劉小龍-循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測策略及臨床意義

1、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測策略及臨床意義劉小龍，劉小龍， 博士、研究員博士、研究員福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院，中國科學院海西研究院轉化醫(yī)學研究中心福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院，中國科學院海西研究院轉化醫(yī)學研究中心2015.06.12l 腫瘤診療的困境：早期診斷困難，錯過最佳治療時機；易復發(fā)轉移，預后差；放化療易產生耐受；缺乏有效的治療靶點等。l 早診早治，實時監(jiān)控、靶向用藥及個體化診療是提高腫瘤遠期生存率、降低死亡率的關鍵。腫瘤診斷方法l 血清標志物：蛋白類（癌胚抗原，糖類抗原，甲胎蛋白等），核酸類（microRNA, LncRNA）l 影像學診斷(超聲，CT，MRI，PET，PET-CT)l

2、 循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell , CTC）l 循環(huán)腫瘤DNA（ circulating tumor DNA，ctDNA）循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)l 人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征（包括突變，缺少，插入，重排，拷貝數異常，甲基化等）來自腫瘤基因組的DNA片段；l 來源：1、來自于壞死的腫瘤細胞；2、來自于凋亡的腫瘤細胞；3、循環(huán)腫瘤細胞；4、來自于腫瘤細胞分泌的外排體；l 含量低，約占整個循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.01%。ctDNA發(fā)展簡史l 1948年首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DNA，癌癥患者的循環(huán)腫瘤DNA則發(fā)現(xiàn)于1977年。l 1994年

3、發(fā)現(xiàn)這些DNA含有癌癥的標志性突變，證明其來自于腫瘤。l 鑒于腫瘤DNA會流入血液，香港中文大學的盧煜明（Dennis Lo）教授推測胎兒DNA應該也能進入血液。1997年證明孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。該發(fā)現(xiàn)允許醫(yī)生們在懷孕初期通過無創(chuàng)方式檢測胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合癥等發(fā)育疾病。這是產前診斷領域的一次革命。Nature Reviews Cancer 11, 426-437 (June 2011) | doi:10.1038/nrc3066Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patientsctDNA發(fā)展簡史研究熱點近1

4、0年ctDNA相關發(fā)表文章數（pubmed數據庫）NEJM：4篇PNAS：7篇JAMA：1篇Sci Transl Med：6篇Cancer research:12篇Clin Cancer Res:28篇ctDNA優(yōu)勢l無創(chuàng)、無損、實時、多次；l當不能獲得腫瘤組織信息時，可以開展“液體活檢”；l假陽性率低，靈敏度高，準確度高，可用于腫瘤的早期診斷；l能夠對腫瘤的演化和適應性改變進行監(jiān)控；l能夠對腫瘤病人的治療效果進行實時監(jiān)控（尤其在追蹤腫瘤轉歸、轉移和復發(fā)等方面），并進行個性化的治療方案指導（如個性化靶向藥物用藥，個性化化療等）。 一類具備廣泛應用前景的腫瘤標志物，可無創(chuàng)的用于腫瘤早期診斷、發(fā)展

5、過程監(jiān)測、預后判斷、以及個性化用藥指導。ctDNA檢測技術敏感度已知突變位點檢測（突變率 2%）l全基因組測序l全外顯子測序lRNA末端平行分析法l全基因組甲基化測序數字PCRl 將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數。陰性微滴比例推算陰性微滴比例推算起始靶分子的絕對量起始靶分子的絕對量泊松分布一個一個待分析的待分析的PCR反應體系反應體系成千上萬個成千上萬個獨立的獨立的PCR反應體系反應體系: : 靶標分靶標分子子: :有限稀釋:

6、 陽性微滴（陽性微滴（1 1）: 陰性微滴（陰性微滴（0 0）泊松分布泊松分布PCR擴增優(yōu)點：可絕對定量，靈敏度可達單個核酸分子，檢測限低至0.001%；缺點：只能檢測已知的突變位點，通量低；l利用數字PCR監(jiān)測肺癌病人中第一次服用埃羅替尼抗腫瘤藥物后的血漿EGFR突變情況。l經過治療后，所有病人的EGFR突變都出現(xiàn)下降，其中有8個病人突變完全消失。l有6個病人的EGFR突變在后續(xù)出現(xiàn)上升，提前揭示疾病進展。另外3個病人的EGFR突變沒有變化，病情無明顯進展。數字PCR可以用于評估和監(jiān)測血漿中ctDNA的特異突變l 結合數字PCR與流式技術，利用特異性PCR引物擴增目標突變區(qū)后，與磁珠（磁珠上

7、固定有特異的PCR 引物）混合進行油包水單分子擴增反應。反乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結合磁珠上的PCR產物，發(fā)出紅色或綠色熒光。使用流式細胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。 BEAMing技術l利用腫瘤組織進行sanger測序定義腫瘤組織的基因突變；l再利用Beaming技術檢測18例癌癥病人中192份血漿樣本中ctDNA的突變情況，檢測靈敏度可達到0.005%。 術前:13.4% 術后:0.015% 術后(48天):0.11% 術后(244天):0.66% ctDNA: P = 0.006CEA: P = 0.03Comparison of ctDNA, CEA and imaging

8、 dynamics in individual study subjectsl病人都經過多次手術和化療l第一次手術進行局部切除時，ctDNA含量并沒有降低；第二次手術完全切除時，ctDNA含量大幅下降。lctDNA能實時顯示病人體內腫瘤負荷的動態(tài)信息，以及治療的效果（手術及化療）。標記擴增深度測序（TAM-Seq）l 二步擴增： 預擴增：利用特異性引物進行15偱環(huán)的目標區(qū)域擴增 標簽擴增：利用通用不同特性的接頭標簽進行二次擴增l 雙向重復測序：提高測序精度l 突變頻率檢出率可達2%l 敏感性和特異性高于97%l 成本較低，利于臨床應用l設計了48對引物去擴增TP53，EGFR，BARF，KRA

9、S等癌癥相關基因的5995bp突變區(qū)域l同時可對10個特異的癌癥突變位點進行監(jiān)控l用于確定多發(fā)癌癥患者的復發(fā)病灶l用于監(jiān)控癌癥患者的腫瘤動態(tài)發(fā)展癌癥個體化深度測序 (CAPP-Seq)l 該方法利用定制化的突變位點庫作為”篩選器”， 對樣本進行靶向捕獲后再進行超深度測序（可達到10000X），其對腫瘤的ctDNA檢測靈敏度更高，特異性更強，與全外顯子測序等相比經濟可行。l Stage I 檢出率50%l Stage II-IV 檢出率100%l 特異性可達到96%l 突變檢出率0.02%lSelector 區(qū)域：139個基因的521個外顯子和13個內含子，約125K，占人基因組的0.004%l

10、測序覆蓋深度10000Xl腫瘤的早期診斷l(xiāng)動態(tài)監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展及療效l評估腫瘤的異質性l評估腫瘤復發(fā)轉移風險l靶向檢測耐藥突變，跟蹤獲得性耐藥的發(fā)展，進行個性化用藥指導ctDNA的臨床應用的臨床應用ctDNActDNA的分析指標4cfDNA含量含量1235ctDNA突變頻率突變頻率微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性完整性ctDNA甲基化頻率甲基化頻率ctDNA的分析指標4cfDNA含量含量1235ctDNA突變頻率突變頻率微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性完整性ctDNA甲基化頻率甲基化頻率l 乳腺癌病人（尤其在轉移性乳腺癌）的血漿cfDNA的完整性顯著下調，而血漿cfDNA的濃

11、度顯著上調，可作為早期診斷的標志物，具有較好的敏感度和特異性。l肝癌病人的血漿中存在兩種不同長度的DNA分子：短鏈DNA分子（180bp ）；l短鏈DNA分子與ctDNA突變率及拷貝數異常相關，且與ctDNA濃度正相關；l長鏈DNA分子不攜帶腫瘤相關ctDNA特征，且與ctDNA濃度負相關。l 肝癌病人血漿中線粒體DNA的含量顯著高于健康人、乙肝及肝硬化患者，對肝癌的診斷具有較高的靈敏性和特異性，分別達80%和94%，可作為肝癌診斷的有效分子標記。Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):E1317-25. doi: 10.1073/pnas.

12、1500076112. Epub 2015 Feb 2.LengtheningandshorteningofplasmaDNAinhepatocellularcarcinomapatients.線粒體DNA可用于肝癌的診斷J Clin Pathol 2013;66:775-778AmericanJournalofClinicalPathology2015;143(1):18-24.PLoSOne.2015;10(4):e0108247.ctDNA的分析指標4cfDNA含量含量1235ctDNA突變頻率突變頻率微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性完整性ctDNA甲基化頻率甲基化頻率l 利用數

13、字PCR檢測640例不同癌癥病人的血漿ctDNA，在超過75%的病人血液中檢測到ctDNA，原發(fā)癌檢出率約為50%。l在結腸癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA檢出率分別為73%, 57%, 48%, 50% 。l 相對于原發(fā)癌，ctDNA在轉移癌中檢出率更高，且分期越高，ctDNA檢出率也更高；l可用于耐藥突變的檢測；lctDNA是普遍適用的、敏感和特異的標志物,可用于不同類型癌癥患者的臨床監(jiān)測。NEnglJMed2013;368:1199-1209l在30例轉移性乳腺癌患者接受系統(tǒng)性治療的不同時間點測定血液中的ctDNA，CA 15-3， CTC細胞的含量，比較三者之間的敏感度。Comp

14、arison of Circulating Tumor DNA, CA 15-3, and Circulating Tumor Cells as Blood-Based Biomarkers 靈敏度：偱環(huán)腫瘤DNA：85%CA 15-3：59% 靈敏度：偱環(huán)腫瘤DNA：90%偱環(huán)腫瘤細胞：67% Comparison of Circulating Biomarkers to Monitor Tumor Dynamics and Predict Survival.l結論：相對于蛋白類診斷標志物CA15-3及血液中的偱環(huán)腫瘤細胞，ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度。l血漿中ctDNA

15、的含量與預后密切相關，含量越高，病人的5年生存率越低（P0.001）。lctDNA含量的增高及CTC數目的增加，病人的預后顯著變差，而CA15-3沒有預后判斷功能。l監(jiān)測ctDNA的突變率比監(jiān)測cfDNA濃度，對胃癌動態(tài)發(fā)展的監(jiān)控靈敏度更高。l 利用區(qū)域捕獲測序技術檢測乳腺癌原發(fā)瘤及肝臟轉移瘤的基因突變情況，并監(jiān)控血液中ctDNA在治療過程中的動態(tài)變化。l ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)發(fā)展中具有更高的靈敏度和特異性；l ctDNA能比蛋白類標志物CA15.3更早的預測腫瘤動態(tài)發(fā)展情況。l相對于傳統(tǒng)的影像學及蛋白類血清標志物，通過評估ctDNA的突變頻率能更早、更準確的預測結腸癌患者腫瘤經治療后的

16、動態(tài)發(fā)展情況。ctDNA的分析指標4cfDNA含量含量1235ctDNA突變頻率突變頻率微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性完整性ctDNA甲基化頻率甲基化頻率l利用亞硫酸氫鹽平行測序檢測不同腫瘤患者（肝癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌等）血漿DNA甲基化發(fā)生情況及血漿DNA拷貝數異常情況，用于腫瘤的診斷及腫瘤負荷的監(jiān)測；l血漿中甲基化癌癥診斷靈敏度為74% ，特異性為94%，具有較好的癌癥診斷應用價值。PercentageofbinsshowinghypomethylationinHCCpatientsandchronichepatitisBvirus(HBV)carrierswithcirrh

17、osisl血漿DNA的甲基化程度在肝癌患者顯著上升，可用于肝癌的診斷；靈敏度為81%，特異性為94%；l血漿DNA拷貝數異常用于肝癌診斷，靈敏度為81%，特異性為88%。Clin Cancer Res July 1, 2004 10; 4420 Journal of Thoracic Oncology: 2011 6 :1632-1638World J Gastroenterol. 2011 Nov 28; 17(44): 49174921.Int. J. Cancer: 131, 11531157 (2012)ONCOLOGY REPORTS 32: 505-512, 2014ctDNA的分析指標4cfDNA含量含量1235ctDNA突變頻率突變頻率微衛(wèi)星雜合性微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性完整性ctDNA甲基化頻率甲基化頻率l血漿中短鏈DNA分子發(fā)生雜合性喪失的頻率顯著高于長鏈DNA分子。l血漿中短鏈DNA的 cyclin D2