酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案

1、在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸（proline , Pro ）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨 酸。因此測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn) 定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。 在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。一、原理用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱 處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯

2、氨酸 含量的高低。在520nm波長(zhǎng)下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出（或用回歸方程計(jì)算）脯氨酸的含量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：待測(cè)植物（水稻、小麥、玉米、高粱、大豆等）葉片。（二）儀器設(shè)備：1. 722型分光光度計(jì)；2.研缽；3. 100ml小燒杯；4.容量瓶；5.大試管；6. 普通試管；7.移液管；8.注射器；9.水浴鍋；10.漏斗；11.漏斗架；12.濾紙；13剪刀。（三）試劑1.酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，攪拌加熱（70C）溶解，貯于冰箱中；2. 3 %磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml ；3.冰醋酸；4.甲苯

3、。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制（1） 在分析天平上精確稱(chēng)取 25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100卩g。（2） 系列脯氨酸濃度的配制取 6個(gè)50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液0.5 , 1.0, 1.5 , 2.0 , 2.5及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1 , 2, 3, 4 , 5及6卩g/ml。（3 ）取6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及 2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶 液，每管在沸水浴中加熱 30min。（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入 4ml甲苯，

4、振蕩30S，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。（5） 用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。（6） 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算 2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（卩g/2ml ）。2. 樣品的測(cè)定（1） 脯氨酸的提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取不同處理的待測(cè)植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml3 %的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min ,（提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2） 吸取2ml提取液于另一干凈的帶

5、玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在 沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。（3） 冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下 離心5min 。（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照， 在分光光度計(jì)上520nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值。四、結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出）2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（X卩g/2ml ），然后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：脯氨酸含量（卩g/g ）= X x 5/2/樣重（g ）。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二

6、醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。MDA從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，從而喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的 合成。因此，MDA的積累可能對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害。原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川 （3 , 5, 5 三甲基惡唑-2, 4。二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在532nm。但 是測(cè)定植物組織中 MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在 450nm，但532nm處也有吸收。植物遭受

7、干旱、高溫、低溫等逆境脅迫 時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDA TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為每克千重100 300ug g-1，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3+的終濃度為0 . 5umol L-1。1 .直線(xiàn)回歸法 MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm波長(zhǎng)下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖（0 25mmol L-1）與 TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光

8、 度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與 TBA顯色反應(yīng)后，測(cè)定上述三個(gè)波長(zhǎng)的消光度值， 求其直線(xiàn)方程，可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見(jiàn)的直線(xiàn)方程為：丫532 = 0. 00198 十0 . 088D 450（44 1）2 .雙組分法 據(jù)朗伯一比爾定律：D = kCL，當(dāng)液層厚度為1cm時(shí)，kD/C,k稱(chēng)為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長(zhǎng)下的消光度值等于此混合液在該波長(zhǎng)下各顯色物質(zhì)的消光度之和。已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)分別為 85 . 40、7. 40。 MDA在450nm波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故該波長(zhǎng)

9、的比吸收系數(shù)為0, 532nm波長(zhǎng)下的比吸系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：式中C1 = 11 . 71D 450C2 = 6. 45（D 532 D600）-0.56D 450C1 可溶性糖的濃度 (mmol L-1)C2-MDA 的濃度( umol L-1)D450、0532、D600分別代表450、532和600nm 波長(zhǎng)下的消光度值。儀器設(shè)備紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)1臺(tái)；1臺(tái)；1臺(tái)；10ml4支；2套；4支；刻度：10ml1支，2ml1支；剪 刀1把。試劑10 %三氯乙酸(TCA) ；0 . 6 %硫代巴比妥酸：先加少量的氫氧化鈉(1mol L-1)溶解，再用

10、10 %的三氯乙酸定容；石英砂。方法1 .實(shí)驗(yàn)材料 受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。2. MDA的提取 稱(chēng)取剪碎的試材1g，加入2mll0 % TCA和少量石英砂，研磨至勻漿， 再加8mlTCA進(jìn)一步研磨，勻漿在 4000r min-1離心10min，上清液為樣品提取液。3. 顯色反應(yīng)和測(cè)定 吸取離心的上清液2ml(對(duì)照加2ml水),加入2ml 0 . 6% TBA溶液，混 勻物于沸上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測(cè)定532 > 600和450nm波長(zhǎng)下的消光度。4 .計(jì)算含量(1) 直線(xiàn)方程法 按公式44-1求出樣品中糖分在532nm處的消光度值 Y

11、532，用實(shí)測(cè)532nm的消光度值減去6nm非特異吸收的消光度值再減去Y532，其差值為測(cè)定樣品中MDA TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm的消光度值。按 MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算求出提取液 中MDA濃度。(2) 雙組分分光光度法 按公式44-3可直接求得植物樣品提取液中 MDA的濃度。 用上述任一方法求得 MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計(jì)算測(cè)定樣品中MDA的含量。：MDA含量(umol g-1) = MDA濃度(umol L-1)x提取液體積(ml) /植物組織鮮重(g) (44 4)植物紹織中丙朋育雖的測(cè)定作者佚名文章來(lái)源！吉林農(nóng)業(yè)人學(xué)-J.uliffi: 595更新時(shí)何

12、2006-10-220:21:23一、原理植物器官衰老或在逆境卞遭受傷害，往往發(fā)生腮脂過(guò)氧化作用，丙二MDA ) 是膜脂過(guò)氧化作用的愷終分解產(chǎn)物.黃會(huì)量可以反映植物瀏受逆境傷書(shū)的秤皮。 丙二饉衽酸性和高溫條件，可以與疏代巴比妥酸< THA )反應(yīng)生成紅棕色的三 甲川(那£5三甲基惡哇2, 4-二酮)，在532 mn 4L有最大光吸收，在600 nm處育堆小光吸收.該復(fù)合物的吸止系數(shù)為155( L ? cm )可按公式：A 532 A 600 = 155000 X C X L 算出 MDA 濃度 C.(卩 nol/L ) 進(jìn)-步算出單位重量鮮組織中MDA含:畢(p mol/g )

13、"式中* A 532和A6Q0 分別表示532 Tim和600 run處的吸丸度f(wàn)fh L為比色杯厚度(cm ) <需要指出的是.植物組織中糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)MDA-TBA反應(yīng)有干擾作用為消除這種 干擾*經(jīng)試驗(yàn)，可用下列公式消除由MWrJlfe的誤差，C ( P mo I /L ) = &t45 ( A 532 - A 6Q0 ) 一 0, 56A 450式中：A 450 v A 532 和 A 600 分別表示 450 nm、532 nm 和 600 nm J± 的吸光度值。算出植物樣品提取液中MDA的濃度后*可1S步算出武在植物紐 織中的帑星.二、實(shí)驗(yàn)材料試劑勺儀器設(shè)備< -)實(shí)驗(yàn)材料植物的報(bào)或葉片.(二試劑1 *5 %三氯乙酸(TCA ) 2 ,0.6%硫代巴叱妥fg ( TRA )溶液：稱(chēng)取硫代巴比妥醱0.6g 于5 %TCA溶解井用英定容至100 mb *(三)儀器設(shè)備研缽.恒溫水浴鍋.分光光度計(jì).離心機(jī)，天平劉度試ft移液管三、賓驗(yàn)步驟L MDA的提取稱(chēng)収植物材料1 e、剪碎.加入2汕5% TCA和少量石英砂,礎(chǔ)聲至勻漿.再加I 8叭TCA進(jìn)-步研臍，勻漿在4<JW rAiin離也10 min .I精液為樣品提取液.2、顯色反欣和測(cè)定吸収