基因工程1.2基因工程的操作程序

1、基因組文庫基因組文庫部分基因文庫如：部分基因文庫如： 將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中將含有某種生物不同基因的許多片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。文庫。 受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫。種生物的基因組文庫。 受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫，如物的部分基因文庫，如cDNA文庫。文庫?；蛭膸斓臉?gòu)建

2、模式圖基因文庫的構(gòu)建模式圖通過對通過對受體菌受體菌的培養(yǎng)而的培養(yǎng)而儲存基因儲存基因DUCK179制作提取某生物提取某生物全部全部DNA用適當(dāng)用適當(dāng)限制酶切割限制酶切割許許 多多DNA片段片段與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群該生物基該生物基因組文庫因組文庫（每個受體菌含有一段不同的（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）片段）mRNA反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈雜交雙鏈核酸酶核酸酶H單鏈單鏈DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA與載體連接與載體連接導(dǎo)入受體菌群導(dǎo)入受體菌群該生物該生物cDNA文庫文庫返回根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，如：根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的已知

3、核苷酸序列；基因的功能；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因在染色體上的位置；基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA；基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)；基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)； PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）,它是利用它是利用DNA 雙鏈復(fù)制的原理，雙鏈復(fù)制的原理，將基將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€過程是在體外進(jìn)行，所以數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。擴(kuò)增技術(shù)。已知基因的核苷酸序列、已知基因的核苷酸序列、4種脫氧核

4、苷酸、一對種脫氧核苷酸、一對引物、引物、Taq酶酶 （及緩沖溶液）（及緩沖溶液） 過程過程： 變性變性（90 95）退火：退火：引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合（55 60） DNA聚合酶作用下聚合酶作用下延伸延伸（70 75） 條件條件：DNA模板、引物、熱穩(wěn)定模板、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸、。聚合酶、四種脫氧核苷酸、。方式方式: :多聚多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)高溫變性高溫變性（9095）低溫退火低溫退火（5560）中溫延伸中溫延伸（7075）p 雙鏈雙鏈DNADNA是在高溫條件下解鏈為單鏈?zhǔn)窃诟邷貤l件下解鏈為單鏈DNADNA的，因此整個過程不需要解旋的，因此整個過程不

5、需要解旋酶。酶。多次多次重復(fù)重復(fù)DNA合成儀合成儀推推測測推推測測合合成成（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可遺傳給下一代，使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。同時，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。1. 1. 目的基因目的基因2. 2. 啟動子啟動子 RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的一聚合酶識別和結(jié)合的一段特殊結(jié)構(gòu)的段特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段，位于基因的首片段，位于基因的首端，端，RNARNA聚合酶與之結(jié)合才能驅(qū)動基因聚合酶與之結(jié)合才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA，進(jìn)而獲得需要的蛋白質(zhì)

6、。，進(jìn)而獲得需要的蛋白質(zhì)。3. 3. 終止子終止子 一段特殊結(jié)構(gòu)的一段特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片片段，位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)段，位于基因的尾端，作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。錄在所需要的地方停止。4. 4. 標(biāo)記基因標(biāo)記基因 鑒別受體細(xì)胞中是否鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。的細(xì)胞篩選出來。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法： 用用Ca2+處理細(xì)胞處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 表表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞

7、混合 感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞吸收細(xì)胞吸收DNA分子分子 目的基因是否真正插入受體細(xì)胞的目的基因是否真正插入受體細(xì)胞的DNADNA中，是否中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過檢能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過檢測、鑒定才能得知。測、鑒定才能得知。 常用的檢測手段主要從分子水平和個體水平常用的檢測手段主要從分子水平和個體水平進(jìn)行。進(jìn)行。1. 1. 檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 提取受體生提取受體生物全部物全部DNA適當(dāng)限制適當(dāng)限制酶切割酶切割DNA片段片段用同位素標(biāo)記的用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交目的基因片

8、段雜交顯顯 出出雜交帶雜交帶（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)2. 2. 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA mRNA 提取受體生提取受體生物的物的mRNA用同位素標(biāo)記的用同位素標(biāo)記的目的基因片段雜交目的基因片段雜交顯顯 出出雜交帶雜交帶（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了mRNA） 檢測檢測DNA利用的是利用的是DNA與與DNA雜交，檢測雜交，檢測mRNA利用利用的是的是DNA與與mRNA雜交。雜交。3. 3. 檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 抗原抗原抗體雜交技術(shù)抗體雜交技術(shù)提取受體生提取受體生物的

9、蛋白質(zhì)物的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體雜交與相應(yīng)抗體雜交顯顯 出出雜交帶雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。并得到表達(dá)。，1.放射性同位素或熒光標(biāo)記2、利用雜交原理可以檢測病毒，檢測目的基因是否導(dǎo)入受體DNA中，檢測是否轉(zhuǎn)錄，可以判斷兩種生物是否具有親緣關(guān)系，還可以檢測某些疾病歸納: 基因工程的基本操作程序1.1. 獲取目的基因獲取目的基因u 從基因文庫從基因文庫u 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù)u 人工合成人工合成2.2. 構(gòu)建基因表達(dá)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體u 目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因3.3. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的