由流動(dòng)相極性差 異使分析物質(zhì)沿柱移動(dòng)。 通常采用第一類方式。 溶劑的極性可用極性指數(shù) p描述，為了精細(xì)調(diào)整k值，可采用混合溶劑，混合溶劑的極性指數(shù)可以表示為：二、固定相和流動(dòng)相的選擇 一般反相分離，可改變水含量來改變k值， 如果效果不理想，則可改變化學(xué)性質(zhì)（a值如改變?nèi)軇?反相色譜的四溶劑最佳操作 甲醇、乙腈、四氫呋喃調(diào)節(jié)a 值 水調(diào)節(jié)k值正相色譜的四溶劑系統(tǒng) 乙醚、氯仿、三氯甲烷調(diào)節(jié)a

12、 值n-己烷調(diào)節(jié)k值 三、洗脫物的流出順序解釋 把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。 如圖所示，兩種作用力-分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基的締合作用和被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用-之差，決定了分子在色譜中的保留行為。四、分配色譜的應(yīng)用 反相鍵合相色譜應(yīng)用廣泛，見表21-3(p 394)。 特點(diǎn) 改變流動(dòng)相， 可調(diào)節(jié)k 和a 可分離離子化合物、非離子化合物和可電離化和物 水為主體 可預(yù)測洗脫順序 平衡快，適合梯度洗脫 離子對色譜，流動(dòng)相中含有可與分析物質(zhì)形成離子對的相反電荷離子化合物-對離子。10-4 液

13、液固固( (吸附吸附) )色譜法色譜法 液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分離的。 一、固定相 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。 由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。二、保留機(jī)制 當(dāng)流動(dòng)相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分

14、子，于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附: X + nSad = Xad + nS 達(dá)平衡時(shí),有 nadnadadSXSXK其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。 三、流動(dòng)相 一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。 洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（0）來衡量，0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。 列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的0值。在硅膠吸附劑中0值的順序相同，數(shù)值可換算（0硅膠=0770氧化鋁）。

15、四、應(yīng)用 見書 適合分離異構(gòu)體10-5 離子交換色譜和離子色譜離子交換色譜和離子色譜 不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。一、離子交換平衡一、離子交換平衡 反離子：為保持交換劑電中性，基質(zhì)上存在的帶相同電荷數(shù)但符號(hào)相反的離子。 對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價(jià)離子的KB/A值按以下順序： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ 二價(jià)離子的順序?yàn)椋?Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+ 對于季胺型強(qiáng)堿陰離子交換樹指，陰離子的選擇性順序?yàn)椋?ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-

16、OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF二、固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見表21-8）（l）多孔型離子交換樹脂 主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分見圖21-12中（a）和（b）。（2）薄膜型離子交換樹脂 直徑約對30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層，如圖中（c）。（3）表面多孔型離子交換樹脂 在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂，如圖中（d）所示。（4）離子交換鍵合固定相

17、 用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實(shí)現(xiàn)快速分離。 常用的離子交換劑固定相可分以下幾種：三、流動(dòng)相 流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。 通過改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。 如果增加反離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 一般，對于陰離子交換樹脂來說，各種陰離子的滯留次序?yàn)椋?檸檬酸離子SO42C2O42-I-NO

18、3-CrO42-Br-SCN- Cl-HCOO-CH3C00-OH-F- 所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。 陽離子的滯留次序大為： Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li十 但差別不如陰離子明顯。 pH值的影響，要視不同情況而定。pH 改變會(huì)改變電離度，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。四、離子色譜法 用低交換容量（0.02-0.05 mmol/L) 的填料，用電導(dǎo)檢測，分析痕量無機(jī)離子和有機(jī)離子。 待測離子和洗脫離子應(yīng)有不同響應(yīng)。 （1）雙柱離子色譜法 分離柱+抑制柱 （填充物電荷相反） 若樣品為陽離子，用無

19、機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離柱后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)反應(yīng)： R+OH+H+Cl- R+Cl+H2O R+一OH-+M+Cl-M+OH+R+Cl-可測不可測 可連續(xù)自動(dòng)再生抑制柱，如中空纖維抑制器和平板微膜抑制器。(2) 單柱離子色譜 采用低電導(dǎo)洗脫液，可省去抑制柱。五、離子排斥色譜 不是離子交換色譜。 分離弱酸和弱堿鹽 稀鹽酸為洗脫劑分離羧酸，抑制柱用Ag+型陽離子交換劑，通過反應(yīng) 去除沖洗劑中的Cl-。AgClAgCl10-6 尺寸排阻色譜尺寸排阻色譜一、原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。 其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔