基因組學(xué)作業(yè)_第1頁
基因組學(xué)作業(yè)_第2頁
基因組學(xué)作業(yè)_第3頁
基因組學(xué)作業(yè)_第4頁
基因組學(xué)作業(yè)_第5頁
已閱讀5頁,還剩5頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、RNA干擾a-突觸核蛋白基因表達(dá)對甲基苯丙胺中毒大鼠神經(jīng)毒性的影響$ 研究生五班一、立項依據(jù):甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一種新型毒品,屬于苯丙胺類神經(jīng)興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其鹽酸鹽為透明的結(jié)晶體,外觀狀如冰,俗稱“冰毒”。因具有見效快、興奮作用維持時間長、價格低廉、化學(xué)合成技術(shù)簡單、多途徑攝取等特點,METH的濫用及蔓延速度極快,成為當(dāng)今我國危害最為嚴(yán)重和濫用的兩大毒品之一。METH的濫用不僅給個人生理及心理帶來極大痛苦,更給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此,對METH神經(jīng)毒性損傷的機制及其防治手段的研究己成為世界面

2、臨的重大課題和研究熱點。METH為擬交感胺類興奮劑,具有中樞神經(jīng)興奮性、致幻、食欲抑制和擬交感神經(jīng)能效應(yīng)等藥理、毒理學(xué)特性。大量臨床資料表明,METH可引起體內(nèi)重要實質(zhì)器官的損害,包括心、腦、肺、肝、腎等,但更主要的是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。METH濫用能引起明顯的行為和精神改變,導(dǎo)致大腦黑質(zhì)、紋狀體、海馬皮質(zhì)多部位損傷,可致動物大腦多巴胺能及五羥色胺能末梢損傷,包括紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)含量下降,多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)降低,酪氨酸羥化酶(TH)活性減少,5-HT及代謝產(chǎn)物的耗竭,單胺囊泡轉(zhuǎn)運體2 (VMAT-2)及多巴胺攝取位點缺失,導(dǎo)致神經(jīng)元、軸索損傷,神經(jīng)細(xì)胞凋亡。目前,關(guān)于METH的神經(jīng)

3、毒性機制尚未完全明確?,F(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示多種機制和途徑參與了 METH的神經(jīng)毒性。這些機制主要包括:過量多巴胺的氧化作用及氧化應(yīng)激損傷;谷氨酸的興奮性作用所致的Ca2+超載和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞;線粒體損傷和功能障礙;激活多條凋亡相關(guān)通路、誘發(fā)神經(jīng)元凋亡等。其中氧化應(yīng)激是METH所致神經(jīng)毒性損傷的重要作用機制。a-突觸核蛋白由140個氨基酸構(gòu)成的酸性可溶性蛋白,主要分布于神經(jīng)元的核膜及突觸前末梢。a-syn參與正常突觸功能的維持,在調(diào)節(jié)突觸可塑性和遞質(zhì)釋放等方面有重要的作用;可以與許多信號蛋白、骨架蛋白、酶和離子等結(jié)合,有伴侶分子樣活性的作用。a-syn基因敲除小鼠卻未發(fā)現(xiàn)有明顯功能損害和形態(tài)改變,

4、表明其生理功能具有代償機制。a-syn高濃度或過表達(dá)時又對神經(jīng)元有細(xì)胞毒的效應(yīng)。在高濃度時,a-syn形成細(xì)胞毒性更大的P-折疊寡聚物,這預(yù)示著該蛋白質(zhì)的異常聚集和纖維化與帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。METH可導(dǎo)致大腦出現(xiàn)與上述神經(jīng)退行性病變相類似的改變,并且METH使用者患PD的比率明顯升高。最近的研究顯示METH可以導(dǎo)致小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)產(chǎn)生類似Lewys小體的包涵體。在PD等許多神經(jīng)退行性疾病中,多巴胺遞質(zhì)釋放減少、氧化應(yīng)激、Ca2+超載、線粒體功能損傷和細(xì)胞凋亡等幾種損傷機制密切相關(guān)、協(xié)同作用,而a-syn在其中扮演著重要的角色。當(dāng)其濃度升高時既參與了

5、神經(jīng)損傷的啟動,同時也變成損傷過程的效應(yīng)蛋白,促進(jìn)神經(jīng)元變性直至死亡。a-syn的硝基化促進(jìn)了其寡聚體的穩(wěn)定性導(dǎo)致其毒性持續(xù)增強,因此,它有可能是METH神經(jīng)毒性損傷中的靶蛋白。正如前面所述,METH所致神經(jīng)損傷也包含上述幾種損傷機制,而a-syn在皮質(zhì)、海馬和紋狀體表達(dá)升高,這預(yù)示著ct-syn與上述損傷機制之間也存在著必然的聯(lián)系,作為重要的靶蛋白參與了神經(jīng)損傷的過程。本課題組前一階段通過RNAi技術(shù)沉默人多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞中a-syn基因,發(fā)現(xiàn)干擾a-syn表達(dá)可抑制METH引起的細(xì)胞活力下降、TH、DAT、VMAT-2等基因水平下降、多巴胺耗竭和ROS、NOS、NO水平

6、升高,能抵抗METH引起的線粒體ATm下降、MPTP開放、細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流,抑制線粒體的細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿,從而在一定程度上保護線粒體的正常功能、抵抗METH引起的細(xì)胞死亡。但這一結(jié)果尚未在體內(nèi)得到驗證,且a-syn究竟是通過何種路徑參與METH的神經(jīng)毒性損傷、其調(diào)控的靶蛋白究竟有哪些及其可能的機制尚未見報道,也正是本研究的意義所在。參考文獻(xiàn)1郭東文,鄭繼旺.認(rèn)識冰毒遠(yuǎn)離冰毒.中國藥物濫用防治雜志,1998,4:14-172劉志民.“新型毒品”及其危害.藥物不良反應(yīng)雜志,2005,7(4):272-2733蔡志基.全球毒品問題的現(xiàn)狀與動向.中國藥物依賴性雜志,1999,8(1): 74劉志

7、民.苯丙胺類中樞興奮劑濫用防治.中國藥物濫用防治雜志,2002,38:4-145劉鐵橋,郝偉.苯丙胺類興奮劑概介.國外醫(yī)學(xué)精神病分冊,2001,28(30):129-1346寇清,何衛(wèi)平.急性甲基苯丙胺中毒34例臨床分析.中國急救醫(yī)學(xué),2003,23(5):338-339二、研究內(nèi)容:1.建立RNA干擾a-syn大鼠模型成年雄性Wistar大鼠,隨機分成4組,對照組(control, CON);模型組(model, model);陰性病毒組(empty vector);陽性病毒組(RNAi):使用本課題組前期合成并鑒定有效的a-syn-ShRNA重組病毒。利用腦立體定向注射技術(shù)向大鼠紋狀體注射

8、相應(yīng)的物質(zhì),CON組和model組均注射生理鹽水,emptyvector組注射陰性病毒,RNAi組注射a-syn-S_A重組病毒。注射后二周,取各組大鼠紋狀體檢測a-syn的表達(dá),實時熒光定量PCR、Western Blot分別檢測a-syn在基因和蛋白水平的表達(dá)變化。2.研究RNA干擾a-syn對METH毒性損傷的影響利用成功建立的a-syn沉默大鼠模型,給予METH刺激,CON組腹腔注射生理鹽水,model組、empty vector組和RNAi組動物腹腔注射METH,劑量15mg/kg,每天早8:00點、晚6:00點各注射一次,連續(xù)注射4天,共8次。觀察動物的行為變化,體重、進(jìn)食量、飲水

9、量的變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗方法(ELISA)檢測各組大鼠紋狀體多巴胺(DA)和絡(luò)氨酸羥化酶(TH)的含量;TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡;酶化學(xué)方法檢測ROS、NOS、NO的活性變化,分別用ROS熒光檢測試劑盒、NOS活性檢測試劑盒、NOS檢測試劑盒檢測。3.RNA干擾a-syn與METH神經(jīng)毒性相關(guān)差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定每組取6個紋狀體組織,取適量紋狀體組織,加入SDT裂解液,勻漿均勻后超聲裂解;離心取上清,利用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。各取20ug蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色檢測蛋白質(zhì)量。各組取400ug樣品進(jìn)行酶解和肽段定量。分別取約64ug酶解后的肽段,用iTRAQ

10、Reagent-4plex Multiplex Kit進(jìn)行肽段標(biāo)記后,釆用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離,用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行肽段的定性和定量分析。三、研究目標(biāo):建立a-syn沉默大鼠模型,運用行為學(xué)、酶化學(xué)等方法,全面了解a-syn抑制后對METH導(dǎo)致的多巴胺系統(tǒng)和氧化應(yīng)激系統(tǒng)損傷的影響;在此基礎(chǔ)上,利用iTRAQ技術(shù),篩選和鑒定出給予METH剌激及RNA干擾a-syn后,大鼠紋狀體的差異表達(dá)蛋白質(zhì),結(jié)合已知蛋白質(zhì)的功能,探討a-syn在METH神經(jīng)毒性機制中的作用。四、研究方案與技術(shù)路線:我們前期參照SapruMK等的實驗方法,通過RNAi技術(shù),在體外證實ct

11、-syn參與了 METH的神經(jīng)損傷過程。但a-syn究竟是通過何種路徑參與METH的神經(jīng)毒性損傷、其調(diào)控的紀(jì)蛋白究竟有哪些及其可能的機制,這些都是本次研究要尋求的答案。目前,利用RNA干擾技術(shù)定向敲除某個基因成為國內(nèi)外的研究熱點,而且RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成熟穩(wěn)定,敲除效果得到了國內(nèi)外同行的一致認(rèn)可。相對于傳統(tǒng)的基因抑制相比,RNAi技術(shù)具有更強大、更持久地抑制基因表達(dá)的能力,其效能是反義寡核苷酸的10010000倍,并且具有高度的序列特異性,無免疫原性,能克服蛋白抑制劑應(yīng)用中所存在的不足。iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantit

12、ation)技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽,通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團,然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。iTRAQ技術(shù)靈敏度高,樣品需求量少,相對于傳統(tǒng)技術(shù)能夠篩選出更多的差異蛋白。本課題擬采用RNA千擾技術(shù)合成并鑒定有效的a-syn-S_A重組病毒,通過腦立體定向顯微注射重組病毒至大鼠紋狀體,從而獲得a-syn抑制大鼠模型;再給予METH刺激后,觀察大鼠行為學(xué)、多巴胺系統(tǒng)和氧化應(yīng)激系統(tǒng)等的變化,探討變化發(fā)生的可能機制,闡明a-syn在METH神經(jīng)毒性損傷中的關(guān)鍵靶蛋白作用;采用i

13、TRAQ技術(shù)對ct-syn抑制大鼠模型給予METH作用后差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定,篩查和a-syn密切相關(guān)的靶蛋白,以明確這些蛋白和METH神經(jīng)毒性之間的聯(lián)系,為METH神經(jīng)毒性損傷的預(yù)防和治療提供一定的理論基礎(chǔ)和新的研究方向。五、預(yù)期成果:1. 成功建立RNA干擾a-syn大鼠模型,在基因和蛋白水平都證實了a-syn表達(dá)量的下降;2. 篩選和鑒定數(shù)個RNA干擾a-syn與METH神經(jīng)毒性相關(guān)差異蛋白質(zhì);3. 發(fā)表相關(guān)論文2-3篇。六、研究計劃及進(jìn)度:2015.1-2015.5 建立RNA干擾a-syn大鼠模型。2015.6-2016.12 研究RNA干擾a-syn對METH毒性損傷的影響。20

14、16.1-2016.6 RNA干擾a-syn與METH神經(jīng)毒性相關(guān)差異蛋白質(zhì)的篩選和鑒定。七、實驗條件與基礎(chǔ):1、工作基礎(chǔ):申請人從事腫瘤發(fā)生的分子機制,神經(jīng)疾病的免疫及基因治療研究多年,發(fā)表研究論文19篇,其中6篇被SCI收錄,影響因子多達(dá)40。在美國華盛頓大學(xué)神經(jīng)腫瘤及分子遺傳研究室從事神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的分子機制的研究工作近4年,主要從事腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制,利用基因芯片尋找與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的遺傳改變,并利用已知的腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遺傳改變,如Ras激活突變, NF1基因缺失,cdk4過表達(dá),P53及Rb缺失,并在動物模型上進(jìn)一步驗證上述遺傳改變與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)

15、系。首次利用GFAP啟動子成功地建立了腦膠質(zhì)細(xì)胞特異性CDK4基因過表達(dá)的動物模型,并揭示了CDK4過表達(dá)與P53基因缺失對腦膠質(zhì)細(xì)胞增殖的協(xié)同作用。該文發(fā)表于Oncogene 2002, 21:1325-1334(影響因子 6.0)。該CDK4轉(zhuǎn)基因鼠系正在申請美國專利。同時,探索研究新基因如T-cadherin和GAP43基因?qū)δX膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的關(guān)系,首次發(fā)現(xiàn)T-cadherin和GAP43是兩個重要的參與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長調(diào)控的基因,并揭示其調(diào)節(jié)機制。論文分別發(fā)表于 Molecular and Cellular Biology 2003, 23:566-578(影響因

16、子 8.8)和Cancer Research 2003, 63:2933-2939(影響因子 8.3)。參加在美國和印度召開的國際會議3次,在研究基因功能與腫瘤惡性生物學(xué)特征的關(guān)系、腫瘤發(fā)生的分子機制及治療研究領(lǐng)域積累了豐富的經(jīng)驗。在對T-cadherin基因的研究中,首次證明了細(xì)胞粘附分子T-cadherin是抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤生長及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征的重要腫瘤抑制基因,并揭示其分子機制是T-cadherin分子通過誘導(dǎo)P21 CIP1/WAF1表達(dá)致使腫瘤細(xì)胞于細(xì)胞周期G2期阻滯。該文發(fā)表于Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578。這一研究發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究T-cadherin分子在肝癌中的作用、功能及臨床意義奠定了堅實的基礎(chǔ)。2、工作條件我院普通外科是國家重點學(xué)科,長期以來又以神經(jīng)科為重點,已培養(yǎng)出碩士、博士研究生60余名。神經(jīng)疾病發(fā)病的分子機制及綜合治療一直是我科的重點研究項目,已發(fā)表研究論文三百余篇。近年來基本外科實驗室已投資近200萬元增購儀器設(shè)備,配備充足的研究人員, 已具備從事相關(guān)分子生物學(xué)研究、細(xì)胞學(xué)研究及動物試

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論