生化與分子生物學(xué)研究思路與技術(shù)-陳漢春課件

1、1生化與分子生物學(xué)生化與分子生物學(xué)研究思路與技術(shù)研究思路與技術(shù)中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)系,生物化學(xué)研究所陳漢春E-mail: 2生物化學(xué) : 研究活細(xì)胞及有機(jī)體內(nèi)各種分子及其相互間化學(xué)反應(yīng)的科學(xué)。 研究活細(xì)胞的化學(xué)組成及相互反應(yīng)和進(jìn)程的科學(xué)，即“生命的化學(xué)” 。 生命科學(xué)的基礎(chǔ)語(yǔ)言，即研究生命的分子基礎(chǔ)(molecular basis of life)。 3一.生物化學(xué)研究的目的：從分子水平了解活細(xì)胞相關(guān)的所有化學(xué)進(jìn)程。對(duì)健康、營(yíng)養(yǎng)的理解和維持以及對(duì)疾病的發(fā)生機(jī)理的闡明和有效治療。 4 二.生物化學(xué)的研究對(duì)象： 研究生物分子的組成成分如碳、氫、氧、氮、磷

2、等化學(xué)元素以及水和無(wú)機(jī)鹽代謝。 研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多糖及脂類的結(jié)構(gòu)、功能、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及這些生物大分子的代謝和相互作用。5三三.生物化學(xué)生物化學(xué)研究的發(fā)展：發(fā)展： 生物化學(xué)研究歷經(jīng)兩百多年進(jìn)入分子生物學(xué)年代，走過(guò)了三個(gè)發(fā)展階段： 敘述生物化學(xué)階段 動(dòng)態(tài)生物化學(xué)階段 功能或分子生物化學(xué)階段 61. 敘述生物化學(xué)(descriptive biochemistry)階段(17701903) 又稱為靜態(tài)或形態(tài)生物化學(xué)(static or morphological biochemistry)。研究生物體內(nèi)主要化學(xué)物質(zhì)的組成；分離出各種氨基酸、脂酸、甘油、糖類、檸檬酸、乳酸和

3、蘋果酸；從肝中分離出糖元；發(fā)現(xiàn)了核質(zhì)（nuclein）及核酸；奠定了酶學(xué)基礎(chǔ)理論。7我國(guó)人民在公元前二十一世紀(jì)，已用曲釀酒，稱曲為酒母，又叫做酶；公元前十二世紀(jì)，已將豆、谷發(fā)酵，搗爛、加鹽以造醬，并制出麥芽糖，當(dāng)時(shí)稱為 “飴”。公元九世紀(jì)或十世紀(jì)已制成豆?jié){和豆腐。此階段中國(guó)人民的貢獻(xiàn)：82. 動(dòng)態(tài)生物化學(xué)(dynamic biochemistry)階段（19031950） 又稱為生理化學(xué)（physiological chemistry）。主要研究生物體內(nèi)組成物質(zhì)的化學(xué)變化。分離制備結(jié)晶酶；闡明細(xì)胞氧化和呼吸鏈及維生素和激素化學(xué)性質(zhì)與生理作用；建立了有關(guān)發(fā)酵和三羧酸循環(huán)、脂酸的氧化作用以及肝中尿

4、素合成的完整生化途徑等。9此階段中國(guó)人民的貢獻(xiàn)： 我國(guó)生物化學(xué)家建立了血濾液制備與血糖測(cè)定的生化方法；提出了蛋白質(zhì)變性學(xué)說(shuō)；首先使用定量分析技術(shù)研究抗原抗體反應(yīng)的機(jī)理。103. 功能或分子生物化學(xué)（functional or molecular biochemistry）階段 （1950年至今） 從分子水平探索蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)和它們的相互作用，包括蛋白質(zhì)和核酸的提純及其化學(xué)組成、氨基酸或核苷酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列以及空間構(gòu)型、構(gòu)象的確定；建立DNA雙螺旋模型；人工合成肽激素、tRNA和核酶；建立分子克隆技術(shù)和遺傳工程技術(shù)等。 11此階段中國(guó)人民的貢獻(xiàn)： 我國(guó)生化工作者于1

5、965年首先成功合成了有生物活性的牛胰島素；1972年借助X-射線衍射技術(shù)研究了豬胰島素分子的晶體結(jié)構(gòu)；1981年首次合成具生物活性的酵母丙氨酸t(yī)RNA；九十年代，成功制備重組因子和促紅細(xì)胞生成素(EPO)；參與完成人類基因組計(jì)劃。12四四.生化研究的基本思路生化研究的基本思路 和技術(shù)路線：和技術(shù)路線： 經(jīng)典的生物化學(xué)研究包括三個(gè)主要步驟： 分離細(xì)胞器和生物分子。 判斷生物分子的結(jié)構(gòu)。 分析生物分子的功能和代謝（合成與 分解）及其相互作用。131 .細(xì)胞器和生物分子的分離： 細(xì)胞器是一種獨(dú)立亞細(xì)胞單位。一般采用勻漿及離心等進(jìn)行亞細(xì)胞分離。分離后還必須采用測(cè)量“標(biāo)志”酶及特殊化學(xué)成分或電子顯微鏡

6、觀察的方法來(lái)評(píng)估各亞細(xì)胞組分。 14 要了解生物分子的結(jié)構(gòu)，首先必須得到純化的生物分子。用于分離和純化生物分子的方法很多，例如鹽析法、層析法、凝膠過(guò)濾、電泳、超速離心等。要得到均一性的生物分子往往需要綜合性采用多種方法。15亞細(xì)胞器/單位 標(biāo)志物 主要功能細(xì)胞核線粒體核糖體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶酶體胞膜高爾基復(fù)合體過(guò)氧化物酶體細(xì)胞骨架細(xì)胞質(zhì)DNA谷氨酸脫氫酶高豐度的RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5-核苷酸酶半乳糖基轉(zhuǎn)移酶過(guò)氧化氫酶,尿酸氧化酶沒(méi)有特征性酶乳酸脫氫酶組成染色體，攜帶遺傳信息。以自身為模板指導(dǎo)合成RNA（轉(zhuǎn)錄）。三羧酸循環(huán)，氧化磷酸化。蛋白質(zhì)合成位點(diǎn)（以mRNA為模板

7、翻譯成蛋白質(zhì)）。合成多種脂類，氧化外源性生物分子（細(xì)胞色素P450）。含有眾多水解酶（酶促降解反應(yīng)）。轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞，細(xì)胞粘附和聯(lián)系。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，糖基化作用，硫化反應(yīng)。降解部分脂肪酸和氨基酸，產(chǎn)生和分解過(guò)氧化氫。微絲、微管、中間纖絲。糖酵解酶類，脂肪酸合成酶。細(xì)胞器的標(biāo)志性成分和主要功能 162 .生物分子的結(jié)構(gòu)確定 ： 質(zhì)譜和核磁共振。 某些已知特性的酶。 X-射線衍射和晶體學(xué)方法。173 .生物分子的功能和代謝分析：1）生物分子的功能分析 人類和動(dòng)物的研究最初是從動(dòng)物整體水平開(kāi)始的，例如對(duì)呼吸和消化的研究。將許多整體動(dòng)物水平的復(fù)雜現(xiàn)象轉(zhuǎn)移到體外研究則簡(jiǎn)單得多。18 策略 方法動(dòng)物

8、整體水平研究去除一個(gè)器官(例如切除肝臟)。改變能量來(lái)源(例如禁食)。給予藥物(例如苯巴比妥)。給予有毒藥物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病的動(dòng)物(例如糖尿病)。離體器官灌注肝臟、心臟、腎臟灌注。灌注可以維持離體器官的功能達(dá)數(shù)小時(shí)，可以不受其它器官和神經(jīng)系統(tǒng)的影響而獨(dú)立研究某個(gè)器官。組織切片細(xì)胞研究組織勻漿如肝臟切片。器官切片不受該器官其它部分的影響,但由于缺氧，在幾小時(shí)內(nèi)切片組織的狀態(tài)會(huì)變差。如血細(xì)胞,因?yàn)檠?xì)胞相對(duì)容易純化。細(xì)胞可在體外較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)?？梢约尤牖蛉コ承┨厥獬煞侄芯克鼈兊淖饔谩Ｍㄟ^(guò)離心分離亞細(xì)胞器。分離細(xì)胞器分離亞細(xì)胞組分 抽提、離心制備，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能研究。超離心制備，細(xì)

9、胞器功能研究。代謝物和酶的分離及特征確定化學(xué)組成、組織表達(dá)譜、酶學(xué)特性及化學(xué)反應(yīng)途徑分析。酶或蛋白質(zhì)的基因克隆生物信息學(xué)分析蛋白質(zhì)功能分析基因克隆及其編碼的酶或蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析，基因定位及表達(dá)調(diào)控分析。序列比較、空間結(jié)構(gòu)及功能域預(yù)測(cè)?；蚯贸蜣D(zhuǎn)基因動(dòng)物，核酸-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。不同層次研究生物分子功能的方法 192）生物分子的代謝分析： 生化代謝途徑是指一系列由酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)包括由一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)單的分子合成復(fù)雜的復(fù)合物以及一個(gè)復(fù)合物降解為其終產(chǎn)物的過(guò)程。 20 某些氨基酸、糖和脂肪酸可以與一個(gè)合適的穩(wěn)定同位素結(jié)合，然后注入動(dòng)物體內(nèi)或用于體外實(shí)驗(yàn)來(lái)觀測(cè)它們

10、的代謝過(guò)程。這些研究證實(shí)代謝是一個(gè)很活躍的過(guò)程，細(xì)胞內(nèi)大部分復(fù)合物都在不停地合成和降解。 21五.分析生化反應(yīng)的總體策略 ： 整體動(dòng)物水平觀察和推論某種生化反應(yīng)或代謝途徑的存在 將它定位于一個(gè)或多個(gè)器官 定位于一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞器或亞細(xì)胞組分 純化該反應(yīng)的底物、產(chǎn)物、酶和輔因子及其它成分 確定該反應(yīng)的體外控制機(jī)制 分析該反應(yīng)的體內(nèi)調(diào)控機(jī)制 體內(nèi)外重建該反應(yīng) 。22六六.生化研究技術(shù)的進(jìn)步：生化研究技術(shù)的進(jìn)步： 生命科學(xué)研究的主要目的在于獲得最新的基礎(chǔ)信息，例如純化和鑒定新發(fā)現(xiàn)的酶及其功能，生物化學(xué)與分子生物學(xué)新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，為生命科學(xué)研究工作者提供了有用的工具。23 1.細(xì)胞器及生物分子的

11、分離與純化： 研究細(xì)胞器及生物分子的結(jié)構(gòu)與功能及其代謝和作用機(jī)制，必須從組織或細(xì)胞中分離出這些生物分子或亞細(xì)胞復(fù)合物。24基本技術(shù)：勻漿離心層析電泳25 1）勻漿: 破壞細(xì)胞或組織的固有結(jié)構(gòu)，使 細(xì)胞破裂而釋放胞內(nèi)容物 。方法: 化學(xué)(酶消化)、物理(超聲)或機(jī)械(碾磨)。要求: 保持生物分子或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。措施: 合適pH值、合適離子強(qiáng)度、緩沖液、 低溫(0 4 ) 、短時(shí)間、蛋白酶抑 制劑、核酸酶抑制劑。26 使樣品繞離心機(jī)轉(zhuǎn)軸的中心旋轉(zhuǎn)而獲得一個(gè) 遠(yuǎn)大于地球重力的沉降應(yīng)用力，樣品介質(zhì)中 不同大小、形狀和密度的顆粒將以不同的速 度沉降。影響因素: 離心力(轉(zhuǎn)速及顆粒與中心軸的 距離)

12、，顆粒的大小、形狀、密 度，介質(zhì)的粘度。 2）離心：27低速離心: 6 000 r/min 、室溫， RCF (相對(duì)離心力)6 000 g 。高速離心: 6 000 25 000 r/min 、低溫， RCF = 6 000 60 000 g 。超速離心: 25 000 r/min 、低溫 + 真空， RCF = 60 000 600 000 g 。差速離心: 連續(xù)用幾種遞增的離心速率離心。密度梯度離心: 樣品中不同組份在離心力場(chǎng)的 作用下停留于相應(yīng)密度的支持物 層面。類型:28 根據(jù)樣品中各組分物理生化特性、分子大小形狀、所帶電荷、揮發(fā)性、溶解性及吸附性或親和性等的不同而將它們分離。 類型:

13、 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾、疏水相互作用層析、親和層析、共價(jià)層析和金屬螯合層析。 3）層析（色譜分析）：29 常用層析法: 薄層層析和紙層析； 柱層析； 高效液相層析 ； 氣相色譜。30 薄層層析和紙層析: 將樣品點(diǎn)在薄層或紙(支持基質(zhì)又稱層析床或固定相 )的一端，展層劑(流動(dòng)相)沿著薄層或紙向上展開(kāi)并帶動(dòng)樣品中的物質(zhì)遷移。 相對(duì)遷移率: Rf = 組分移動(dòng)距離/溶劑移動(dòng)距離； Rx = 待測(cè)物移動(dòng)距離/標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)距離。 31 柱層析: 將樣品從裝有固定相的柱頂部加入，然后在重力或蠕動(dòng)泵的作用下使流動(dòng)相過(guò)柱并帶動(dòng)樣品中的不同組分進(jìn)入固定相，樣品中各組分在固定相中會(huì)形成不連續(xù)帶

14、型，繼而用流動(dòng)相洗脫，分別收集各時(shí)間段流出的洗脫液進(jìn)行定量或定性分析。 3233 4）電泳： 根據(jù)帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中移動(dòng)的原理而分離、分析復(fù)雜混合物及純化、鑒定離體生物分子。 影響因素: 分子所帶的凈電荷量、分子的形狀與大小及電場(chǎng)強(qiáng)度。 34 電泳支持物:惰性支持物(如醋酸纖維素) : 僅提供物理支持，分離效果取決于電荷密度 。 多孔支持物(如Agarose、PAG) :同時(shí)利用了分子篩效應(yīng)，分離效果取決于電荷密度和分子大小及形狀。 35 電泳緩沖系統(tǒng): 連續(xù)緩沖系統(tǒng): 樣品、凝膠和緩沖液含有相同的緩沖離子， 具有相同的pH值。 非連續(xù)緩沖系統(tǒng): 凝膠及緩沖液中的緩沖離子和pH值均不同。36

15、 常用電泳技術(shù):基本電泳等電聚焦毛細(xì)管電泳雙向電泳37基本電泳:紙電泳、醋纖膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。3839等電聚焦:在pH梯度下進(jìn)行。pH梯度由結(jié)構(gòu)類似的小分子量?jī)尚噪娊赓|(zhì)形成，等電點(diǎn)(pI)在pH 310之間。當(dāng)存在外加電場(chǎng)時(shí)，每一種兩性電解質(zhì)向其pI值處移動(dòng)而形成穩(wěn)定的pH梯度。電泳過(guò)程中每一種帶電分子都朝自己的pI位置移動(dòng)而被分離。40 毛細(xì)管電泳: 毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)在于分辨力高和應(yīng)用范圍廣，可以分析極少量的樣品(5 nl10 nl)。較常應(yīng)用的有毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳和毛細(xì)管等電聚焦。41 雙向電泳雙向電泳是一種分辨力極高的電泳技術(shù)，目前廣泛用于基因表達(dá)譜

16、及蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可一次性分離1000多種蛋白質(zhì)。第一向:根據(jù)蛋白質(zhì)所帶的電荷而進(jìn)行等電聚焦。第二向:利用樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量不同，在另一方向上進(jìn)行SDS-PAGE。42432D gel in proteomics44點(diǎn)匹配結(jié)果: 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛋白點(diǎn)匹配圖452.生物分子的分離與純化：1）蛋白質(zhì)純化；2）DNA提取；3）RNA提取；4）糖類提??；5）脂類提取。46 1）蛋白質(zhì)純化:目的: 確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān) 系；研究酶的動(dòng)力學(xué)及其調(diào)節(jié)；藥用成份的 分離與鑒定。方法: 勻漿、離心、電泳、過(guò)濾、層析、抽提、透 析等。要求: 合適的緩沖體系、低溫、蛋白酶抑制劑。濃度和質(zhì)量檢測(cè)

17、: 分光光度法、PAGE 。47 2）DNA提取:原則 : 保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。 去除雜質(zhì)，保證核酸足夠純。步驟： 破膜 釋放出目的核酸。 分離 通過(guò)酶、有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH 值、離心等手段得到粗制品。 純化 進(jìn)一步去除雜質(zhì)。濃度和質(zhì)量檢測(cè): 分光光度法、 Agarose凝膠電泳。 48基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜M: DNA/HindIII 分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道14分別代表4個(gè)不同樣品的基因組DNA49 3） RNA提取:哺乳動(dòng)物細(xì)胞總RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA (10%-15%)、mRNA(1%-5%)組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)

18、胞質(zhì)中。注意事項(xiàng): 使用RNA酶抑制劑； 防止污染。 50總RNA和mRNA的瓊脂糖凝膠（1）電泳圖譜51七. 生物分子的結(jié)構(gòu)與功能分析： 1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 2. 酶活力檢測(cè) 3. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 4. DNA序列分析 5. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）6. 分子雜交 7. 基因克隆 8. 基因組文庫(kù)構(gòu)建 9. cDNA文庫(kù)構(gòu)建 10. 文庫(kù)篩選 11. 報(bào)告基因檢測(cè) 12. 基因芯片 13. 基因敲除 14. RNAi15. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 52分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基末端的氨基酸殘基測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基末端的氨基酸殘基把肽鏈

19、水解成片段，分別進(jìn)行分析把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過(guò)組合排列對(duì)比，最終得出完整肽鏈中氨順序，然后經(jīng)過(guò)組合排列對(duì)比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。基酸順序的結(jié)果。1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析:53通過(guò)核酸來(lái)推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列通過(guò)核酸來(lái)推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因分離編碼蛋白質(zhì)的基因測(cè)定測(cè)定DNA序列序列排列出排

20、列出mRNA序列序列54 2. 酶活力檢測(cè): 酶是一類加快特定生化反應(yīng)速度的球蛋白。在底物濃度、pH值及溫度等適宜的條件下，每種酶控制著一些結(jié)構(gòu)相似的底物生成產(chǎn)物。 酶活性單位(SI單位)：在最適條件下，一秒內(nèi)將1 mol底物全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 55 3. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析: 一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)。蛋白質(zhì)是基因功能的實(shí)施者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的基礎(chǔ)。 方法: 二維電泳、質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片等。 56 4. DNA序列分析: DNA序列分析(DNA sequencin

21、g)即測(cè)定DNA鏈中四種核苷酸(堿基)的排列順序。 測(cè)序反應(yīng)使用特異引物與單鏈DNA模板結(jié)合，由DNA聚合酶催化引物延伸，當(dāng)遇到雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)時(shí)即發(fā)生堿基特異性鏈終止，引物延伸合成的新鏈DNA即是待測(cè)DNA模板的互補(bǔ)鏈。 57 5. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）: Polymerase chain reaction（ PCR）技術(shù)是利用DNA 聚合酶在體外條件下，催化一對(duì)引物之間特異DNA片段合成的基因擴(kuò)增技術(shù)。 PCR包括三個(gè)基本過(guò)程： 變性； 退火； 延伸。 這三個(gè)過(guò)程組成一個(gè)循環(huán)周期,每個(gè)周期合成的產(chǎn)物又可作為下一個(gè)周期的模板，如此循環(huán)往復(fù)，目的DNA片段的拷貝數(shù)呈指數(shù)形式擴(kuò)增

22、。 58在在DNA變性后的復(fù)性過(guò)程中，如果將不變性后的復(fù)性過(guò)程中，如果將不同種類的同種類的DNA單鏈分子或單鏈分子或RNA分子放在同一分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，在適宜的條件（溫度程度的堿基配對(duì)關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成成雜化雙鏈雜化雙鏈(heteroduplex)。6. 分子雜交分子雜交(hybridization) 59DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復(fù)性復(fù)性 不同來(lái)源的不同來(lái)源的DNA分子分子60 Southern印跡

23、雜交 : 利用瓊脂糖凝膠電泳將經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化的DNA片段分離，并使這些DNA片段在凝膠原位經(jīng)堿變性處理后, 從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持物上，再與標(biāo)記的核酸探針雜交，經(jīng)檢測(cè)確定膜上與探針互補(bǔ)的電泳區(qū)帶位置。61 Northern印跡雜交 : 用于檢測(cè)組織、細(xì)胞中某基因的表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)水平。 基本原理和方法與Southern印跡雜交相似: RNA在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，被轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，然后與標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交。62 Western免疫印跡: 基本過(guò)程與Southern 印跡雜交和Northern印跡雜交十分相似，都是由凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交和信號(hào)顯示等步驟組成。不同

24、之處是Western免疫印跡檢測(cè)的是蛋白質(zhì)，使用的凝膠是SDS聚丙烯酰胺凝膠, 所用的探針是蛋白質(zhì)抗體。 63 7. 基因克隆: 用酶學(xué)方法將不同來(lái)源的DNA分子在體外進(jìn)行剪切和重新連接，組裝成一個(gè)新的DNA分子。在此基礎(chǔ)上，將這個(gè)DNA分子導(dǎo)入到一定的宿主細(xì)胞，使它能夠在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過(guò)程即稱為基因克隆(gene cloning)。 64基因克隆包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)： 目的基因和載體的獲得； 目的基因與載體連接，形成重組分子； 重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞； 含有重組DNA分子的細(xì)胞的篩選和擴(kuò)增。65 8. 基因組文庫(kù)構(gòu)建: 基因組文庫(kù)(genomic DNA libr

25、ary)是含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。 提純?nèi)旧wDNA，通過(guò)機(jī)械剪切或酶切使之成為一定大小的片段，并與適當(dāng)?shù)妮d體DNA連接和轉(zhuǎn)染宿主菌，得到一組含有不同DNA片段的重組分子。 66 9. cDNA文庫(kù)構(gòu)建: cDNA是指以mRNA為模板，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化形成的互補(bǔ)DNA（cDNA），其核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板mRNA鏈；再以cDNA為模板，由DNA聚合酶合成第二鏈，得到互補(bǔ)雙鏈DNA。 67 將雙鏈cDNA產(chǎn)物與載體（質(zhì)?；蚴删w）DNA重組，并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌或包裝成噬菌體顆粒，得到重組克隆混合體。每個(gè)克隆含單獨(dú)一種cDNA (mRNA)分子，克隆總和則包含細(xì)胞的全部mR

26、NA信息。 cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA(cDNA library): library):68 10. 文庫(kù)篩選: 文庫(kù)篩選方法： 核酸分子雜交、免疫學(xué)方法等。 通過(guò)文庫(kù)篩選，可以獲得全長(zhǎng)基因、分離出對(duì)應(yīng)稀有mRNA的cDNA片段及鑒定目的重組子等。 69 11. 報(bào)告基因檢測(cè): 報(bào)告基因(reporter gene)是指那些表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測(cè)的基因。利用基因重組技術(shù)，將待檢測(cè)的DNA片段插入報(bào)告基因表達(dá)載體中報(bào)告基因的上游，然后轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞并表達(dá)，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物，即可推測(cè)出該DNA片段在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。 70 12. 基因芯片: 基因芯片(gene chip)是九十

27、年代中期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，它融合了生命科學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等多學(xué)科的最新技術(shù)。71DNA芯片（芯片（基因芯片） 將大量的已知的DNA片段作為探針，有序地、高密度地排列在玻離、硅等載體上。 將待測(cè)樣品用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并與DNA芯片進(jìn)行分子雜交后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。通過(guò)對(duì)芯片掃描獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。72 芯片設(shè)計(jì) 73目目 錄錄7475 13. 基因敲除: 基因敲除（gene knock out），類似早期生理學(xué)研究的三部曲: 切除部分觀察整體推測(cè)功能。 gene knock out是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除

28、，或用其它序列相近基因取代，然后從整體及分子水平觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。 76基因敲除的技術(shù)路線： （1）構(gòu)建重組基因載體。（2）用電穿孔、顯微注射等方法將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)。（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞。（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。77 siRNA (small interfering RNAs： 2123核苷酸長(zhǎng)的核苷酸長(zhǎng)的 dsRNA小片段小片段 ) 14. RNA interference雙鏈雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻抑作用被稱為對(duì)基因表達(dá)的阻抑作用被稱為RNA干預(yù)干預(yù)（RNA interference, RNAi），是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平），是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。的基因沉默。 78安德魯法爾(Andrew Fire， 1959年)， 美國(guó)斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授克雷格梅洛(Craig C. Mello, 1960年)，美國(guó)馬薩諸塞州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授。79RNA干擾過(guò)程圖干擾過(guò)程圖 80 特異性降解同源mRNA，具有傳遞性（細(xì)胞間傳遞及生物個(gè)體代間傳遞）。 RNAi的特征 81 RNAi研究被Science雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)成就之一； RNAi研究被列為2002年Science雜志評(píng)的十大科學(xué)成就之首； RNAi研究被授予