電泳八年制(法)

1、細胞與分子生物學實驗教學平臺細胞與分子生物學實驗教學平臺 電泳課程安排課程安排 生化四大基本技術生化四大基本技術 電泳（P5,P14,P16） 層析 （P23,P30,P32,P35） 分光光度法（比色法） 離心法 分子生物學實驗（鼠肝分子生物學實驗（鼠肝actinactin基因的檢測）基因的檢測） （P109,P58）（P123）課程要求 重視過程，重視結果分析 注意融會貫通，方法應用 考試 平時成績 發(fā)展發(fā)展 概念概念 基本原理基本原理 影響因素影響因素 種類種類 應用應用The Nobel Prize in Chemistry 1948Arne Tiselius 18081808年年-俄

2、國物理學家俄國物理學家ReRessss發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。19371937年年-瑞典科學家瑞典科學家Tiselius首先設計出世界上第一臺自由電首先設計出世界上第一臺自由電泳儀，并建立了泳儀，并建立了“移界電泳移界電泳”分離模式。以電泳作為一種分離技分離模式。以電泳作為一種分離技術，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、術，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、11、22、和和球蛋白球蛋白組成的。組成的。 for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concern

3、ing the complex nature of the serum proteins發(fā)展發(fā)展 20世紀世紀50年代，以支持介質為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，年代，以支持介質為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。 60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。 1967年在凝膠電泳的基礎上建立了年在凝膠電泳的基礎上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠電泳技術。膠電泳技術。 90年代又推出了分辨率極高的高效毛細管電泳。如今

4、，年代又推出了分辨率極高的高效毛細管電泳。如今，各類電泳技術已廣泛應用于生命科學各個領域。各類電泳技術已廣泛應用于生命科學各個領域。電泳的基本概念電泳的基本概念 帶電粒子帶電粒子在在電場電場的作用下，向著的作用下，向著與其電性相反的電極與其電性相反的電極移動移動的現(xiàn)象稱為電泳的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis) 。 帶電粒子由于帶電性質及電荷量不同，在一定的電場強度帶電粒子由于帶電性質及電荷量不同，在一定的電場強度下具有不同的移動速度及方向。下具有不同的移動速度及方向。 電泳技術就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同電泳技術就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質進行

5、分離的一類實驗技術。而對物質進行分離的一類實驗技術。電泳用于分離物質的原理（電泳用于分離物質的原理（1 1）電荷量及方向：蛋白質為例電荷量及方向：蛋白質為例等電點等電點電泳用于分離物質的原理（電泳用于分離物質的原理（2 2） 遷移率：以以 來表示，來表示，即單位電場強度時粒子即單位電場強度時粒子運動的速度，取決于帶電粒子的電荷量運動的速度，取決于帶電粒子的電荷量Q、粒子、粒子大小大小和形狀。和形狀。電泳用于分離物質的原理（電泳用于分離物質的原理（3 3） 具體實驗中：具體實驗中： 設：混合物中有設：混合物中有A A、B B兩物質：兩物質： 物質物質A在電場中移動的距離為在電場中移動的距離為:

6、物質物質B的移動距離為：的移動距離為： 則兩物質移動距離之差為：則兩物質移動距離之差為： 即：物質即：物質A、B能否分離取決于兩者的遷移率能否分離取決于兩者的遷移率 影響電泳速度的因素：影響電泳速度的因素：。影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 決定帶電粒子的解離的程度，即該物質帶凈電荷多少的決定帶電粒子的解離的程度，即該物質帶凈電荷多少的決定因素。決定因素。 對蛋白質等兩性電解質而言，對蛋白質等兩性電解質而言，pHpH值離值離 等電點越等電點越遠，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度也越快，反之，則越遠，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度也越快，反之，則越慢。慢。 為了使電泳過程中溶液為了使電

7、泳過程中溶液pH pH 值恒定，必值恒定，必 須采用緩沖溶液。須采用緩沖溶液。一般常用的電泳緩沖液一般常用的電泳緩沖液 pHpH范圍在范圍在4.59.04.59.0。影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 溶液的離子強度溶液的離子強度 維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要與其濃與其濃度和價數(shù)相關。度和價數(shù)相關。 I=1/2I=1/2 CZCZ2 2 緩沖液緩沖液I I越大，樣品電流減小，泳動速度變慢，區(qū)分條帶清晰；越大，樣品電流減小，泳動速度變慢，區(qū)分條帶清晰；過高會壓縮質點的雙電層，最后破壞膠體，不能泳動。過高會壓縮質點的雙電層，

8、最后破壞膠體，不能泳動。 I I越小，則泳動速度快，條帶分離差，過低，緩沖容量小，越小，則泳動速度快，條帶分離差，過低，緩沖容量小，PHPH不穩(wěn)定，不穩(wěn)定， 樣品易擴散。樣品易擴散。 一般在一般在0.02-0.20.02-0.2。 影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 是指電場中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電是指電場中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢梯度。電場強度對電泳的速度起著重要作用，電場勢梯度。電場強度對電泳的速度起著重要作用，電場強度高，帶電顆粒泳動速度快，電場強度低，帶電顆強度高，帶電顆粒泳動速度快，電場強度低，帶電顆粒泳動速度慢。粒泳動速度慢。 電壓越高，產(chǎn)熱增加，高壓

9、電泳需備冷卻裝置。電壓越高，產(chǎn)熱增加，高壓電泳需備冷卻裝置。 否則？否則？影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 支持介質：支持介質：(1)物理化學性質穩(wěn)定：在電泳過程中不受環(huán)境因素的影物理化學性質穩(wěn)定：在電泳過程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。響，保持原有的狀態(tài)和性能。(2)化學惰性：在電泳過程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子化學惰性：在電泳過程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學反應，不干擾生物大和待分離的生物大分子發(fā)生化學反應，不干擾生物大分子的電泳過程。分子的電泳過程。(3)分布均勻：內(nèi)電滲小，結果重復性好分布均勻：內(nèi)電滲小，結果重復性好電滲：電滲： 液體

10、對固體支持物的相對移動，液體對固體支持物的相對移動，在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負離子使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液就向一定方向移動。種類：自由界面電泳自由界面電泳區(qū)帶電泳：區(qū)帶電泳：連續(xù)系統(tǒng)：連續(xù)系統(tǒng)：不連續(xù)系統(tǒng)：不連續(xù)系統(tǒng)：盤狀盤狀平板式平板式垂直板式垂直板式電荷效應：電荷效應：電荷量不同，遷移率不同。電荷量不同，遷移率不同。分子篩效應：分子篩效應：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應。分子量小，阻出不同的遷移率，這就是分子篩

11、效應。分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。電泳技術的應用 分離純化樣品分離純化樣品 測定分子量測定分子量 組建物理圖譜組建物理圖譜 鑒定重組體鑒定重組體 分子雜交分子雜交 測序測序 PCR檢測檢測 分子標記檢測分子標記檢測醋酸纖維薄膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細密且薄的微孔醋酸纖維薄膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細密且薄的微孔膜。廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的分離分析中。膜。廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的分離分析中。（醋酸纖（醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白）維素薄膜電泳分離血清清蛋白）聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋

12、白質的分離、純化及檢測。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。其分辨率較高。其分辨率較高。（等電聚焦電泳分離血紅蛋白和細胞色素（等電聚焦電泳分離血紅蛋白和細胞色素C）瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容：原理：原理：以醋酸纖維薄膜為支持物，在以醋酸纖維薄膜為支持物，在PH=8.6的巴比妥緩沖的巴比妥緩沖液中

13、，血清蛋白的液中，血清蛋白的PI均小于均小于8.6，帶負電荷，電泳時向正極，帶負電荷，電泳時向正極移動。由于遷移率不同而被分離，移動。由于遷移率不同而被分離，氨基黑10B 酸性染料，其磺酸基與蛋白質反應構成復合鹽，是最常用的蛋白質染料。這類染料對不同的蛋白質結合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質的定量。染色靈敏度較低，現(xiàn)在這類染料已很少應用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍所代替。優(yōu)缺點醋酸纖維薄膜廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種醋酸纖維薄膜廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的分離分析中，如血清蛋白、血生物分子的分離分析中，如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎

14、蛋白、類固醇及同工酶等。它具有蛋白、類固醇及同工酶等。它具有簡單快簡單快速、速、對蛋白質樣品吸附極少，無對蛋白質樣品吸附極少，無“拖尾拖尾”現(xiàn)象，染色后蛋白質區(qū)帶更清晰等優(yōu)點，現(xiàn)象，染色后蛋白質區(qū)帶更清晰等優(yōu)點，電滲作用雖然較高但很均一電滲作用雖然較高但很均一 ，不影響樣，不影響樣品的分離效果。不足之處是品的分離效果。不足之處是分辨率比聚丙分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，烯酰胺凝膠電泳低，由于薄膜厚度小（約由于薄膜厚度?。s10100m），樣品用量很少，不適于制），樣品用量很少，不適于制備備臨床意義：白蛋白：主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關。白蛋白：主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關。

15、球蛋白的增加與發(fā)熱有關，與炎癥有關。球蛋白的增加與發(fā)熱有關，與炎癥有關。球蛋白增加常伴隨血中脂質的增加。球蛋白增加常伴隨血中脂質的增加。球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在球蛋白與球蛋白與球蛋白之間出現(xiàn)一個尖峰：球蛋白之間出現(xiàn)一個尖峰：M蛋白蛋白 肝硬化病人肝硬化病人球蛋白增加，白蛋白降低。球蛋白增加，白蛋白降低。聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分離離HbHb和細胞色素和細胞色素C C細胞與分子生物學實驗教學平臺細胞與分子生物學實驗教學平臺Xu_ 聚

16、丙烯酰胺等電聚焦電泳聚丙烯酰胺等電聚焦電泳( (IsoelectricIsoelectric Focusing-PAGEFocusing-PAGE，簡稱，簡稱IEF-PAGE)IEF-PAGE)： 利用各種利用各種蛋白質蛋白質pI不同，以不同，以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠為電泳為電泳支持物，并在其中加入支持物，并在其中加入兩性電解質載體兩性電解質載體(carrier ampholytes)，兩性電解質載體在電場作用下，按各自兩性電解質載體在電場作用下，按各自PI形成從陽極到陰極逐漸增加的形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的平滑和連續(xù)的pH梯度梯度。在電場作用下，蛋白質在此在電場作用下，蛋白

17、質在此pH梯度凝膠中泳動，當遷梯度凝膠中泳動，當遷移至移至pH值等于值等于pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。的區(qū)帶。原理：原理：蛋白質是兩性電解質蛋白質是兩性電解質蛋白質由于等電點的不同而帶有不同的電荷性質。在電場下發(fā)生蛋白質由于等電點的不同而帶有不同的電荷性質。在電場下發(fā)生移動，當它們達到凈電荷為零時停止遷移，分別聚焦在各自等電移動，當它們達到凈電荷為零時停止遷移，分別聚焦在各自等電點相應的點相應的pH位置，這種行為稱為位置，這種行為稱為聚焦反應聚焦反應。蛋白質在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其等電點，達到穩(wěn)態(tài)蛋白質在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其

18、等電點，達到穩(wěn)態(tài)后，如果它要正極或負極任何一側擴散，均會受到相應的后，如果它要正極或負極任何一側擴散，均會受到相應的pH制約，制約，迫使其擴散后退回原位。因此，蛋白質能在等電點位置被聚焦成迫使其擴散后退回原位。因此，蛋白質能在等電點位置被聚焦成一條穩(wěn)定的窄帶。一條穩(wěn)定的窄帶。分辨率高，有濃縮效應。分辨率高，有濃縮效應。 等點聚焦特點等點聚焦特點 在等電聚焦電泳中，分離是在在等電聚焦電泳中，分離是在連續(xù)的連續(xù)的pH梯度梯度中進行的，中進行的，用兩性電解質建立電場中連續(xù)線性用兩性電解質建立電場中連續(xù)線性pH梯度。梯度。 只適用于兩性解離的物質電泳只適用于兩性解離的物質電泳 以以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯

19、酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophorsis，簡稱，簡稱PAGE)為電泳支持物為電泳支持物,分辨率高分辨率高 用于分離、鑒定蛋白質用于分離、鑒定蛋白質pHpH梯度的形成梯度的形成載體兩性電解質定義載體兩性電解質定義：許多異構體與同系物的混合物，化學本質：許多異構體與同系物的混合物，化學本質是多羧基多氨基脂肪族化合物，具有連續(xù)的是多羧基多氨基脂肪族化合物，具有連續(xù)的PI值。值。在沒有電場時在沒有電場時,載體兩性電解質溶液的載體兩性電解質溶液的pH值大約是該溶液值大約是該溶液pH范圍范圍的平均值的平均值(如如pH3-10的載體兩性電解質溶液的載體兩性電解質溶液,其其

20、pH約為約為6.5左右左右)。所以載體兩性電解質分子都帶有電荷所以載體兩性電解質分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負只是在溶液中的正電荷和負電荷數(shù)目相等電荷數(shù)目相等,凈電荷為零凈電荷為零. 引入電場時引入電場時,載體兩性電解質分子分別載體兩性電解質分子分別向陰極和陽極移動向陰極和陽極移動,最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移.pHpH梯度的形成梯度的形成 靠近陽極端的載體兩性電解質靠近陽極端的載體兩性電解質,電負性最強電負性最強,具有較強的具有較強的緩沖氫離子的能力緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質的等于載體兩性電解質的pI,一直向陰極

21、順延一直向陰極順延; 靠近陰極端的載體兩性電解質靠近陰極端的載體兩性電解質,電正性最強電正性最強,具有較強的具有較強的緩沖氫氧根離子的能力緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的使環(huán)境的pH等于載體兩性電解等于載體兩性電解質的質的pI,一直向陽極順延。一直向陽極順延。 在正極注入酸液如：硫酸，磷酸；負極注入堿液如在正極注入酸液如：硫酸，磷酸；負極注入堿液如NaOH，避免樣品和兩性電解質載體在陽極氧化，或，避免樣品和兩性電解質載體在陽極氧化，或在陰極還原。在陰極還原。加加 酸酸加加 堿堿pI小小大大關鍵是形成關鍵是形成pH梯度梯度pH低低高高理想的兩性電解質載體理想的兩性電解質載體(carrier (ca

22、rrier ampholytesampholytes) )(1)(1)易溶于水，在易溶于水，在pIpI處應有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的處應有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pHpH梯度，不梯度，不致被蛋白質或其它兩性電解質改變致被蛋白質或其它兩性電解質改變pHpH梯度。梯度。(2)(2)在在pIpI處應有良好的電導及相同的電導系數(shù)，以保持均勻的電場。處應有良好的電導及相同的電導系數(shù)，以保持均勻的電場。(3)(3)分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開。分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開。(4)(4)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，也無變性作用，其化化學性

23、能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，也無變性作用，其化學組成不同于蛋白質。學組成不同于蛋白質。 兩性電解質載體的兩性電解質載體的pIpI愈連續(xù)，形成的愈連續(xù)，形成的pHpH梯度愈平滑。梯度愈平滑。pHpH梯度的形成：梯度的形成：Ampholine(瑞典瑞典LKB) 它是由許多脂肪族的多氨基它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構體和同系物多羧基的異構體和同系物組成的組成的, 具有連續(xù)的氨基羧基比，具有連續(xù)的氨基羧基比，pH范圍范圍3.5-10. 分子量分子量300-1000 280 nm紫外吸收低紫外吸收低抗對流支持介質：聚丙烯酰胺凝膠（PAGE） 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠( (polyacry

24、lamidepolyacrylamide gel) gel)是由單體丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺( (acrylamideacrylamide，簡稱，簡稱AcrAcr) )和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑( (crosslinker)N,Ncrosslinker)N,N-甲甲叉雙丙烯酰胺叉雙丙烯酰胺(N,N-(N,N-methylenebimethylenebi sacrylamidesacrylamide，簡稱，簡稱BisBis) )在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結構的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠構的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚

25、丙烯酰胺凝膠電泳電泳( (polyacrylamidepolyacrylamide gel gel electrophorsiselectrophorsis，簡稱，簡稱PAGE)PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(free radicals)的的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完來完成的。催化體系主要有化學催化（成的。催化體系主要有化學催化（APTEMED）和光化學催化）和光化學催化（核黃素（核黃素TMTED）體系。

26、）體系。 單體：丙烯酰胺（單體：丙烯酰胺（Acr）；）； 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；）； 催化劑：過硫酸胺或核黃素；催化劑：過硫酸胺或核黃素； 加速劑：四甲基乙二胺（加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；）； 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結構凝膠產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結構凝膠AP-TMTED催化體系：催化體系：TMTED是一種脂肪族叔胺，是一種脂肪族叔胺，TEMED催化催化AP生成硫酸自由基：生成硫酸自由基：S2O82 2SO4硫酸自由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活Acr單體并形成單體長鏈：單體并形成單體長鏈：影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素 試劑的純度試

27、劑的純度 溫度溫度 氧氣氧氣 APTEMED原則：盡量少的催原則：盡量少的催化劑并在最佳時間內(nèi)聚合化劑并在最佳時間內(nèi)聚合。聚丙烯酰胺凝膠為支持介質的優(yōu)點：聚丙烯酰胺凝膠為支持介質的優(yōu)點： 分辨率高，幾乎無帶電基團，電內(nèi)滲小。分辨率高，幾乎無帶電基團，電內(nèi)滲小。 化學惰性強，穩(wěn)定性好，親水性好?；瘜W惰性強，穩(wěn)定性好，親水性好。 具有很好的光學透明度和一定的剛性。具有很好的光學透明度和一定的剛性。 抗對流和擴散?？箤α骱蛿U散。 具有可控的孔徑大小。具有可控的孔徑大小。樣品的預處理樣品的預處理鹽離子可干擾鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進

28、行行IEF-PAGE時，樣品應透析或用時，樣品應透析或用Sephadex G-25脫鹽，也可脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。粒引起拖尾。為提高疏水蛋白在水中的溶解度，可添加尿素，無離子為提高疏水蛋白在水中的溶解度，可添加尿素，無離子/兩性離兩性離子去污劑。子去污劑。加樣量則取決于樣品中蛋白質的種類、數(shù)目以及檢測方法的靈加樣量則取決于樣品中蛋白質的種類、數(shù)目以及檢測方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍敏度。如用考馬斯亮藍R-250染色，加樣量可為染色，加樣量可為50-150 g；一；一般樣品濃度以般樣品濃度

29、以0.5-3 mg/mL為宜為宜操作方法：操作方法：1. 1. 凝膠柱的制備凝膠柱的制備（1 1）玻璃管的一端）玻璃管的一端7 cm7 cm處作標記處作標記 用膠布封底，用膠布封底， 插入插座，垂直插入插座，垂直放置放置（2）配膠）配膠 10mL 7.5%凝膠的配制凝膠的配制試試 劑劑 名名 稱稱 體積體積(mL)凝膠貯液凝膠貯液 2.0兩性電解質載體兩性電解質載體 0.2蛋白質樣品蛋白質樣品 各各0.1蒸餾水蒸餾水 7.010%過硫酸銨過硫酸銨 0.1520%TEMED 0.06（3 3）將配好的凝膠溶）將配好的凝膠溶液用細長頭滴管加液用細長頭滴管加到預先準備好的玻到預先準備好的玻管中，管中，至至7 cm7 cm處處，再用注射器緩緩加再用注射