PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

1、精選ppt實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)13 DNA13 DNA片段的片段的PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增1 1、用、用PCRPCR技術(shù)對(duì)技術(shù)對(duì)DNADNA進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增2 2、用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增后的、用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增后的DNADNA進(jìn)進(jìn)行檢測(cè)行檢測(cè) 精選ppt電電 泳泳觀察PCR反應(yīng)反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)步驟精選pptDNADNA在體內(nèi)復(fù)制的條件是什么？在體內(nèi)復(fù)制的條件是什么？模板：模板：酶：酶：原料、能量：原料、能量：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等。聚合酶等。DNADNA分子的每條鏈分子的每條鏈dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP引物：引物：溫和的反應(yīng)條件溫和的反應(yīng)條件精選

2、pptDNADNA分子的結(jié)構(gòu)分子的結(jié)構(gòu)精選ppt合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸精選ppt合成合成DNADNA分子的原料分子的原料脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸dATP dGTP dCTP dTTP精選ppt 聚合反應(yīng)機(jī)理：聚合反應(yīng)機(jī)理：53OPGOPA模板鏈CTA35引物3355OHOPGOPAOOHTP模板鏈CTA35引物333555POOHTPP35精選pptDNA聚合酶聚合酶精選ppt不同細(xì)胞的細(xì)胞周期不同細(xì)胞的細(xì)胞周期 不同生物細(xì)胞不同生物細(xì)胞 需要的時(shí)間需要的時(shí)間細(xì)細(xì) 菌菌一般是一般是20203030分鐘分鐘蠶豆根尖細(xì)胞蠶豆根尖細(xì)胞17.317.3

3、小時(shí)小時(shí)小鼠十二指腸細(xì)胞小鼠十二指腸細(xì)胞15.315.3小時(shí)小時(shí)人的肝細(xì)胞人的肝細(xì)胞2222小時(shí)小時(shí)人的宮頸癌細(xì)胞人的宮頸癌細(xì)胞22.522.5小時(shí)小時(shí)PCRPCR技術(shù)可在技術(shù)可在幾小時(shí)內(nèi)幾小時(shí)內(nèi)，將特定核酸序列擴(kuò)增將特定核酸序列擴(kuò)增百萬倍百萬倍! !精選pptPCR的概念的概念 PCRPCR（ P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction,eaction,聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)）是指在體外，通過特異是指在體外，通過特異DNADNA引物引物擴(kuò)增擴(kuò)增核酸分子中核酸分子中某個(gè)某個(gè)特定區(qū)域特定區(qū)域的技術(shù)。的技術(shù)。精選ppt PCR的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系

4、DNA模板模板原料：原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ； 酶：酶： Taq聚合酶聚合酶（嗜熱細(xì)菌中分離得到）（嗜熱細(xì)菌中分離得到）引物：引物：（單鏈（單鏈DNA片段）片段）MgMg2+2+（維持酶活性所必需）（維持酶活性所必需）PCRPCR緩沖液：緩沖液：維持維持pH，保護(hù)，保護(hù)Taq酶酶 精選pptPCR技術(shù)原理技術(shù)原理變變 性性退火退火 延伸延伸 精選pptPCR三步曲三步曲 預(yù)變性預(yù)變性保溫保溫 變變 性性9095延伸延伸 7075退火退火 4060精選pptPCR儀儀精選ppt用于用于PCR的預(yù)混液（的預(yù)混液（ 500 L 體系）：體系）： ddH2O 310

5、310 L L1010butter 5butter 50 0 L LMgClMgCl2 2 40 40 L LdNTPdNTP混合液混合液 2020 L L引物引物1 251 25 L L引物引物2 252 25 L L模板模板DNA 2525 L L Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 5 5 L L 標(biāo)記一個(gè)微量離心管，用取樣器取標(biāo)記一個(gè)微量離心管，用取樣器取20 L的預(yù)混液的預(yù)混液加入到該管中。加入到該管中。精選ppt反應(yīng)試劑反應(yīng)試劑 用量用量PCR SuperMix 10L引物（濃度10M） 1L引物（濃度10M） 1L模板DNA 5LddH2O 3L總體積 20L精選ppt微量

6、可調(diào)移液器（微量可調(diào)移液器（一檔吸、二檔排一檔吸、二檔排）精選ppt PCR反應(yīng)參數(shù)反應(yīng)參數(shù)： 變性變性 94 30 s退火退火 52 30 s延伸延伸 72 60 s 預(yù)變性預(yù)變性 94 300 s保溫保溫 72 600 s循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 35精選ppt1、基本概念、基本概念 以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì),DNA在外加電場(chǎng)的在外加電場(chǎng)的作用下泳動(dòng)的技術(shù)。作用下泳動(dòng)的技術(shù)。2、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。定于瓊脂糖的濃度。精選p

7、pt瓊脂糖凝膠電泳基本原理瓊脂糖凝膠電泳基本原理精選ppt精選ppt使用使用電泳緩沖液在制膠器上配電泳緩沖液在制膠器上配制制1.0%的瓊脂糖凝膠。的瓊脂糖凝膠。2L載樣緩沖液、載樣緩沖液、 2L 核酸熒核酸熒光染料，光染料，10LPCR產(chǎn)物混勻。產(chǎn)物混勻。將上步混好的樣將上步混好的樣10 L加到凝膠加到凝膠孔中孔中。90V電壓下電泳電壓下電泳1020min。瓊脂糖凝膠電泳的過程瓊脂糖凝膠電泳的過程精選ppt將凝膠倒入制膠器的槽中將凝膠倒入制膠器的槽中（60oC）將瓊脂糖加入電泳緩沖液將瓊脂糖加入電泳緩沖液,在微波爐中在微波爐中加熱溶解至透明。加熱溶解至透明。精選ppt將梳子從制膠槽中拔出將梳子

8、從制膠槽中拔出 精選ppt取出凝膠板放入電泳槽中取出凝膠板放入電泳槽中 向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠 精選ppt 瓊脂糖凝膠電泳中瓊脂糖凝膠電泳中緩沖液的作用緩沖液的作用1 1、增加電導(dǎo)率；、增加電導(dǎo)率；2 2、維持電泳過程中、維持電泳過程中的合適的的合適的pHpH。精選ppt吸取吸取PCR反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物10L。注意吸頭。注意吸頭要插入到管底，才能取到要插入到管底，才能取到PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 將將PCR產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合（吸排幾次吸排幾次） 精選ppt常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用蔗糖

9、蔗糖使樣品呈色，便于上樣，使樣品呈色，便于上樣，形成可見指示帶，預(yù)測(cè)電泳進(jìn)程。形成可見指示帶，預(yù)測(cè)電泳進(jìn)程。溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)增加樣品密度，保證增加樣品密度，保證DNADNA均勻沉均勻沉入加樣孔內(nèi)。入加樣孔內(nèi)。核酸熒光染料核酸熒光染料可嵌合入可嵌合入DNADNA分子，在特定激發(fā)分子，在特定激發(fā)光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與光強(qiáng)度與DNADNA含量成正比。含量成正比。（需要與加樣緩沖液混合）（需要與加樣緩沖液混合）精選ppt精選ppt進(jìn)行電泳10-20分鐘精選ppt 實(shí)驗(yàn)用的核酸熒光染料與實(shí)驗(yàn)用的核酸熒光染料與DNA嵌合后，在嵌合后，在DNA發(fā)射發(fā)射黃綠色黃綠色熒光。熒光。電泳結(jié)果的觀察電泳結(jié)果的觀察在在DNADNA電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶并拍照。電泳圖譜觀察儀中觀察核酸條帶并拍照。