莊濤畢業(yè)論文

1、揚(yáng)州大學(xué)本科生畢業(yè)論文揚(yáng) 州 大 學(xué)本 科 生 畢 業(yè) 論 文畢 業(yè) 論 文 題 目：兔肺血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的分離提取 姓 名： 莊 濤 所 在 學(xué) 院： 食品科學(xué)與工程學(xué)院 專 業(yè) 及 班 級(jí)： 食品質(zhì)量與安全0902班 指 導(dǎo) 教 師： 徐 鑫 副教授 26兔肺血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的分離提取姓名：莊 濤 班級(jí)：食安0902 指導(dǎo)教師：徐 鑫 副教授摘要：ACE常用于降壓藥物或高血壓研究，但購(gòu)買商品酶成本高，本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨分級(jí)沉淀方法分離提取ACE。取新鮮兔肺勻漿離心后，經(jīng)35%55%飽和度的硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、冷凍干燥后得到自制酶。聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示一條帶，相對(duì)分子質(zhì)量為165kD。通過(guò)

2、液相色譜法實(shí)驗(yàn)表明，自制ACE酶存在較強(qiáng)活性，自制的小黃魚ACE抑制肽對(duì)分離得到的兔肺ACE與商品ACE酶的抑制效果相差不大，且活性較為穩(wěn)定，因此，自制的ACE酶可以直接用于實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。關(guān)鍵詞:兔肺 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 分離純化 活性檢測(cè)Student: ZhuangTao Class: Food Quality and Safety 0902 Teacher: XU Xin Abstract: ACE is commonly used in the research of antihypertensive medications or high blood pressure. But i

3、t is expensive to buy commodity enzyme. The experiment adopted ammonium sulfate fractionation in the separation of ACE. 170g fresh rabbit lung was homogenated and centrifugated with 35%-55% saturation ammonium sulfate fractionation, dialyzed and freeze-dried. It would obtain 1.0548g homemade enzyme.

4、 Final enzyme preparation on analytical polyacrylamide gel electrophoresis showed one major protein band. The molecular weight estimated to be approximately 165000 dalton by sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis. HPLC experiment showed that the homemade enzyme had activity

5、and there was hardly different on the inhibitory effect by little yellow croaker ACE inhibitory peptide between homemade enzyme and commodity enzyme. And the activity was relatively stable. Consequently, the homemade enzyme could be directly used in laboratory experiments.Keywords: rabbit lung; angi

6、otensin-converting enzyme; separation and purification; activity detection目錄1 前 言41.1 高血壓及ACE41.2 ACE調(diào)節(jié)血壓的作用機(jī)理61.3 ACE的來(lái)源及其選擇71.4 ACE的分離純化方法71.5 本研究的目的及內(nèi)容82 材料與設(shè)備92.1 主要試劑和材料92.2 主要儀器設(shè)備103 實(shí)驗(yàn)方法與步驟113.1 小黃魚ACE抑制肽的制備113.1.1 制備小黃魚ACE抑制粗肽113.1.2 蛋白測(cè)定123.2 ACE粗提液的制備123.3 硫酸銨分級(jí)沉淀133.3.1 硫酸銨的第一次分級(jí)沉淀133.3.2

7、 硫酸銨的第二次分級(jí)沉淀133.4 透析133.5 冷凍干燥133.6 樣品蛋白含量的測(cè)定133.7 SDS-PAGE檢測(cè)ACE粗酶蛋白分布情況134 結(jié)果與討論144.1 蛋白含量的測(cè)定結(jié)果144.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作144.1.2 小黃魚樣品中的蛋白含量的測(cè)定154.1.3 兔肺樣品中的蛋白含量的測(cè)定164.2 ACE分子量的測(cè)定164.2 粗酶濃度的優(yōu)化174.3 ACE抑制活性的測(cè)定175 結(jié)論21參考文獻(xiàn)21致謝26 1 前 言1.1 高血壓及ACE高血壓作為一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，它不僅患病率高，而且常引起嚴(yán)重的心、腦、腎等其他疾病1。隨著人們的健康意識(shí)的不斷增強(qiáng)，研究生產(chǎn)高效安全的降

8、壓藥物已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者積極探索的一項(xiàng)重要課題。人體內(nèi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）活性過(guò)高是引起高血壓的關(guān)鍵因素。ACE抑制肽能競(jìng)爭(zhēng)性地與ACE活性中心結(jié)合，從而抑制ACE的活性，起到降血壓的作用。食物源ACE抑制肽因其安全性高，副作用小，易吸收，成為活性肽研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，這些ACE抑制肽在開(kāi)發(fā)具有降血壓的功能食品中具有廣闊的應(yīng)用前景2。而要想研發(fā)出藥效較好的ACE抑制肽藥物，那么研發(fā)過(guò)程中少不了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的參與，因此ACE的應(yīng)用前景也非常明朗。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-Converting Enzyme，ACE，EC ）,系統(tǒng)命名為肽酰二肽水解酶3，是

9、一種哺乳動(dòng)物組織中普遍存在的含鋅離子的膜結(jié)合外肽酶（羧基端二肽）。它是內(nèi)皮細(xì)胞漿膜的一個(gè)組分，由單一肽鏈組成，含有維持其活性所必需的Zn2+和Cl-4。1954年，Leonard T.Skggs5-6博士從馬血漿中首次發(fā)現(xiàn)ACE，并發(fā)現(xiàn)此酶能催化血管緊張素水解去掉羧基端二肽（His-Leu）生成具有血管收縮作用的血管緊張素。ACE可分為體細(xì)胞ACE（sACE）和睪丸ACE（tACE），sACE根據(jù)存在狀態(tài)又可分為組織ACE和血漿ACE。sACE廣泛分布于肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上，參與體內(nèi)的血壓調(diào)節(jié)、電解質(zhì)及體液平衡7-9。如圖1，血漿ACE來(lái)源于組織ACE，其含量取決于組織ACE被ACE分泌酶斷裂的速

10、率與可溶性ACE的分解速率之間的穩(wěn)態(tài)水平10，人體血漿ACE含量比較低，僅0.4g/mL11。sACE含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（C端和N端）12，其氨基酸序列相似度近60%，而發(fā)揮催化作用的那部分序列相似度達(dá)89%，但是他們?cè)诘孜锾禺愋?，抑制劑和氯離子影響作用上存在明顯差別13-14。 它在血管緊張素(1-7)15的產(chǎn)生和緩激肽的降解中起關(guān)鍵作用,而后兩種多肽在血管張力的調(diào)節(jié)和血管平滑肌細(xì)胞的增生中起作用。圖1.血漿ACE調(diào)節(jié)的原理Fig. 1 The principle of blood plasma ACE adjustment ACE是一種單鏈多肽酸性糖蛋白16, 它的分子量為110-170kD,

11、活性中心含有鋅離子, 屬肽酰二肽水解酶,主要分布在肺、腎近曲小管、小腸絨毛和毛細(xì)血管上皮細(xì)胞17。ACE在血管內(nèi)皮細(xì)胞及不同種類的上皮細(xì)胞均有分布，用放射自顯影和免疫組化方法標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)體內(nèi)含ACE最高的組織為腦脈絡(luò)叢以及黑質(zhì)紋狀體通路和基底節(jié)區(qū)18。血液中也有循環(huán)形式的ACE，它可催化血管緊張素水解為血管緊張素(1-7)及二肽（組氨酸、亮氨酸），血管緊張素(1-7)有強(qiáng)烈縮血管的作用并能使緩激肽失活，緩激肽對(duì)血管具有和血管緊張素相反的生理學(xué)作用，它們共同調(diào)節(jié)血管張力及血管平滑肌增殖，因而對(duì)心血管系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及對(duì)維持血壓、水和電解質(zhì)平衡起重要作用。若這個(gè)對(duì)立系統(tǒng)的平衡遭到破壞，就會(huì)導(dǎo)致心腦血

12、管發(fā)生病變19。1.2 ACE調(diào)節(jié)血壓的作用機(jī)理 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）及激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑之一。 腎素-血管緊張素系統(tǒng)20(renin-angiotensin system,RAS)：腎小球旁細(xì)胞分泌腎素，腎素是一種蛋白分解酶，它可將血管緊張素原水解釋放出血管緊張素（Ang I），再經(jīng)肺循環(huán)中轉(zhuǎn)化酶的作用，水解生成血管緊張素（Ang II）21。血管緊張素作用于中樞，增加交感神經(jīng)沖動(dòng)發(fā)放或直接收縮血管。也刺激腎上腺分泌醛固酮，引起水鈉殘留。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞外液及血管阻力，血管緊張素及醛固酮是決定血壓的重要因素。腎缺血

13、是腎小球旁細(xì)胞血流灌注壓低，腎素分泌增多，使血壓升高22，所以抑制ACE的活性對(duì)于降血壓具有著積極的影響。 激肽釋放-酶激肽系統(tǒng)(Kallikrein-Kinin System,KKS)主要包含激肽釋放酶，激肽原和激肽三個(gè)組分，參與多種病理生理過(guò)程23。激肽釋放酶水解高分子量激肽原，得到具有血管舒張作用的緩激肽，而ACE水解緩激肽，使其失活，血壓上升。ACE抑制劑通過(guò)抑制ACE的活性，可以起到降血壓的作用。 其作用機(jī)制如圖1所示24： 圖2血管緊張素酶(ACE)調(diào)節(jié)血壓作用機(jī)制Fig. 2 The mechanism of angiotensin-converting enzyme (ACE)

14、 in the adjust of blood pressure 1.3 ACE的來(lái)源及其選擇 ACE在組織及血漿中廣泛存在, 肺毛細(xì)血管細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞含量豐富, 其中肺的含量和活性最高25。由于兔肺ACE的各方面特性與人的ACE最為接近，故本實(shí)驗(yàn)將從兔肺中提取ACE，用于功能性因子降血壓肽的分析檢測(cè)26-28。1.4 ACE的分離純化方法 現(xiàn)今，提取純化ACE的工藝方法主要有硫酸銨分級(jí)鹽析法、DEAE - Sepharose FF新型離子交換樹(shù)脂法29 以及親和層析法30。硫酸銨分級(jí)鹽析法相比于DEAE - Sepharose FF新型離子交換樹(shù)脂法省去了DEAE-陰離子交換色譜、CM-

15、羥甲基纖維素陽(yáng)離子交換色譜和過(guò)羥基磷灰石柱等分離純化步驟；相比于親和層析法省去了親和凝膠的制備；同時(shí)儀器設(shè)備也為實(shí)驗(yàn)室的條件所允許，因此本文嘗試用劉淑集、王茵等31的硫酸銨分級(jí)鹽析法分離和提取ACE，并測(cè)定其蛋白含量和活性。對(duì)于ACE的活力檢測(cè)，采用液相色譜的測(cè)定方法。蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定32。 硫酸銨分級(jí)沉淀方法的原理：硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利

16、用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來(lái)表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。 測(cè)量蛋白濃度我們選擇考馬斯藍(lán)亮藍(lán)方法而不是凱氏定氮法是因?yàn)榍罢哂糜谖⒘康鞍椎臏y(cè)定，凱氏定氮相對(duì)來(lái)說(shuō)需要的蛋白量比較多。原理：考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)樣品吸光值即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求的

17、樣品中的蛋白含量。如今，檢測(cè)方法主要有體內(nèi)和體外檢測(cè)兩種。體外ACE抑制活性的檢測(cè)主要是測(cè)定有/無(wú)抑制劑存在條件下ACE催化相應(yīng)底物，得到產(chǎn)物的量。一般使用IC50值表示ACE抑制劑的抑制活性，抑制物IC50值越小，其活性越高33。大多數(shù)采用的是Cushman34的分光光度法35-37以及HPLC法38-40，常用底物為HHL和FAPGG。經(jīng)典的Cushman法用ACE水解底物HHL，生成產(chǎn)物HA用溶劑乙酸乙酯提取，蒸干溶劑，再溶解，然后在228nm下測(cè)定吸光度。其中，底物及殘留的提取溶劑會(huì)使分析結(jié)果偏高。Wu等人41用Cushman法制得HA提取物，然后用液相法分析，結(jié)果顯示乙酸乙酯提取物中

18、仍含有相當(dāng)一部分沒(méi)有反應(yīng)的底物HHL，且其吸收值占總提取物吸收值的12%。HPLC法可以將底物和產(chǎn)物分離開(kāi)，精確度高，不需預(yù)處理，操作簡(jiǎn)便，分析時(shí)間大大縮短。此外，還有用o-aminobenzoylglycyl-p-nitrophenylalanyl- proline為底物進(jìn)行熒光法測(cè)定42；Guan-Hong Li43提出一種直接分光光度法，原理為：ACE催化HHL產(chǎn)生的HA在喹啉存在條件下與苯磺酰氯（BSC）會(huì)產(chǎn)生特異性比色反應(yīng)，用此法測(cè)得卡托普利的IC50值為0.019M，而用HPLC法38測(cè)得卡托普利的IC50值為0.0015 g/mL(即0.0069M)，差異較大。近些年還出現(xiàn)了HP

19、LC與生化檢測(cè)方法及MS分析結(jié)合的方法44，可以用以檢測(cè)復(fù)雜的食物樣品，這種方法中，分離鑒定和活性測(cè)定能一步完成。但是設(shè)備投資大，不便普及使用。本實(shí)驗(yàn)ACE的活性采用液相色譜方法進(jìn)行檢測(cè)，三肽HHL在ACE的催化下快速地分解產(chǎn)生馬尿酸(Hippuric Acid)和二肽(His-Leu)。通常通過(guò)測(cè)定馬尿酸的生成量來(lái)評(píng)價(jià)ACE的酶活力。由林琳、周存山等人45的報(bào)導(dǎo)知：ACE的最適pH為7.5，對(duì)于三肽底物如Phe-His-Leu的最適溫度為37，最適pH為8.3，所以在測(cè)酶活的時(shí)候，將條件控制在水浴溫度為37，pH控制在8.3。酶活力單位定義為：1個(gè)酶活力單位(U)是指在37的條件下, 催化形

20、成1mol馬尿酸所需的酶量；比活力定義：每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力(U/mg)。1.5 本研究的目的及內(nèi)容本文以兔肺ACE的活性和標(biāo)準(zhǔn)ACE活性的比較為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而給兔肺ACE以定性的評(píng)價(jià)。鑒于分離純化的樣品ACE是用于研究ACE抑制肽，所以最終得到的樣品中ACE的純度要足夠純，否則對(duì)研究造成一定的影響，以致于研發(fā)出的ACE抑制藥物的藥效不能達(dá)到預(yù)期效果。 研究?jī)?nèi)容主要有：（1）以小黃魚魚肉為原料酶解法制取ACE抑制肽；（2）兔肺血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的提取分離純化；（3）用高效液相色譜檢測(cè)樣品中ACE活性。 2 材料與設(shè)備2.1 主要試劑和材料馬尿酸（HA）Sigma公司產(chǎn)品，美國(guó)馬尿酰組氨

21、酰亮氨酸(HHL)Sigma公司產(chǎn)品，美國(guó)鹽酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司甲醛國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司新鮮兔肺揚(yáng)大獸醫(yī)學(xué)院硼酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司氯化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司硫酸銨國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司氯化鋇國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司甲醇（色譜純）J&K SCIENTIFIC LTD.次高分子量(43-200kD)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)上海生物化學(xué)研究所聚丙烯酰胺道氏化學(xué)公司，美國(guó)甲叉丙烯酰胺道氏化學(xué)公司，美國(guó)TEMEDSigma公司產(chǎn)品，美國(guó)過(guò)硫酸銨(AP)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司2.2 主要儀器設(shè)備高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司高速組織搗碎機(jī)上海人和

22、科學(xué)儀器有限公司UV-2100型分光光度計(jì)尤尼科（上海）儀器有限公司數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱HH-60國(guó)華儀器有限公司微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司移液槍10-1000LDargon公司超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司反相高效液相色譜儀日本島津公司Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳槽Bio-Rad Laboratoies托盤天平上海醫(yī)用激光儀器廠分析天平賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司FlveEosy pH計(jì)METTLER TOLEDO公司冷凍干燥機(jī)，Alphal-2 LD Plus德國(guó)Christ公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司3 實(shí)驗(yàn)方法與步驟3

23、.1 小黃魚ACE抑制肽的制備3.1.1 制備小黃魚ACE抑制粗肽稱取15g魚肉加85g雙蒸水，用底物濃度為3g蛋白/100mL，E/S=2，6mg胰蛋白酶，分別酶解至2、4、6、8、10h。將各樣品放入沸水浴中滅酶15min。將沸水浴滅酶后的溶液加入離心管中，在10000r/min，4下離心30min，即可得2、4、6、8、10h的粗肽溶液。3.1.2 蛋白測(cè)定 試劑配制1.考馬斯亮藍(lán)試劑：配制成含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2.標(biāo)注蛋白質(zhì)溶液：純的牛血清蛋白和0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋

24、白溶液。稀釋成不同的倍數(shù)。測(cè)吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table 1 Data sheet of the standard curve試管編號(hào)0123456100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml）0.00.15mol/L NaCl （ml）考馬斯亮藍(lán)試劑 （ml）5555555搖勻，1h內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照,在595nm處比色A595nm以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10g、20g、30g、40g、50g、60g），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品蛋白含

25、量的測(cè)定 用0.15mol/L NaCl將各樣品稀釋40倍，加入5mL的考馬斯亮藍(lán)，在595nm條件下測(cè)定各樣品的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中的蛋白含量。3.2 ACE粗提液的制備 將新鮮的兔肺洗凈，去除大的血管、脂肪，切成小塊，得到170g兔肺組織。為了使兔肺組織能夠被更好地?fù)v碎，將樣品分批進(jìn)行處理，每批20g，將處理好的兔肺組織放入燒杯中，并加入預(yù)冷的200mL的pH 8.3的硼酸緩沖液（含0.3mol/L NaCl），用組織粉碎機(jī)絞碎搖勻，重復(fù)九次，最后再用緩沖液將燒杯杯壁上的殘留物洗入處理液中，放入冰箱中冷藏靜置5h使浸提物充分溶解。在4、10000r/min離心20min，得上

26、清液1800mL。取1mL上清液于1.5mL的離心管中，放入冰箱中凍藏，以備測(cè)蛋白質(zhì)含量和酶活。3.3 硫酸銨分級(jí)沉淀3.3.1 硫酸銨的第一次分級(jí)沉淀冰浴條件下向上清液中緩慢加入35%飽和度的硫酸銨，邊加邊緩慢攪拌，防止大量泡沫產(chǎn)生使蛋白質(zhì)變性。將混合液放入冰箱中靜置5h左右后，于4、10000r/min下離心20min，取上清液。3.3.2 硫酸銨的第二次分級(jí)沉淀冰浴條件下在離心后的上清液中緩慢加入55%飽和度的硫酸銨，邊加邊緩慢攪拌，防止大量泡沫產(chǎn)生使蛋白質(zhì)變性。冰箱中靜置12h左右，在4、7000r/min下離心10min，收集沉淀，用適量的預(yù)冷的pH 8.3的硼酸緩沖液（含0.3mo

27、l/L NaCl）溶解。3.4 透析將沉淀溶解液裝入干凈的截留分子量為14000±2000的透析袋，并用透析袋夾夾好，放入硼酸緩沖液(含0.3mol/L NaCl)在4透析，間隔更換透析液，以10%（W/W）的BaCl2為檢測(cè)液，直至透析液中無(wú)SO42+存在。3.5 冷凍干燥 將透析得到的酶液分裝與4個(gè)小坩堝中，放入0冰箱中冷凍，凍結(jié)后再放入-20冷凍箱中冷凍1h，再轉(zhuǎn)移入-70超低溫冰箱中冷凍1h，最后進(jìn)行冷凍干燥，即可得粉末狀的樣品。稱得質(zhì)量為1.0548g。3.6 樣品蛋白含量的測(cè)定 將待測(cè)樣品進(jìn)行一定的稀釋，其中粗提液、一次沉淀清液和二次沉淀清液稀釋200倍，透析液稀釋40倍

28、。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中的蛋白含量。3.7 SDS-PAGE檢測(cè)ACE粗酶蛋白分布情況 用12%的分離膠和3%的濃縮膠制膠，待膠凝固后，將透析液和粗提液進(jìn)樣，接通電源，在78V、53mA下，使進(jìn)樣全部通過(guò)濃縮膠，再在150V、96mA下，通電1h。待樣品跑好后進(jìn)行染色和脫色。3.8 ACE抑制活性的測(cè)定稱取3.4mg粗酶，按商業(yè)酶5.35U/mL固體計(jì)算，即含18.19U。加入87.2LHEPES緩沖液（50mmol/L,含300mmol/LNaCl），溶解得39mg/mL自制ACE酶液。用HEPES緩沖液（50mmol/L,含300mmol/LNaCl）稀釋自制酶液得13mg/mL自制A

29、CE酶液，其酶活力為6.06U。取上述自制ACE酶液10L，同時(shí)取0.1U/mL的商業(yè)酶10L做空白試驗(yàn)，和80L HEPES緩沖液（50mmol/L,300mmol/LNaCl）混合置于37下水浴5min，然后于同一溫度下加入80L的HHL溶液水浴反應(yīng)30min，最后在混合體系中加入200L HCl（1mol/L）終止反應(yīng)，樣品經(jīng)0.22m的濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。分別用10L的商業(yè)酶和自制酶與80L的2、4、6、8、10h的粗肽混合置于37下水浴5min，然后于同一溫度下加入80L的HHL溶液水浴反應(yīng)30min，同時(shí)用10L和80L的HEPES緩沖液（50mmol/L,300mmol/LNaCl）

30、代替酶液和HHL溶液做對(duì)照試驗(yàn)，最后在混合體系中加入200L HCl（1mol/L）終止反應(yīng)，樣品經(jīng)0.22m的濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。色譜條件：Intertsil ODS-SP柱（4.6×250mm，5m）；流動(dòng)相：50%甲醇（甲醇/超純水，1:1）,其中包含0.1%三氟乙酸（TFA）；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228nm；柱溫：25；檢測(cè)時(shí)間：20min；進(jìn)樣量：10L；定量方法：外標(biāo)法。抑制率計(jì)算公式如下：抑制率I（%）=（A-（B-C）/A ×100% A為抑制劑不存在的條件下ACE與HHL反應(yīng)的混合物中馬尿酸的峰面積； B為抑制劑存在的條件下ACE與HHL反應(yīng)的混合

31、物中馬尿酸的峰面積； C為抑制劑存在且不添加ACE條件下在馬尿酸出峰位置相關(guān)肽的峰面積。4 結(jié)果與討論4.1 蛋白含量的測(cè)定結(jié)果4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，所得結(jié)果如下：表2小牛血清白蛋白吸光度Table 2 Calf serum albumin spectrophotometry編號(hào)蛋白濃度ug/ml吸光度（595nm）1100.1032200.1883300.2834400.3605500.4616600.524根據(jù)上述數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2:圖3小牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of calf serum albumin co

32、ncentration 回歸方程為y=116.34x-2.284，R2=0.9975，表明蛋白濃度在0-60ug/ml范圍內(nèi)，其濃度與吸收度線性關(guān)系良好。4.1.2 小黃魚樣品中的蛋白含量的測(cè)定各組分樣品進(jìn)行稀釋按照考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行吸光度的測(cè)定，再根據(jù)公式y(tǒng)=116.34x-2.284進(jìn)行計(jì)算，最終蛋白質(zhì)含量（%）=n×y，其中n為稀釋的倍數(shù)，所得結(jié)果如下：表3 各組分的蛋白含量Table 3 Protein content of the various components樣品吸光值平均值蛋白濃度（mg/ml）2h0.3860.3840.3860.3850.8524h0.3230.

33、3260.3250.3250.7116h0.2820.2840.2850.2840.6168h0.2870.2850.2830.2850.61910h0.2560.2560.2540.2510.5394.1.3 兔肺樣品中的蛋白含量的測(cè)定表4 各組分的蛋白含量Table 4 Protein content of the various components樣品吸光值平均值蛋白濃度（mg/ml）粗提液0.5210.5200.5210.52111.673一次沉淀清液0.3490.3560.3570.3547.795二次沉淀清液0.2200.2220.2230.2224.716透析液0.1400.1

34、440.1420.1420.5724.2 ACE分子量的測(cè)定 聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示一條帶，可見(jiàn)經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀方法分離提純達(dá)到了電泳純，如圖4，第3組條帶中圈內(nèi)條帶即為目標(biāo)帶，且ACE分子量約為165kD。圖 4 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定ACE粗酶Fig. 4 SDS-PAGE identification of ACE4.2 粗酶濃度的優(yōu)化 通過(guò)做0.06mg/mL、0.12mg/mL、1.2mg/mL、13mg/mL和39mg/mL的粗酶做空白試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有13mg/mL和39mg/mL的粗酶下的峰和商品酶活性相一致，且39mg/mL的粗酶的峰效果更好，從而用39mg/mL的粗酶做小黃魚A

35、CE抑制肽的體外活性測(cè)定。4.3 ACE抑制活性的測(cè)定本論文采用高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)自制酶ACE的活性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)我們所得的5個(gè)抑制肽組分對(duì)商品酶和自制酶抑制活性進(jìn)行測(cè)定，得到抑制率較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相應(yīng)的色譜圖如下：圖5 商品酶與HHL反應(yīng)的空白對(duì)照組Fig. 5 commodity enzyme reaction with HHL blank control group 圖6 商品酶與抑制肽反應(yīng)組Fig. 6 commodity enzyme and inhibitory peptides reaction group圖7 自制酶與HHL反應(yīng)的空白對(duì)照組Fig. 7 homemade en

36、zyme reaction with HHL blank control group圖8 自制酶與抑制肽反應(yīng)組Fig. 8 homemade enzyme and inhibitory peptides reaction group圖9 抑制肽對(duì)照組Fig. 9 inhibitory peptides reaction group三肽HHL在ACE的催化下快速地分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽His-Leu(簡(jiǎn)稱HL)。當(dāng)加入ACE抑制肽的樣品時(shí)，ACE的活性受到抑制，馬尿酸和二肽的生成量減少，因此可通過(guò)HPLC測(cè)定馬尿酸的生成量來(lái)評(píng)價(jià)ACE抑制肽對(duì)ACE活性的抑制率。對(duì)比圖5和圖6、圖7和圖8，我們可以

37、看出來(lái)加入ACE后，圖6和圖8中產(chǎn)生了大量馬尿酸，而圖9未加ACE，馬尿酸產(chǎn)生很少，所以自制ACE酶具有活性。通過(guò)圖7與圖5對(duì)比，說(shuō)明自制ACE沒(méi)有雜峰，也說(shuō)明提取的ACE所含雜質(zhì)較少，再與空白組比較則可求出各組分對(duì)ACE的抑制作用。各組分經(jīng)反應(yīng)體系后，過(guò)反相高效液相色譜測(cè)出各組反應(yīng)的峰面積，按照公式計(jì)算抑制肽對(duì)商品酶和自制酶的抑制率，通過(guò)數(shù)據(jù)繪得抑制肽對(duì)商品酶和自制酶抑制率的柱形對(duì)比圖，如圖10：圖10 抑制肽對(duì)商品酶和自制酶的抑制率Fig. 10 inhibitory peptides enzyme inhibition rate on commodity enzyme and homem

38、ade enzyme如圖10，第1組為2h抑制肽對(duì)商品酶和自制酶的抑制率，依次往下：2、3、4、5分別為4h、6h、8h和10h抑制肽對(duì)商品酶和自制酶的抑制率。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，小黃魚ACE抑制肽抑制率越高，這一結(jié)果與Mullally等46報(bào)道的結(jié)果相一致。從圖10上可看出，自制抑制肽對(duì)商品酶和自制酶同時(shí)有抑制作用，說(shuō)明自制粗酶具有一定的活性，可以用于實(shí)驗(yàn)室的其它關(guān)于體外活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。同一組實(shí)驗(yàn)中商品酶的活性抑制率稍低于自制酶的活性抑制率，而在同一濃度的抑制肽的作用下，抑制率越高表明酶的活性越低，故自制酶的質(zhì)量與商品酶的質(zhì)量存在一定的差距。5 結(jié)論經(jīng)過(guò)上述分析可知，兔肺ACE經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉

39、淀分離，13mg/mL自制ACE酶液，可以發(fā)揮6.06U/mL商品酶的活性。且提取的ACE性質(zhì)與商品ACE相同，僅純度和活力稍低，但是不影響其對(duì)于降血壓肽ACE抑制活性的檢測(cè)。因此可以將自制的ACE用于體外ACE抑制肽的活性檢測(cè)。參考文獻(xiàn)1夏鎮(zhèn)波. 酪蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備及分離純化研究D.南京農(nóng)業(yè)大學(xué).2008.2黎觀紅. 食物蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究D.江南大學(xué)，2005.3Christos G.Papadimitriou, Anna Vafopoulou-Mastrojiannaki, Sofia Vieira, et al. Identification of pe

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