酶的化學(xué)修飾PPT課件

1、二、酶化學(xué)修飾的目的二、酶化學(xué)修飾的目的1. 1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（5050年代末）年代末）2. 2. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴大酶的應(yīng)用人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴大酶的應(yīng)用 范圍。（范圍。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性）增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2 2）保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑）保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑3 3）維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶）維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4 4）消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境）消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境第1頁/共46頁1 1）、如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定

2、性與耐熱性）、如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團(tuán)，可與酶修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性剛性”結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。2 2）、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑）、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋遮蓋”了酶了酶的活性部位的活性部位。第2頁/共46頁3 3）、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白）、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶水解酶 酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：酶化學(xué)修飾

3、后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：A. A. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。酶接近酶分子?！罢谏w遮蓋”酶分子上敏感鍵酶分子上敏感鍵免遭破壞。免遭破壞。B. B. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第3頁/共46頁4 4）、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境）、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境A. A. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。了共價鍵。 破壞了抗原決定簇破壞了抗原決定簇抗原

4、性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮蓋遮蓋”了抗原決定簇了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合阻礙抗原、抗體結(jié)合B. B. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成面形成“緩沖外殼緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。第4頁/共46頁三、原理 利用化學(xué)修飾劑所具有的各種基團(tuán)的特性，直接或間接地經(jīng)過一定的活化過程與酶分子的某種氨基酸殘基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而對酶分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。第5頁/共46頁四、修飾的一般程序 修飾反應(yīng) 酸化 稀釋 陽離子交換 洗滌 過濾 干燥第6頁/共

5、46頁五、化學(xué)修飾方法1、側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 定義：通過選擇性的試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 作用：探測酶分子活性部位的結(jié)構(gòu)，推測被修飾氨基酸殘基在酶分子中的功能。 側(cè)鏈基團(tuán)，組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。 側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。第7頁/共46頁極性氨基酸 1）無電荷的極性氨基酸（共7種）： 絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cyst

6、eine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q) 2）.帶正電荷的極性氨基酸（共3種）： 賴氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 組氨酸(Histidine,His,H) 3）帶負(fù)電荷的極性氨基酸（共2種）： 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)第8頁/共46頁第9頁/共46頁1）、-NH2的化學(xué)修飾(主要用于賴氨酸的修飾）第10頁/共46頁2）、-COOH的化學(xué)修飾（主要用于谷氨酸和

7、天冬氨酸）第11頁/共46頁3）、-SH的化學(xué)修飾（半光氨酸）第12頁/共46頁4）、咪唑基的修飾（ 組氨酸）第13頁/共46頁5）、胍基的修飾（精氨酸）第14頁/共46頁6）、吲哚基的化學(xué)修飾（色氨酸）第15頁/共46頁7）、（酚）羥基殘基的修飾（酪氨酸，絲氨酸, 蘇氨酸）第16頁/共46頁8）、脂肪族氨基酸殘基的修飾第17頁/共46頁8）、甲硫基的修飾（甲硫氨酸）第18頁/共46頁9）、二硫鍵的修飾第19頁/共46頁2、酶分子表面的化學(xué)修飾 利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。 水溶性大分子： 及其衍生物：是線性分子，具有良好的生物相容

8、性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性。 右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由葡萄糖通過1，6糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。 糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纖維蛋白或Y一球蛋白所得到的產(chǎn)物。其分子上具有游離氨基，活化后與酶分子上氨基反應(yīng)，從而可修飾酶。 其他天然大分子（肝素、血清白蛋白） 其它合成大分子多聚物：聚N乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇（PVA）聚丙烯酸(PAA)，聚順丁烯二酸酐，聚氨基酸等。第20頁/共46頁）的修飾（常采用單甲氧基MPEG的衍生物）第21頁/共46頁第22頁/共46頁）、右旋糖酐（可作代血漿用）及右旋糖酐硫酸酯的修飾第23頁/共4

9、6頁第24頁/共46頁）、糖肽（水解纖維蛋白或-球蛋白而獲得）第25頁/共46頁）、其他大分子（肝素、血清白蛋白）肝素，是一種含硫酸酯的粘多糖，由氨基葡萄糖和糖醛酸構(gòu)成。第26頁/共46頁第27頁/共46頁白蛋白白蛋白第28頁/共46頁3、親和標(biāo)記 前面介紹的修飾方法，其修飾劑對特定殘基的專一性修飾較差，往往會跟多個同類殘基發(fā)生反應(yīng)。為了克服這一缺陷，人們開始使用親和性標(biāo)記。它利用酶和底物的親和性，使用與酶底物或配體結(jié)構(gòu)類似的修飾劑，對酶活性部位上的氨基酸殘基進(jìn)行共價標(biāo)記。（依據(jù)抗原-抗體的親和反應(yīng)而設(shè)計的一種修飾方法，具有特異性修飾功能。）第29頁/共46頁4、肽鏈的有限水解 酶原的激活，就

10、是一種肽鏈的有限水解，即肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，酶分子的活性中心沒有受到損傷，只是激活了酶的活性或降低了酶分子的抗原性。第30頁/共46頁5、氨基酸置換修飾 氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。 通過兩個途徑實現(xiàn)： 化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少； 蛋白質(zhì)工程：利用基因操縱技術(shù)。第31頁/共46頁6、金屬離子置換修飾 改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。第32頁/共46頁六、酶經(jīng)修飾后的性質(zhì)變化 提高了酶穩(wěn)定性，改善反應(yīng)條件及延長使用壽命，改變了最適pH、Km、抑制常數(shù)、

11、減少或消除了抗原性，甚至使酶分子具備對某些組織和細(xì)胞的親和力和穿透性。第33頁/共46頁1、酶穩(wěn)定性第34頁/共46頁2、抗原性第35頁/共46頁3、對各類失活因子的抵抗力第36頁/共46頁4、半衰期及酶活殘留率第37頁/共46頁5、pH第38頁/共46頁6、Km第39頁/共46頁七、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用 1、酶結(jié)構(gòu)與功能的研究（小分子對酶側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾） 1)、非專一性化學(xué)修飾 用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用： A、若酶活性不變該基團(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán) B、若酶活性降低或喪失該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)，但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合。第40頁/共46頁2）、專一性化

12、學(xué)修飾第41頁/共46頁YYYX-YYYX位點專一性修飾：底物類似物位點專一性修飾：底物類似物第42頁/共46頁活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn) 失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。 S或可逆抑制劑有保護(hù)作用（活性中心）： 先加S或競 加共價修飾劑 透析除去S或競 活性不喪失 差別標(biāo)記： 底物或抑制劑存在 活性基團(tuán)不與修飾劑作用 去除底物或抑制劑 原來被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記化學(xué)修飾含同位素標(biāo)記的同樣試劑第43頁/共46頁2、醫(yī)藥（大分子對酶分子表面的化學(xué)修飾） 優(yōu)點：PEG分子與酶蛋白連接后可以在蛋白質(zhì)表面形成保護(hù)層，同時由于PEG分子特有的柔性和線性，能夠很好地掩蓋蛋白質(zhì)的抗原決定族，從而延長修飾酶在體內(nèi)