實(shí)驗(yàn)十二 厭氧性細(xì)菌(1稿)

1、實(shí)驗(yàn)十二 厭氧性細(xì)菌（厭氧培養(yǎng)方法）厭氧性細(xì)菌（Anaerobic bacteria）是一大群必須在無(wú)氧或低氧環(huán)境中才能生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌；一般情況下，這類細(xì)菌在無(wú)氧條件下比在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)好，不能在空氣（氧氣濃度大于18%）和（或）二氧化碳濃度小于10%以下的固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)。這類細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝多以無(wú)氧發(fā)酵的方式進(jìn)行。它能引起人體不同部位的感染，包括闌尾炎、膽囊炎、中耳炎、口腔感染、心內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜炎、腦膿腫、心肌壞死、骨髓炎、腹膜炎、膿胸、輸卵管炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、肝膿腫、鼻竇炎、腸道手術(shù)或創(chuàng)傷后傷口感染、盆腔炎以及菌血癥等。（一）無(wú)芽胞厭氧菌主要種類及生物學(xué)性狀 無(wú)芽

2、胞厭氧菌共有23個(gè)屬，與人類疾病相關(guān)的主要有10個(gè)屬。1.革蘭陰性厭氧桿菌有8個(gè)屬，類桿菌屬中的脆弱類桿菌最為重要。形態(tài)呈多形性，有莢膜。除類桿菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速外，其余均生長(zhǎng)緩慢。2.革蘭陰性厭氧菌有3個(gè)屬，其中以韋榮菌屬最重要。為咽喉部主要厭氧菌，但在臨床厭氧菌分離標(biāo)本中，分離率小于1%，且為混合感染菌之一。其他革蘭陰性球菌極少分離到。3.革蘭陽(yáng)性厭氧菌有5個(gè)屬，其中有臨床意義的是消化鏈球菌屬，主要寄居在陰道。本菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)需57天。4.革蘭陽(yáng)性厭氧桿菌有7個(gè)屬，其中以下列3個(gè)屬為主：（1）丙酸桿菌屬：小桿菌，無(wú)鞭毛，能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，需要25天，與人類有關(guān)的有3個(gè)種，以痤

3、瘡丙酸桿菌最為常見(jiàn)。（2）雙歧桿菌：呈多形性，有分枝，無(wú)動(dòng)力，嚴(yán)格厭氧，耐酸。29個(gè)種中有10個(gè)種與人類有關(guān)，其中只有齒雙歧桿菌與齲齒和牙周炎有關(guān)。其他種極少?gòu)呐R床標(biāo)本中分離到。（3）優(yōu)桿菌屬：?jiǎn)我恍螒B(tài)或多形態(tài)，動(dòng)力不定，嚴(yán)格厭氧，生化反應(yīng)活潑，生長(zhǎng)緩慢，常需培養(yǎng)7天，最常見(jiàn)的是遲鈍優(yōu)桿菌。（二）微生物學(xué)檢查要從感染灶深部采取標(biāo)本。最好是切取感染灶組織或活檢標(biāo)本，立即送檢醫(yī).學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。1.直接涂片鏡檢：將采集的標(biāo)本直接涂片染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)、染色及菌量，為進(jìn)一步培養(yǎng)以及初步診斷提供依據(jù)。2.分離培養(yǎng)與鑒定：分離培養(yǎng)是鑒定無(wú)芽胞厭氧菌感染的關(guān)鍵步驟。標(biāo)本應(yīng)立即接種相應(yīng)的培養(yǎng)基，最常用

4、的培養(yǎng)基是以牛心腦浸液為基礎(chǔ)的血平板。置37厭氧培養(yǎng)23天，如無(wú)菌生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)1周。如有菌生長(zhǎng)則進(jìn)一步利用有氧和無(wú)氧環(huán)境分別傳代培養(yǎng)，證實(shí)為專性厭氧菌后，再經(jīng)生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。厭氧菌廣泛分布于自然界以及人和動(dòng)物的體內(nèi)，具有以下特點(diǎn)：1、種類繁多，分類方法多。（1）按照形態(tài)厭氧性細(xì)菌分為芽胞厭氧菌和無(wú)芽胞厭氧菌兩大類。芽胞厭氧菌只有一個(gè)菌屬，即梭狀芽胞桿菌屬，共有100多個(gè)種；無(wú)芽胞厭氧菌有40多個(gè)菌屬，300多個(gè)種和亞種。（2）根據(jù)對(duì)O的耐受程度，可將厭氧菌分為3大類：（1）對(duì)氧極端敏感的厭氧菌：代表菌種為月形單胞菌。這類細(xì)菌對(duì)厭氧條件要求很高，在空氣中暴露10min即死亡，臨床上很難分離出

5、；（2）中度厭氧菌：代表菌種為脆弱擬桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等臨床分離常見(jiàn)的厭氧菌。它們?cè)诳諝庵斜┞?090min或在膿汁抽出72h后仍然能分離出來(lái)；（3）耐氧厭氧菌：代表菌種為溶組織梭菌。這類細(xì)菌不能利用氧，在無(wú)氧條件下生長(zhǎng)好，而在有氧條件下生長(zhǎng)不佳。也有按照其對(duì)氧的耐受的程度不同，可分為專性厭氧菌和兼性厭氧菌等。專性厭氧菌（Obligate anaerobe），是指在無(wú)氧的環(huán)境中才能生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌。此類細(xì)菌缺乏完善的呼吸酶系統(tǒng)，只能進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，不但不能利用分子氧，而且游離氧對(duì)其還有毒性作用。如破傷風(fēng)桿菌、肉毒桿菌、產(chǎn)生莢膜桿菌等。 只能在沒(méi)有游離氧存在的環(huán)境中生存的微生物。甲烷菌即屬此類細(xì)菌。

6、人們利用甲烷菌等產(chǎn)生沼氣，利用厭氧菌處理各種有機(jī)廢物和廢水。如梭菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌以及大部分光合細(xì)菌。與此相反，無(wú)論有氧狀態(tài)還是無(wú)氧狀態(tài)都能生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)菌，則稱它為兼性厭氧細(xì)菌（facultative obligate anaerobe）。專性厭氧菌除通過(guò)發(fā)酵，光合作用獲得能量外，有的能把硫酸鹽那種的無(wú)機(jī)氧化物作為末端電子受體而加以利用。據(jù)認(rèn)為，在專性厭氧菌中，通過(guò)發(fā)酵獲得能量的一般都缺少細(xì)胞色素或過(guò)氧化氫酶，氧對(duì)生長(zhǎng)，其所以有害，是由于缺少超氧化物不均化酶和過(guò)氧化氫酶，而對(duì)由黃素系氧化酶的作用而產(chǎn)生的有害的超氧化物或過(guò)氧化氫不能分解所致。在土壤中與好氧菌共存時(shí)，在有通透空氣的地方也可發(fā)

7、現(xiàn)有厭氧菌的存在。在兼性厭氧菌中，很多是像大腸桿菌那樣，有氧存在時(shí)是借助呼吸，氧不存在時(shí)是借助發(fā)酵來(lái)獲得能量的。但也有的像乳酸菌那樣，即使有氧存在，主要也是借助發(fā)酵來(lái)獲得能量。因而即使是兼性厭氧菌，其中也包括從在有氧條件下生長(zhǎng)十分良好的直到無(wú)氧條件下生長(zhǎng)十分良好的各種各樣的情況。（3）根據(jù)革蘭氏染色可分為厭氧革蘭陽(yáng)性球菌（消化鏈球菌）、厭氧革蘭陽(yáng)性桿菌（乳酸桿菌、痤瘡丙酸桿菌、放線菌、破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌）、厭氧革蘭陰性桿菌（脆弱類桿菌、產(chǎn)黑色素普雷沃菌、具核梭桿菌、壞死梭桿菌）、厭氧革蘭陰性球菌（韋榮球菌）。2、分布廣泛。在正常人體的皮膚以及所有與外界相通的腔道如口腔、上呼吸道

8、、胃腸道、泌尿生殖道等的黏膜上均有大量厭氧菌寄居。除梭狀芽胞桿菌能以芽胞的形式在自然界長(zhǎng)期存活外，絕大多數(shù)厭氧菌存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，與需氧菌、兼性厭氧菌共同組成人體的正常菌群，并且在種類和數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，如在結(jié)腸中，厭氧菌與需氧菌或兼性厭氧菌的比例為1000:1，即厭氧菌占結(jié)腸細(xì)菌的99.9%。3、主要臨床及細(xì)菌學(xué)指征：感染局部有氣體產(chǎn)生；發(fā)生在黏膜附近的感染；深部外傷；分泌物惡臭或?yàn)榘笛t色或出現(xiàn)紅色熒光；某些抗生素治療無(wú)效的感染；標(biāo)本直接鏡檢見(jiàn)細(xì)菌染色不均、呈明顯多形態(tài)；或鏡檢查見(jiàn)細(xì)菌，而有氧培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。4、厭氧菌感染的原因：局部組織的氧化還原電勢(shì)降低，形成有利于厭氧菌生長(zhǎng)的厭氧微環(huán)

9、境；機(jī)體免疫功能下降及屏障作用破壞；菌群失調(diào)或厭氧菌的寄居部位發(fā)生改變等。目前，培養(yǎng)厭氧微生物的技術(shù)和方法不斷改進(jìn)，日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。目前簡(jiǎn)便而又有效的技術(shù)包括有：厭氧箱培養(yǎng)技術(shù)、厭氧罐培養(yǎng)技術(shù)、厭氧袋培養(yǎng)技術(shù)、亨蓋特（Hungate）厭氧滾管技術(shù)等。一、臨床意義厭氧菌一般為條件致病菌。主要存在于人體及動(dòng)物體內(nèi)，特別是腸道、口腔、上呼吸道和泌尿生殖道等處，與需氧菌和兼性厭氧菌共同構(gòu)成機(jī)體的正常菌群。在正常菌群中厭氧菌通常占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。正常情況下，菌群保護(hù)相對(duì)平衡，如長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等，發(fā)生菌群失調(diào)，或機(jī)體抵抗力減退，則可導(dǎo)致內(nèi)源性厭氧

10、菌感染，也常與其他細(xì)菌混合感染。常作為條件致病菌引起各組織和器官的內(nèi)源性感染，感染可發(fā)生于人體的各個(gè)部位，遍及臨床各科。在臨床厭氧菌感染中，內(nèi)源性感染多于外源性感染；由無(wú)芽胞厭氧菌引起的感染多于芽胞厭氧菌的感染；混合感染多于單純厭氧菌感染。破傷風(fēng)梭菌廣泛存在于土壤、人與動(dòng)物的腸道中，芽胞在土壤中可存活數(shù)年，經(jīng)傷口感染，在厭氧條件下生長(zhǎng)繁殖，引起破傷風(fēng)。產(chǎn)氣莢膜梭菌是氣性壞疽的主要病原菌，某些型別也可引起食物中毒和壞死性腸炎。也常與兼性厭氧菌混合感染，引起深部膿腫，腹腔、盆腔、胸腔感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎以及膽道、泌尿道、女性生殖道感染等。肉毒梭菌在厭氧環(huán)境中，可分泌毒性極強(qiáng)烈的肉毒毒素，被食入可

11、引起特殊的神經(jīng)中毒癥狀，病死率極高。嬰幼兒若食入被肉毒梭菌芽胞污染的食物，引起嬰幼兒肉毒病。艱難梭菌是人類腸道正常菌群，可因菌群失調(diào)而引起偽膜性腸炎，是醫(yī)院內(nèi)感染的病原菌之一。此外，艱難梭菌尚能引起氣性壞疽、腎盂腎炎、腦膜炎、腹腔和陰道感染及菌血癥等。無(wú)芽胞厭氧菌是一大類寄生于人體的正常菌群，引起的感染均為內(nèi)源性感染，在一定的致病條件下，可引起多種人類感染。所致疾病有：1.敗血癥：主要由脆弱類桿菌引起，其次為革蘭陽(yáng)性厭氧球菌醫(yī).學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。2.中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染：主要由革蘭陰性厭氧桿菌引起，?？梢鹉X膿腫。3.口腔與牙齒感染：主要由消化鏈球菌、產(chǎn)黑素類桿菌等引起。4.呼吸道感染：主要由普雷

12、沃菌屬、壞死梭桿菌、核梭桿菌、消化鏈球菌和脆弱類桿菌。5.腹部和會(huì)陰部感染：主要由脆弱類桿菌引起。6.女性生殖道感染：主要由消化鏈球菌屬、普雷沃菌屬和卟啉單胞菌等引起。7.其他：無(wú)芽胞厭氧菌尚可引起皮膚和軟組織感染、心內(nèi)膜炎等。二、厭氧性細(xì)菌的檢驗(yàn)程序（見(jiàn)圖12-1）生長(zhǎng)專性厭氧菌菌種保存分類鑒定藥物敏感試驗(yàn)形態(tài)與染色菌落特性生化反應(yīng)藥敏性鑒定氣液相色譜需氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)生長(zhǎng)兼性厭氧菌無(wú)生長(zhǎng)27d厭氧培養(yǎng)確定厭氧菌（耐氧試驗(yàn)）每個(gè)平板挑5個(gè)以上不同菌落每個(gè)菌落接種2個(gè)平板，經(jīng)48h培養(yǎng)臨床標(biāo)本肉眼觀察及直接涂片檢查分離培養(yǎng)(非選擇性及選擇性厭氧培養(yǎng)基)增菌培養(yǎng)(液體培養(yǎng)基)圖12-1 厭氧性細(xì)菌

13、檢驗(yàn)程序三、試驗(yàn)?zāi)康囊?掌握厭氧性細(xì)菌的生物學(xué)特性、形態(tài)特性和培養(yǎng)特性。2掌握厭氧菌的概念、分類、常用鑒別方法、鑒定原則和鑒別要點(diǎn)。3、熟悉厭氧菌標(biāo)本采集方法、送檢要求、檢驗(yàn)程序、分離培養(yǎng)方法。4. 了解破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌的致病性和防治原則 5、了解厭氧性細(xì)菌的感染特點(diǎn)及檢驗(yàn)的臨床意義四、器材與試劑（題前空二格，五號(hào)宋體加粗）1菌種 破傷風(fēng)芽胞梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌、脆弱擬桿菌和厭氧消化鏈球菌；或上棕菌種的庖肉培養(yǎng)物。2培養(yǎng)基 庖肉培養(yǎng)基，厭氧血瓊脂平板，牛乳培養(yǎng)基，五糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）發(fā)酵管，卵黃瓊脂平板，溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基，CCFA(

14、環(huán)絲氨酸一頭孢西丁一果糖一卵黃瓊脂)平板培養(yǎng)基、擬（類）桿菌膽汁七葉苷瓊脂平板(BBE)、七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、20%膽汁培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基等。3試劑 革蘭染色液、芽胞染色液、產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清、200g/L糖溶液、20g/L尿素，L色氨酸基質(zhì)液、0.5g/L硝酸鈉溶液、糖發(fā)酵緩沖液、0.2g/L七葉苷水溶液、0.025mol/L pH 6.0酚紅磷酸鹽緩沖液、0.025mol/L的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、硝酸鹽還原試劑、二甲苯、歐氏試劑等。4其他 凡士林、小白鼠、無(wú)菌注射器、無(wú)菌吸管、剪刀、鑷子、玻片、厭氧袋或厭氧罐、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、蒸餾水、透明微孔板、366nm紫外燈

15、等。五、步驟與方法（一）采集標(biāo)本根據(jù)不同感染部位采集相應(yīng)標(biāo)本，如：血液、關(guān)節(jié)液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液等體液；深部膿腫滲出液、肺部滲出液、其他組織穿刺液等。采集標(biāo)本時(shí)需注意無(wú)菌操作，防止正常菌群污染，盡量避免接觸空氣，迅速送檢。有些標(biāo)本如鼻咽拭子、痰液、流出的膿液、陰道分泌物、糞便等因含大量的正常菌群，故不宜作厭氧菌培養(yǎng)。1、破傷風(fēng)梭菌檢驗(yàn)：可疑破傷風(fēng)患者取感染傷口膿液或壞死組織塊。2、產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)：氣性壞疽病患者可采集創(chuàng)傷深部分泌物、穿刺物、壞死組織塊；菌血癥患者取血液；食物中毒取剩余食物、患者糞便或嘔吐物。3、肉毒梭菌檢驗(yàn)：取剩余食物、患者糞便或嘔吐物。4、艱難梭菌檢驗(yàn)：取患者糞便

16、。（二）分離培養(yǎng)1形態(tài)觀察（涂片染色鏡檢）：取標(biāo)本或破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌及艱難梭菌的培養(yǎng)物；或脆弱類桿菌、產(chǎn)黑色素類普雷沃菌、厭氧消化鏈球菌的培養(yǎng)物別涂片作革蘭染色與芽孢染色后，鏡檢，觀察形態(tài)。表12-1 厭氧菌的鏡下形態(tài)特征菌 名形態(tài)及其他特征脆弱類桿菌革蘭陰性短桿菌，兩端鈍圓而濃染，菌體中央不易著色或染色較淺，形似空泡；可形成莢膜；陳舊培養(yǎng)物常呈多形性，長(zhǎng)短不一，標(biāo)本有琥珀味產(chǎn)黑色素普雷沃菌革蘭陰性球桿菌，可見(jiàn)多形性，長(zhǎng)短不一，兩端鈍圓、濃染，著色不均勻，菌體中間似空泡，紫外線照射發(fā)紅色熒光，標(biāo)本有惡臭具核梭桿菌菌體細(xì)長(zhǎng)，兩頭尖，紫色顆粒沿菌體長(zhǎng)軸成雙排列，標(biāo)本有丁酸味壞死梭

17、桿菌菌體細(xì)長(zhǎng)，高度多形性，長(zhǎng)短不一，菌體中部膨脹呈圓球形韋榮球菌極小的革蘭陰性球菌消化鏈球菌革蘭陽(yáng)性球菌，菌體圓形，或卵圓形，成雙或短鏈狀或成堆排列的小球菌，大小不等；易染成陰性乳酸桿菌細(xì)長(zhǎng)，無(wú)芽胞，有時(shí)多形性，標(biāo)本有乳酸氣味痤瘡丙酸桿菌菌體微彎呈棒狀，一端圓一端漸細(xì)，呈X、Y、V或柵狀排列，標(biāo)本有丙酸氣味放線菌分枝呈棒狀、X、Y、V或柵狀排列，膿汁中有硫磺顆粒，呈琥珀酸氣味破傷風(fēng)梭菌G+的細(xì)長(zhǎng)桿菌，散在排列，用Wirtz&Conklin法進(jìn)行芽胞染色，可見(jiàn)菌體細(xì)長(zhǎng)呈紅色，芽胞圓形呈綠色，位于菌體頂端，芽胞圓形，直徑大于菌體，有鞭毛，使菌體呈“鼓槌狀”。產(chǎn)氣莢膜梭菌G+的粗大桿菌，兩端鈍圓，單

18、個(gè)或散在或成雙排列；芽胞卵圓形，但一般不易看見(jiàn)，直徑小于菌體，位于菌體中央或次末端；有莢膜，標(biāo)本直接染色可見(jiàn)肥厚莢膜。肉毒梭菌G+的粗大桿菌，兩端鈍圓，單個(gè)或成雙排列；芽胞卵圓形，直徑大于菌體，位于菌體次末端，使細(xì)菌呈“網(wǎng)球拍”狀。艱難梭菌G+的粗長(zhǎng)桿菌，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)（48h）易轉(zhuǎn)為革蘭陰性；芽胞卵圓形或長(zhǎng)方形、位于菌體次極端。2培養(yǎng)特性觀察：將可疑標(biāo)本（破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌）分別接種于庖肉培養(yǎng)基與血平板；將艱難梭菌接種于血平板與CCFA平板。將脆弱類桿菌接種于血平板及BBE平板；將產(chǎn)黑色素類普雷沃菌、厭氧消化鏈球菌接種于厭氧血瓊脂平板。于35厭氧條件下孵育2448h，觀察結(jié)果。

19、形態(tài)和培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表12-2、表12-3。表12-2 厭氧芽胞梭菌的培養(yǎng)特性細(xì)菌名稱培養(yǎng)特性庖肉培養(yǎng)基血平板CCFA平板破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)液混濁,肉渣部分消化微變黑,有少量氣體。呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，菌落扁平、灰白色、邊緣不齊、周邊疏松似“羽毛狀”，有狹窄溶血環(huán)。產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)液混濁，肉渣不被消化、呈粉紅色，產(chǎn)大量氣體。圓形凸起的光滑型菌落，邊緣整齊、有雙層溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)為溶血、外環(huán)為溶血。肉毒梭菌培養(yǎng)液混濁，肉渣被消化、呈黑色，有腐敗性惡臭，產(chǎn)少量氣體。菌落較大，半透明、灰白色、有光澤，邊緣薄、彌散而不規(guī)則；有溶血環(huán)。艱難梭菌培養(yǎng)48h后，形成圓形、白或淡黃色菌落，邊緣不整齊、表面粗糙，不溶血。菌

20、落較大，邊緣不整齊、表面粗糙呈毛玻璃樣；在紫外線照射下，可見(jiàn)黃綠色熒光。表12-3 厭氧無(wú)芽胞梭菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性細(xì)菌名稱培養(yǎng)特性厭氧血平板BBE平板脆弱類桿菌在厭氧血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落直徑13mm，圓形、微凸、半透明、灰白色、表面光滑、邊緣整齊，多數(shù)菌株不溶血。在BBE平板中生長(zhǎng)旺盛，菌落較大，周圍有黑色暈圈。產(chǎn)黑色素普雷沃菌在厭氧血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，經(jīng)48h培養(yǎng)后形成直徑0.53mm的菌落；菌落圓形凸起，初為灰白色，后呈黃色、淺棕色，57天后變成黑色；多數(shù)菌株呈溶血。在黑色素產(chǎn)生前，于366nm紫外線下，可見(jiàn)橘紅色熒光，色素出現(xiàn)后則無(wú)熒光。厭氧消化鏈球菌生長(zhǎng)緩慢，經(jīng)24天培養(yǎng)，在厭

21、氧血瓊脂平板上形成直徑0.51mm的小菌落；菌落圓形凸起、光滑不透明，初為黑色，接觸空氣后顏色變淺，傳代后黑色消失。（三）生化反應(yīng)1、五糖發(fā)酵與牛乳消化試驗(yàn)（1)原理：不同的細(xì)菌產(chǎn)生不同的酶，因而對(duì)糖的利用能力和對(duì)蛋白質(zhì)的分解能力不同，據(jù)此可作為厭氧菌鑒定的參考依據(jù)之一。（2)方法：將五糖發(fā)酵管與牛乳培養(yǎng)基置1000C水浴中加熱煮沸10分鐘，取出后迅速冷卻，以驅(qū)除培養(yǎng)基中的空氣。以無(wú)菌吸管吸取待檢菌培養(yǎng)物，分別滴加于五糖發(fā)酵管與牛乳培養(yǎng)基中，接種完畢后，在液面上加一薄層熔化的凡士林。經(jīng)35孵育2448小時(shí)，觀察結(jié)果。（3)結(jié)果判定和報(bào)告：破傷風(fēng)芽胞梭菌不分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖，

22、牛乳培養(yǎng)基無(wú)變化。產(chǎn)氣莢膜梭菌分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，牛乳凝固、胨化變清。肉毒梭菌能分解葡萄糖、麥芽糖與蔗糖，不分解乳糖與甘露醇，牛乳培養(yǎng)基一般無(wú)變化。艱難梭菌能分解葡萄糖和甘露醇產(chǎn)酸，不分解乳糖、麥芽糖和蔗糖，牛乳培養(yǎng)基無(wú)變化，見(jiàn)表12-4。2、洶涌發(fā)酵試驗(yàn)（1）原理：在牛乳培養(yǎng)基中，產(chǎn)氣莢膜梭菌可迅速分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，酪蛋白被酸凝固形成凝塊，由于同時(shí)產(chǎn)生大量氣體，酪蛋白凝塊被產(chǎn)生的大量氣體沖擊，使其形成分散的海綿碎塊，并將部分凝塊及培養(yǎng)基及表面的凡士林沖至試管塞處。這種氣勢(shì)兇猛的反應(yīng)現(xiàn)象被稱為“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。 （2）方法：以無(wú)菌吸管（或接種環(huán)）取產(chǎn)氣莢膜梭菌庖肉培養(yǎng)物，

23、接種于溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基，經(jīng)35孵育1824h，觀察結(jié)果。（3）結(jié)果判定：一般于孵育6小時(shí)后即可見(jiàn)到“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。此特征可作為鑒定本菌的重要指標(biāo)之一。3、卵磷脂酶試驗(yàn)和Nagler試驗(yàn)（1）原理：某些厭氧芽孢梭菌（如產(chǎn)氣莢膜梭菌）能產(chǎn)生卵磷脂酶，在卵黃瓊脂平板上，可將其中可溶性的磷脂酰膽堿分解成磷酸膽堿和不溶性的甘油酯，后者在菌落周圍形成不透明區(qū)（呈乳白色環(huán)），此為卵磷脂酶試驗(yàn)陽(yáng)性。若先將產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清（即卵磷脂酶抗血清）涂在卵黃瓊脂平板上，再接種產(chǎn)氣莢膜梭菌，則卵磷脂酶抗血清（抗體）與細(xì)菌的卵磷脂酶抗原發(fā)生中和反應(yīng)，使菌落周圍無(wú)乳白色環(huán)形成，此為Nagler試驗(yàn)陽(yáng)性。這兩項(xiàng)試驗(yàn)通常同

24、時(shí)進(jìn)行，可確證該細(xì)菌能產(chǎn)生卵磷脂酶。（2）方法：將卵黃瓊脂平板分成兩個(gè)區(qū)，其中一部分均勻涂上產(chǎn)氣莢膜梭菌抗血清，置35待干后，取待檢細(xì)菌先接種于未涂抗血清區(qū)域，再接種于已涂抗血清的另一區(qū)域。35厭氧孵育2448h，觀察結(jié)果。（3）結(jié)果判定：未涂抗血清的一半平板，菌落周圍形成較大的混濁不透明區(qū)，表示卵磷脂酶試驗(yàn)陽(yáng)性；涂抗血清的一側(cè)，菌落周圍無(wú)不透明區(qū)，表示卵磷脂酶活性已被抗毒素中和，為Nagler試驗(yàn)陽(yáng)性；如兩側(cè)菌落周圍均無(wú)不透明區(qū)，表示該菌不產(chǎn)生卵磷脂酶。產(chǎn)氣莢膜梭菌卵磷脂酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌及艱難梭菌為陰性。4、脂酶試驗(yàn)（1）原理：某些厭氧芽孢梭菌（如肉毒梭菌）可產(chǎn)生脂酶，作用

25、于卵黃中的游離脂肪，產(chǎn)生甘油和不溶性的游離脂肪酸，在菌落周圍培養(yǎng)基中形成局限的不透明區(qū)，并在菌落表面產(chǎn)生一層珠光層（為一薄脂肪酸，其融點(diǎn)在37以下，因此不能進(jìn)入培養(yǎng)基，只能漂浮在菌落表面）。（2）方法：將肉毒梭菌接種于卵黃瓊脂平板，35厭氧孵育48 72h，觀察結(jié)果。（3）結(jié)果判定：菌落表面有珠光層，菌落下面的培養(yǎng)基中有不透明區(qū)域者為脂酶陽(yáng)性。肉毒梭菌(G型除外)脂酶試驗(yàn)陽(yáng)性，破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌及艱難梭菌脂酶陰性。表12-4 厭氧芽胞梭菌的主要生化反應(yīng)菌種卵黃平板牛乳消化明膠液化葡萄糖乳糖麥芽糖甘露醇蔗糖卵磷脂酶 脂酶破傷風(fēng)梭菌-d+-產(chǎn)氣莢膜梭菌+-cd+-+肉毒梭菌-+d+_V-艱難

26、梭菌-+-+/-注：+：陽(yáng)性；-：陰性；v：不定。牛乳消化：d：消化；c：凝固；cd：既消化又凝固；-：不消化不凝固無(wú)芽孢厭氧菌應(yīng)做如下生化反應(yīng)：5、七葉苷水解試驗(yàn) （1）原理：某些細(xì)菌具有七葉苷水解酶，能將七葉苷水解為葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的Fe2+反應(yīng)，形成黑色化合物。（2）方法：斜面法：待檢菌接種七葉苷瓊脂斜面，于35厭氧孵育2448h，觀察結(jié)果；經(jīng)培養(yǎng)若出現(xiàn)黑色化合物，則為陽(yáng)性。微量斑點(diǎn)法：將0.2g/L七葉苷水溶液（淡藍(lán)色）滴加于透明微孔板中，共滴加3孔，再于各孔分別加1滴脆弱類桿菌菌液、產(chǎn)黑色素類普雷沃菌的菌液以及蒸餾水（對(duì)照）。經(jīng)35、3060min后，置36

27、0nm紫外燈下觀察結(jié)果。紫外燈照射下，對(duì)照孔呈淡藍(lán)色熒光；待測(cè)孔若與對(duì)照孔相同，則為陰性，若無(wú)熒光則為陽(yáng)性，說(shuō)明被水解后熒光消失。（3）結(jié)果判定：斜面法培養(yǎng)基變黑表示七葉苷已經(jīng)水解，為陽(yáng)性。微量斑點(diǎn)法對(duì)照孔呈淡藍(lán)色熒光，加菌液孔無(wú)熒光者為陽(yáng)性，說(shuō)明被水解后熒光消失，與對(duì)照相同者則為陰性。脆弱類桿菌能水解七葉苷為陽(yáng)性反應(yīng)，產(chǎn)黑色素普雷沃菌一般不水解七葉苷為陰性反應(yīng)。6、20%膽汁（或2%膽鹽）刺激生長(zhǎng)試驗(yàn) （1）原理：膽汁能抑制許多厭氧菌生長(zhǎng)，因?yàn)槟扄}可降低細(xì)胞膜表面張力，損傷細(xì)胞細(xì)胞膜。但脆弱類桿菌和少數(shù)其它厭氧菌，卻能利用膽汁作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故生長(zhǎng)旺盛。（2）方法：將相同菌量的脆弱類桿菌和產(chǎn)黑

28、色素類普雷沃菌分別接種至20%膽汁（或2%膽鹽）培養(yǎng)基中，同時(shí)接種不含膽汁的對(duì)照管。于35孵育2448h，觀察結(jié)果。（3）結(jié)果判定和報(bào)告：如果待檢細(xì)菌在含膽汁的培養(yǎng)管中細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛(+)，而在不含膽汁的對(duì)照管細(xì)菌生長(zhǎng)一般（+），說(shuō)明膽汁刺激生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性；若在含膽汁的培養(yǎng)管中抑制生長(zhǎng)者，則膽汁刺激生長(zhǎng)試驗(yàn)為陰性。脆弱類桿菌膽汁刺激生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性，產(chǎn)黑色素普雷沃菌膽汁試驗(yàn)為陰性。7、明膠液化試驗(yàn)（1)原理：明膠是一種動(dòng)物蛋白，能在20凝固，高于20時(shí)液化。某些厭氧菌能產(chǎn)生明膠酶，能使明膠分解為多肽和氨基酸，從而失去凝固力，使半固體的明膠培養(yǎng)基變?yōu)榱鲃?dòng)的液體。（2）方法：將待檢菌接種于明膠管中，同時(shí)用

29、一支未接種細(xì)菌的明膠管作為對(duì)照，經(jīng)370C厭氧孵育25天，取出置4冰箱中30分鐘，觀察培養(yǎng)基是否凝固。（3）結(jié)果判定：對(duì)照管37時(shí)呈液化狀態(tài)，置4冰箱中應(yīng)呈凝固狀態(tài)。接種細(xì)菌的明膠管置4冰箱中30分鐘仍不凝固者為陽(yáng)性，若凝固者則為陰性。脆弱類桿菌和厭氧消化鏈球菌明膠液化試驗(yàn)為陰性，產(chǎn)黑色素普雷沃菌及厭氧消化鏈球菌明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性。 8、胞外酶快速生化試驗(yàn)（1）原理：利用厭氧菌已產(chǎn)生的特異性酶可作用于相應(yīng)基質(zhì)，發(fā)生特異性的酶促反應(yīng)，迅速使基質(zhì)分解產(chǎn)生各種可見(jiàn)的變化。試驗(yàn)時(shí)，將高濃度菌液接種到高濃度的基質(zhì)中，由于菌量大，攜帶的酶也多，基質(zhì)量充分，故反應(yīng)速度快。普通環(huán)境下置37孵育4h（由于細(xì)菌不需要再繁殖，故不必厭氧培養(yǎng)），觀察結(jié)果。（2）方法：用直徑2mm的接種環(huán)取一滿環(huán)待檢細(xì)菌菌苔，加于0.5ml磷酸鹽緩沖液中配成濃厚菌液，再按表12-5的方法操作，在一次性微量板中依次加入基質(zhì)和濃菌液，并觀察結(jié)果。表12-5 胞外酶快速生化試驗(yàn)方法糖發(fā)酵試驗(yàn)脲酶試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)基質(zhì)200g/L糖溶液2滴20g/L尿素溶液3滴L-色氨酸4滴0.5g/L硝酸鈉溶液2滴緩沖液糖發(fā)酵緩沖液5滴0.025mol/L pH6.0酚紅磷