碩士畢業(yè)答辯-謝云飛

1、稀土元素共摻羥基磷灰石納米稀土元素共摻羥基磷灰石納米粒子制備及生物成像應(yīng)用粒子制備及生物成像應(yīng)用答辯人：謝云飛導(dǎo) 師：韓穎超 副研究員專 業(yè)：材料科學(xué)與工程碩士學(xué)位論文答辯2016月5月25日1 稀土共摻HAP的共沉淀法制備及性能研究2 HAP:Eu/Gd的生物相容性及熒光成像4研究背景及意義3 1HAP:Eu/Gd的溶膠凝膠法制備及性能研究3 3目目 錄錄結(jié)論及展望3 52有機(jī)染料金屬納米簇?zé)晒饬孔狱c(diǎn)優(yōu)點(diǎn)種類多、強(qiáng)度高、吸收截面高等；光穩(wěn)定性好、強(qiáng)度高、尺寸小等；光穩(wěn)定性好、寬的吸收譜帶等；缺點(diǎn) 水溶性差、光穩(wěn)定性差、光 閃爍等； 制備復(fù)雜、與生物作用機(jī)理 不明確等; 重金屬毒性等；常見的熒

2、光探針材料常見的熒光探針材料稀土摻雜納米材料1. 研究的背景及意義研究的背景及意義 具有熒光/磁/放射性等功能的納米材料可實(shí)現(xiàn)腫瘤的標(biāo)記和早期診斷?；跓晒饧{米顯影劑的熒光成像技術(shù)應(yīng)用簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)腫瘤的定位，提高手術(shù)清除率。優(yōu)異的光/磁特性；低的生物毒性；31. 研究的背景及意義研究的背景及意義 稀土單摻HAP 納米粒子稀土離子共摻雜途徑稀土離子共摻雜途徑 顆粒尺寸顆粒尺寸? 分散性分散性? 生物生物毒性毒性? 濃度濃度猝滅猝滅?高溫煅燒 提高稀土含量納米納米羥基磷灰石羥基磷灰石生物相容性生物相容性生物活性生物活性 骨修復(fù)骨修復(fù) 載藥載藥 生物涂層生物涂層牙科牙科生物可降解性生物可降解性細(xì)胞

3、標(biāo)記細(xì)胞標(biāo)記(HAP)42. 稀土共摻稀土共摻HAP的共沉淀法制備及性能研究的共沉淀法制備及性能研究制備過(guò)程：Ca2+,REs3+攪拌反應(yīng)沉淀產(chǎn)物粉末PO43-離心洗滌冷凍干燥HAP:REs懸浮液肝素 鈉超聲分散l 控制控制(REs3+Ca2+)/P=1.67l 控制控制Eu摻量摻量2%，改變共，改變共摻元素及共摻比例摻元素及共摻比例l 表征手段表征手段: XRD, FT-IR，TEM, XPS和熒光光譜等。和熒光光譜等。5組合最大增強(qiáng)率最佳共摻比例Eu/Tm約50%2:0.2Eu/Gd約150%2:1.5Eu/Tb約120%2:1.2激發(fā)波長(zhǎng)：394 nmn 稀土元素組合及比例的篩選稀土元素

4、組合及比例的篩選l Eu/Gd組合具有最佳熒光增強(qiáng)效果熒光發(fā)射光譜6相組成及結(jié)構(gòu)相組成及結(jié)構(gòu)共摻比例REu:Gdd(002)(nm)d(310)(nm)d(210)(nm)XC (%)2:035.615.119.450.112:0.533.713.422.149.062:140.414.622.646.172:1.532.812.42043.292:234.510.625.940.52Observed vibrational frequencies (cm1)Assignments472 ，564，602 ，962，1034, 1107 cm1PO43631，3569 cm1libration

5、al mode, OH1636 cm12 bending mode, H2O 3430 cm1stretching mode, H2O876 cm1HPO42-1424 cm12 bending mode, CO32-n HAP:Eu/Gd納米粒子的性能表征納米粒子的性能表征l Eu/Gd的共摻入未改變晶相組成l 共摻比例增加，結(jié)晶度下降l 出現(xiàn)少量缺鈣型HAP7形貌、粒徑及分散性形貌、粒徑及分散性l 板片狀l 厚度方向：11.02.1 nml 平面方向：83.827.3 nml 分散性較好，平均粒徑約140 nm80，沉淀法合成的HAP:Eu/Gd(2:1.5)樣品8 元素含量及價(jià)態(tài)分析元素

6、含量及價(jià)態(tài)分析l ICP：鈣磷摩爾比偏低l XPS：Eu、Gd共摻入HAP，且未出現(xiàn)+2價(jià)Eu離子Molar Ratio Calculated valueObserved valueEu/Gd1.3331.361Ca/P1.6081.264(Eu+Gd+Ca)/P1.671.297元素元素與與Eu單摻單摻HAP相比相比結(jié)合能偏移量結(jié)合能偏移量Ca 2p+0.15eVP 2p +1.08eVO 1s+0.37eVEu 3d-2.6eVl Gd的共摻 Eu所處晶體場(chǎng)環(huán)境改變 Eu的發(fā)光性能改變9l 主發(fā)射峰：617nm；兩種激發(fā)波長(zhǎng)下均觀察到熒光增強(qiáng)效果；l 394nm激發(fā)時(shí)，熒光強(qiáng)度更高。ex=

7、273 nmex=394 nmn HAP:Eu/Gd的熒光性能的熒光性能8080下合成：下合成：Ca(I)10n煅燒對(duì)煅燒對(duì)HAP:Eu/Gd的性能影響的性能影響l 結(jié)晶度提高，但未出現(xiàn)分解l 形貌不變，仍為板片狀l 尺寸增加，出現(xiàn)團(tuán)聚l 分散性變差，平均粒徑：250 nm11600oC煅燒后煅燒后HAP:Eu/Gd的熒光性能的熒光性能Ca(II)結(jié)晶度熒光強(qiáng)度特征峰：394nmCTB:200-300 nm未煅燒樣品中，沒觀察到CTB 峰形、位置不變576 nm峰出現(xiàn)最佳Eu/Gd=2:0.5相比273nm，394 nm激發(fā)，熒光強(qiáng)度更高122:0.52:1.5l熒光強(qiáng)度相對(duì)比值熒光強(qiáng)度相對(duì)比

8、值: (REu/Gd=2:J,J=0.5,1,1.5,2)/REu/Gd=2:0l隨著隨著 REu/Gd 比例增加，非線性增加比例增加，非線性增加l最佳共摻比最佳共摻比: 2:1.5 (80）2:0.5（600）l過(guò)多的過(guò)多的Gd含量含量 熒光猝滅熒光猝滅熒光強(qiáng)度相對(duì)比例熒光強(qiáng)度相對(duì)比例ex=394 nm13HAP:Eu/Gd (600) 的激發(fā)光譜的激發(fā)光譜Eu3+和和Gd3+的能級(jí)圖的能級(jí)圖l能量傳遞：6PJ (Gd3+) CTB 6PJ (Gd3+) 5HJ(Eu3+) 起主要作用 n Eu/Gd共摻的熒光增強(qiáng)機(jī)理共摻的熒光增強(qiáng)機(jī)理激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)Ex=273 nm時(shí)：時(shí)：CTB14激發(fā)

9、波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)Ex=394 nm時(shí)：時(shí)：能量傳遞過(guò)程示意圖l Eu/Gd間的合作上轉(zhuǎn)換過(guò)程(CU)和連續(xù)能量轉(zhuǎn)移過(guò)程（SET)的共同作用。l CU（合作上轉(zhuǎn)換）過(guò)程：394 nm激發(fā)下，Eu3+(5L6)傳遞能量給附近的Gd3+，Gd3+被激發(fā)至6GJ，Eu3+回到基態(tài)。l SET(連續(xù)能量轉(zhuǎn)移）過(guò)程： Gd3+(6GJ)傳遞能量給Eu3+， Eu3+被激發(fā)至更高能級(jí)并逐級(jí)躍遷至5HJ， 5D0， 7FJ能級(jí)，并放出光子。l 整個(gè)過(guò)程中，能量損失減少，熒光效率提高153. HAP:Eu/Gd的溶膠凝膠法制備的溶膠凝膠法制備n TG-DSC曲線曲線l 放熱峰：381.4oC有機(jī)物大量分解；l 50

10、0700晶化過(guò)程。前驅(qū)體的TG-DSC曲線16n 相組成和結(jié)構(gòu)相組成和結(jié)構(gòu)煅燒溫度的影響煅燒溫度的影響l 溫度升高，物相逐漸變?yōu)閱我晃锵嘟M成l 明顯的B型碳酸根取代HAPl 合適的溫度為600以上17PAA濃度的影響濃度的影響l 0.20.6mg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)產(chǎn)物影響不大l 同時(shí)發(fā)生A、B型碳酸根取代HAPA/B Type18煅燒時(shí)間的影響煅燒時(shí)間的影響l 保溫時(shí)間1h，有機(jī)物分解不完全，結(jié)晶度低，產(chǎn)物為 多物相組成；3h后，為單一HAP物相組成，部分CHAP。19n 熒光性能分析熒光性能分析不同煅燒溫度不同PAA含量不同煅燒時(shí)間激發(fā)波長(zhǎng)：350 nm394 nml 350 nm激發(fā)時(shí)：

11、 熒光強(qiáng)度更高， 主發(fā)射峰：575 nm；l 稀土離子主要位于Ca(II)位置。20n 形貌、粒徑及元素含量形貌、粒徑及元素含量4503h6003h7503hSEM TEMl 橢球形顆粒，直徑3050 nml 短棒狀和橢球形顆粒，長(zhǎng)50120 nml 短棒狀顆粒聚集成寬1m，長(zhǎng)約25m的大片狀顆粒21Camg/LPmg/LEu mg/LGd mg/LCa/P mol%Eu/Gd mol%(Ca+Eu+Gd)/P mol%實(shí)測(cè)值61.29729.5420.03190.02441.6081.3071.61理論值-1.6081.3331.674503h6003h7503hICP測(cè)試l 平均粒徑在40

12、0500 nml 有一定程度的硬團(tuán)聚l 元素摩爾比接近于理論值22n 與沉淀制備法的比較與沉淀制備法的比較兩種制備方法在 600煅燒后的產(chǎn)物熒光強(qiáng)度比較l主發(fā)射峰溶膠凝膠法：575 nm，黃色黃色熒光為主；沉淀法為616 nm。l熒光強(qiáng)度兩種方法產(chǎn)物主發(fā)射峰熒光強(qiáng)度相差不大。l溶膠凝膠法更易于稀土離子向晶格內(nèi)部的擴(kuò)散，位于反演對(duì)稱中心的Ca(II)位置位置。l粒徑及分散性：沉淀法分散性較好好，平均粒徑較小??；而溶膠凝膠法出現(xiàn)硬團(tuán)聚。l元素摩爾比：溶膠凝膠法更易控更易控制制產(chǎn)物元素成分。234. HAP:Eu/Gd的生物相容性及熒光成像應(yīng)用的生物相容性及熒光成像應(yīng)用n 生物安全性評(píng)價(jià)生物安全性評(píng)

13、價(jià)不同濃度HAP:Eu/Gd的細(xì)胞毒性不同濃度HAP:Eu/Gd的溶血率值l 溶血率值遠(yuǎn)小于5%，未造成紅細(xì)胞溶血l 1d，3d內(nèi)未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性24l 隨著與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間增加，培養(yǎng)孔內(nèi)Eu、Gd總含量增加；l Eu/Gd摩爾比與理論值接近；l 共培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的含量達(dá)到最大值。n 細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取25l 納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞，存在于空泡中，圍繞在核周；l EDS結(jié)果中出現(xiàn)Ca、P、Eu和Gd，表明顆粒物為HAP:Eu/Gd。26l 共培養(yǎng)4h和24h后，即可在HepG2 細(xì)胞中發(fā)射出明顯紅色熒光 (405 nm激光器)n 細(xì)胞成像細(xì)胞成像27n

14、 體外生物降解評(píng)價(jià)體外生物降解評(píng)價(jià)CPBS 溶液的 pH 值隨時(shí)間變化曲線細(xì)胞外的 Eu3+累積降解率l 稀土摻雜增加了HAP在CPBS酸性介質(zhì)中的溶解度；l 72h后，HAP:Eu/Gd 在細(xì)胞內(nèi)的降解率達(dá)到近65%28l 血液中的濃度為：血液中的濃度為：17.580.88g/mol （0.58mol/mL)l 材料主要集中在肝部；材料主要集中在肝部；n 體內(nèi)熒光成像及組織分布體內(nèi)熒光成像及組織分布空白腹腔注射后約10分鐘尾靜脈注射后約5分鐘尾靜脈注射后約1.5小時(shí)尾靜脈注射后約3小時(shí)295. 結(jié)論與展望結(jié)論與展望結(jié)論1.基于稀土元素間的能量傳遞機(jī)制，實(shí)現(xiàn)了稀土共摻 HAP 納米粒子的熒光增

15、強(qiáng)。 3.沉淀法合成的稀土共摻 HAP 納米粒子具有良好生物相容 性和細(xì)胞內(nèi)的可降解性，可以用于體內(nèi)外的熒光成像。展望1. 對(duì)顆粒表面進(jìn)行改性以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和 靶向成像。2. 探索其他熒光增強(qiáng)途徑，以便保證高熒光強(qiáng)度同時(shí)降低 稀土用量以避免長(zhǎng)期生物毒性 。2. PAA溶膠凝膠法可獲得主晶相為HAP的Eu/Gd共摻納米粒子，產(chǎn)物成分可控，發(fā)射出黃色熒光。30所承擔(dān)的項(xiàng)目：所承擔(dān)的項(xiàng)目：l 2015年 武漢理工大學(xué)研究生自主創(chuàng)新研究基金（自由探索項(xiàng)目），名稱：稀土共摻雜羥基磷灰石納米粒子制備及熒光增強(qiáng)效應(yīng)研究. （結(jié)題驗(yàn)收被評(píng)為：優(yōu)秀）已發(fā)表論文：已發(fā)表論文：l Xie Y F, He

16、 W M, Li F, Perera T S H, Gan L, Han Y C *, Wang X Y, Li S P and Dai H L *. Luminescence Enhanced Eu3+/Gd3+ Co-Doped Hydroxyapatite Nanocrystals as Imaging Agents In Vitro and In VivoJ. ACS Applied Materials & Interfaces, 2016, 8(16):10212-10219. l Xie Y F, Perera T S H, Li F, Han Y C* and Yin M

17、 Z *. Quantitative Detection Method of Hydroxyapatite Nanoparticles Based on Eu3+ Fluorescent Labeling In Vitro and In VivoJ. ACS Applied Materials & Interfaces, 2015, 7(43): 23819-23823.（共同一作）l Lu X F, Xie Y F, Han Y C *, et al. Ultrasound-Induced Albumin Gelation Method for the Preparation of Nanostructured HydroxyapatiteJ. Materials Letters, 2015, 161: 128-131.(共同一作)發(fā)明專利申請(qǐng)：發(fā)明專利申請(qǐng)：l 韓穎超，謝云飛，李芳，王欣宇，戴紅蓮，李世普. 稀土摻雜磷酸鈣熒光納米粒子及其制備方法和應(yīng)用. 申請(qǐng)?zhí)枺篊N201510388604.2，公開號(hào)：CN105018086A. 參加學(xué)術(shù)會(huì)議：參加學(xué)術(shù)會(huì)議：l Xie Y F, Li F,