電泳八年制(法)

1、細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái) 電泳課程安排課程安排 生化四大基本技術(shù)生化四大基本技術(shù) 電泳（P5,P14,P16） 層析 （P23,P30,P32,P35） 分光光度法（比色法） 離心法 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（鼠肝分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（鼠肝actinactin基因的檢測(cè)）基因的檢測(cè)） （P109,P58）（P123）課程要求 重視過(guò)程，重視結(jié)果分析 注意融會(huì)貫通，方法應(yīng)用 考試 平時(shí)成績(jī) 發(fā)展發(fā)展 概念概念 基本原理基本原理 影響因素影響因素 種類種類 應(yīng)用應(yīng)用The Nobel Prize in Chemistry 1948Arne Tiselius 18081808年年-俄

2、國(guó)物理學(xué)家俄國(guó)物理學(xué)家ReRessss發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。19371937年年-瑞典科學(xué)家瑞典科學(xué)家Tiselius首先設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電首先設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電泳儀，并建立了泳儀，并建立了“移界電泳移界電泳”分離模式。以電泳作為一種分離技分離模式。以電泳作為一種分離技術(shù)，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、術(shù)，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、11、22、和和球蛋白球蛋白組成的。組成的。 for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concern

3、ing the complex nature of the serum proteins發(fā)展發(fā)展 20世紀(jì)世紀(jì)50年代，以支持介質(zhì)為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，年代，以支持介質(zhì)為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。 60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。 1967年在凝膠電泳的基礎(chǔ)上建立了年在凝膠電泳的基礎(chǔ)上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。膠電泳技術(shù)。 90年代又推出了分辨率極高的高效毛細(xì)管電泳。如今

4、，年代又推出了分辨率極高的高效毛細(xì)管電泳。如今，各類電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。各類電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。電泳的基本概念電泳的基本概念 帶電粒子帶電粒子在在電場(chǎng)電場(chǎng)的作用下，向著的作用下，向著與其電性相反的電極與其電性相反的電極移動(dòng)移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis) 。 帶電粒子由于帶電性質(zhì)及電荷量不同，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度帶電粒子由于帶電性質(zhì)及電荷量不同，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下具有不同的移動(dòng)速度及方向。下具有不同的移動(dòng)速度及方向。 電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行

5、分離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳用于分離物質(zhì)的原理（電泳用于分離物質(zhì)的原理（1 1）電荷量及方向：蛋白質(zhì)為例電荷量及方向：蛋白質(zhì)為例等電點(diǎn)等電點(diǎn)電泳用于分離物質(zhì)的原理（電泳用于分離物質(zhì)的原理（2 2） 遷移率：以以 來(lái)表示，來(lái)表示，即單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子即單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，取決于帶電粒子的電荷量運(yùn)動(dòng)的速度，取決于帶電粒子的電荷量Q、粒子、粒子大小大小和形狀。和形狀。電泳用于分離物質(zhì)的原理（電泳用于分離物質(zhì)的原理（3 3） 具體實(shí)驗(yàn)中：具體實(shí)驗(yàn)中： 設(shè)：混合物中有設(shè)：混合物中有A A、B B兩物質(zhì)：兩物質(zhì)： 物質(zhì)物質(zhì)A在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為:

6、物質(zhì)物質(zhì)B的移動(dòng)距離為：的移動(dòng)距離為： 則兩物質(zhì)移動(dòng)距離之差為：則兩物質(zhì)移動(dòng)距離之差為： 即：物質(zhì)即：物質(zhì)A、B能否分離取決于兩者的遷移率能否分離取決于兩者的遷移率 影響電泳速度的因素：影響電泳速度的因素：。影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 決定帶電粒子的解離的程度，即該物質(zhì)帶凈電荷多少的決定帶電粒子的解離的程度，即該物質(zhì)帶凈電荷多少的決定因素。決定因素。 對(duì)蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)而言，對(duì)蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)而言，pHpH值離值離 等電點(diǎn)越等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動(dòng)速度也越快，反之，則越遠(yuǎn)，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動(dòng)速度也越快，反之，則越慢。慢。 為了使電泳過(guò)程中溶液為了使電

7、泳過(guò)程中溶液pH pH 值恒定，必值恒定，必 須采用緩沖溶液。須采用緩沖溶液。一般常用的電泳緩沖液一般常用的電泳緩沖液 pHpH范圍在范圍在4.59.04.59.0。影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度 維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要與其濃與其濃度和價(jià)數(shù)相關(guān)。度和價(jià)數(shù)相關(guān)。 I=1/2I=1/2 CZCZ2 2 緩沖液緩沖液I I越大，樣品電流減小，泳動(dòng)速度變慢，區(qū)分條帶清晰；越大，樣品電流減小，泳動(dòng)速度變慢，區(qū)分條帶清晰；過(guò)高會(huì)壓縮質(zhì)點(diǎn)的雙電層，最后破壞膠體，不能泳動(dòng)。過(guò)高會(huì)壓縮質(zhì)點(diǎn)的雙電層，

8、最后破壞膠體，不能泳動(dòng)。 I I越小，則泳動(dòng)速度快，條帶分離差，過(guò)低，緩沖容量小，越小，則泳動(dòng)速度快，條帶分離差，過(guò)低，緩沖容量小，PHPH不穩(wěn)定，不穩(wěn)定， 樣品易擴(kuò)散。樣品易擴(kuò)散。 一般在一般在0.02-0.20.02-0.2。 影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 是指電場(chǎng)中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電是指電場(chǎng)中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳的速度起著重要作用，電場(chǎng)勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳的速度起著重要作用，電場(chǎng)強(qiáng)度高，帶電顆粒泳動(dòng)速度快，電場(chǎng)強(qiáng)度低，帶電顆強(qiáng)度高，帶電顆粒泳動(dòng)速度快，電場(chǎng)強(qiáng)度低，帶電顆粒泳動(dòng)速度慢。粒泳動(dòng)速度慢。 電壓越高，產(chǎn)熱增加，高壓

9、電泳需備冷卻裝置。電壓越高，產(chǎn)熱增加，高壓電泳需備冷卻裝置。 否則？否則？影響電泳速度的因素：外影響電泳速度的因素：外 支持介質(zhì)：支持介質(zhì)：(1)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過(guò)程中不受環(huán)境因素的影物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過(guò)程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。響，保持原有的狀態(tài)和性能。(2)化學(xué)惰性：在電泳過(guò)程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子化學(xué)惰性：在電泳過(guò)程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不干擾生物大和待分離的生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不干擾生物大分子的電泳過(guò)程。分子的電泳過(guò)程。(3)分布均勻：內(nèi)電滲小，結(jié)果重復(fù)性好分布均勻：內(nèi)電滲小，結(jié)果重復(fù)性好電滲：電滲： 液體

10、對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，在電場(chǎng)中，由于多孔支持物吸附水中的正或負(fù)離子使溶液相對(duì)帶電，在電場(chǎng)作用下，溶液就向一定方向移動(dòng)。種類：自由界面電泳自由界面電泳區(qū)帶電泳：區(qū)帶電泳：連續(xù)系統(tǒng)：連續(xù)系統(tǒng)：不連續(xù)系統(tǒng)：不連續(xù)系統(tǒng)：盤狀盤狀平板式平板式垂直板式垂直板式電荷效應(yīng)：電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。電荷量不同，遷移率不同。分子篩效應(yīng)：分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻出不同的遷移率，這就是分子篩

11、效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。電泳技術(shù)的應(yīng)用 分離純化樣品分離純化樣品 測(cè)定分子量測(cè)定分子量 組建物理圖譜組建物理圖譜 鑒定重組體鑒定重組體 分子雜交分子雜交 測(cè)序測(cè)序 PCR檢測(cè)檢測(cè) 分子標(biāo)記檢測(cè)分子標(biāo)記檢測(cè)醋酸纖維薄膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細(xì)密且薄的微孔醋酸纖維薄膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細(xì)密且薄的微孔膜。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中。膜。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中。（醋酸纖（醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白）維素薄膜電泳分離血清清蛋白）聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋

12、白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。其分辨率較高。（等電聚焦電泳分離血紅蛋白和細(xì)胞色素（等電聚焦電泳分離血紅蛋白和細(xì)胞色素C）瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：原理：原理：以醋酸纖維薄膜為支持物，在以醋酸纖維薄膜為支持物，在PH=8.6的巴比妥緩沖的巴比妥緩沖液中

13、，血清蛋白的液中，血清蛋白的PI均小于均小于8.6，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。由于遷移率不同而被分離，移動(dòng)。由于遷移率不同而被分離，氨基黑10B 酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。這類染料對(duì)不同的蛋白質(zhì)結(jié)合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質(zhì)的定量。染色靈敏度較低，現(xiàn)在這類染料已很少應(yīng)用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍(lán)所代替。優(yōu)缺點(diǎn)醋酸纖維薄膜廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種醋酸纖維薄膜廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中，如血清蛋白、血生物分子的分離分析中，如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎

14、蛋白、類固醇及同工酶等。它具有蛋白、類固醇及同工酶等。它具有簡(jiǎn)單快簡(jiǎn)單快速、速、對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)“拖尾拖尾”現(xiàn)象，染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶更清晰等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)象，染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶更清晰等優(yōu)點(diǎn)，電滲作用雖然較高但很均一電滲作用雖然較高但很均一 ，不影響樣，不影響樣品的分離效果。不足之處是品的分離效果。不足之處是分辨率比聚丙分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，烯酰胺凝膠電泳低，由于薄膜厚度?。s由于薄膜厚度?。s10100m），樣品用量很少，不適于制），樣品用量很少，不適于制備備臨床意義：白蛋白：主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關(guān)。白蛋白：主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關(guān)。

15、球蛋白的增加與發(fā)熱有關(guān)，與炎癥有關(guān)。球蛋白的增加與發(fā)熱有關(guān)，與炎癥有關(guān)。球蛋白增加常伴隨血中脂質(zhì)的增加。球蛋白增加常伴隨血中脂質(zhì)的增加。球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在球蛋白與球蛋白與球蛋白之間出現(xiàn)一個(gè)尖峰：球蛋白之間出現(xiàn)一個(gè)尖峰：M蛋白蛋白 肝硬化病人肝硬化病人球蛋白增加，白蛋白降低。球蛋白增加，白蛋白降低。聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分離離HbHb和細(xì)胞色素和細(xì)胞色素C C細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)Xu_ 聚

16、丙烯酰胺等電聚焦電泳聚丙烯酰胺等電聚焦電泳( (IsoelectricIsoelectric Focusing-PAGEFocusing-PAGE，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱IEF-PAGE)IEF-PAGE)： 利用各種利用各種蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)pI不同，以不同，以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠為電泳為電泳支持物，并在其中加入支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)載體(carrier ampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自PI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的平滑和連續(xù)的pH梯度梯度。在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在此在電場(chǎng)作用下，蛋白

17、質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至移至pH值等于值等于pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。的區(qū)帶。原理：原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)的不同而帶有不同的電荷性質(zhì)。在電場(chǎng)下發(fā)生蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)的不同而帶有不同的電荷性質(zhì)。在電場(chǎng)下發(fā)生移動(dòng)，當(dāng)它們達(dá)到凈電荷為零時(shí)停止遷移，分別聚焦在各自等電移動(dòng)，當(dāng)它們達(dá)到凈電荷為零時(shí)停止遷移，分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的點(diǎn)相應(yīng)的pH位置，這種行為稱為位置，這種行為稱為聚焦反應(yīng)聚焦反應(yīng)。蛋白質(zhì)在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其等電點(diǎn)，達(dá)到穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其

18、等電點(diǎn)，達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，如果它要正極或負(fù)極任何一側(cè)擴(kuò)散，均會(huì)受到相應(yīng)的后，如果它要正極或負(fù)極任何一側(cè)擴(kuò)散，均會(huì)受到相應(yīng)的pH制約，制約，迫使其擴(kuò)散后退回原位。因此，蛋白質(zhì)能在等電點(diǎn)位置被聚焦成迫使其擴(kuò)散后退回原位。因此，蛋白質(zhì)能在等電點(diǎn)位置被聚焦成一條穩(wěn)定的窄帶。一條穩(wěn)定的窄帶。分辨率高，有濃縮效應(yīng)。分辨率高，有濃縮效應(yīng)。 等點(diǎn)聚焦特點(diǎn)等點(diǎn)聚焦特點(diǎn) 在等電聚焦電泳中，分離是在在等電聚焦電泳中，分離是在連續(xù)的連續(xù)的pH梯度梯度中進(jìn)行的，中進(jìn)行的，用兩性電解質(zhì)建立電場(chǎng)中連續(xù)線性用兩性電解質(zhì)建立電場(chǎng)中連續(xù)線性pH梯度。梯度。 只適用于兩性解離的物質(zhì)電泳只適用于兩性解離的物質(zhì)電泳 以以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯

19、酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophorsis，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱PAGE)為電泳支持物為電泳支持物,分辨率高分辨率高 用于分離、鑒定蛋白質(zhì)用于分離、鑒定蛋白質(zhì)pHpH梯度的形成梯度的形成載體兩性電解質(zhì)定義載體兩性電解質(zhì)定義：許多異構(gòu)體與同系物的混合物，化學(xué)本質(zhì)：許多異構(gòu)體與同系物的混合物，化學(xué)本質(zhì)是多羧基多氨基脂肪族化合物，具有連續(xù)的是多羧基多氨基脂肪族化合物，具有連續(xù)的PI值。值。在沒(méi)有電場(chǎng)時(shí)在沒(méi)有電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)溶液的載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液值大約是該溶液pH范圍范圍的平均值的平均值(如如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液的載體兩性電解質(zhì)溶液,其其

20、pH約為約為6.5左右左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負(fù)只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等電荷數(shù)目相等,凈電荷為零凈電荷為零. 引入電場(chǎng)時(shí)引入電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)分子分別載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽(yáng)極移動(dòng)向陰極和陽(yáng)極移動(dòng),最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移.pHpH梯度的形成梯度的形成 靠近陽(yáng)極端的載體兩性電解質(zhì)靠近陽(yáng)極端的載體兩性電解質(zhì),電負(fù)性最強(qiáng)電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極

21、順延一直向陰極順延; 靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì),電正性最強(qiáng)電正性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的使環(huán)境的pH等于載體兩性電解等于載體兩性電解質(zhì)的質(zhì)的pI,一直向陽(yáng)極順延。一直向陽(yáng)極順延。 在正極注入酸液如：硫酸，磷酸；負(fù)極注入堿液如在正極注入酸液如：硫酸，磷酸；負(fù)極注入堿液如NaOH，避免樣品和兩性電解質(zhì)載體在陽(yáng)極氧化，或，避免樣品和兩性電解質(zhì)載體在陽(yáng)極氧化，或在陰極還原。在陰極還原。加加 酸酸加加 堿堿pI小小大大關(guān)鍵是形成關(guān)鍵是形成pH梯度梯度pH低低高高理想的兩性電解質(zhì)載體理想的兩性電解質(zhì)載體(carrier (ca

22、rrier ampholytesampholytes) )(1)(1)易溶于水，在易溶于水，在pIpI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pHpH梯度，不梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pHpH梯度。梯度。(2)(2)在在pIpI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)。處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)。(3)(3)分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開(kāi)。分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開(kāi)。(4)(4)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變性作用，其化化學(xué)性

23、能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。 兩性電解質(zhì)載體的兩性電解質(zhì)載體的pIpI愈連續(xù)，形成的愈連續(xù)，形成的pHpH梯度愈平滑。梯度愈平滑。pHpH梯度的形成：梯度的形成：Ampholine(瑞典瑞典LKB) 它是由許多脂肪族的多氨基它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的組成的, 具有連續(xù)的氨基羧基比，具有連續(xù)的氨基羧基比，pH范圍范圍3.5-10. 分子量分子量300-1000 280 nm紫外吸收低紫外吸收低抗對(duì)流支持介質(zhì)：聚丙烯酰胺凝膠（PAGE） 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠( (polyacry

24、lamidepolyacrylamide gel) gel)是由單體丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺( (acrylamideacrylamide，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱AcrAcr) )和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑( (crosslinker)N,Ncrosslinker)N,N-甲甲叉雙丙烯酰胺叉雙丙烯酰胺(N,N-(N,N-methylenebimethylenebi sacrylamidesacrylamide，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱BisBis) )在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚

25、丙烯酰胺凝膠電泳電泳( (polyacrylamidepolyacrylamide gel gel electrophorsiselectrophorsis，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱PAGE)PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基(free radicals)的的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來(lái)完來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（成的。催化體系主要有化學(xué)催化（APTEMED）和光化學(xué)催化）和光化學(xué)催化（核黃素（核黃素TMTED）體系。

26、）體系。 單體：丙烯酰胺（單體：丙烯酰胺（Acr）；）； 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；）； 催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素；催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素； 加速劑：四甲基乙二胺（加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；）； 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠AP-TMTED催化體系：催化體系：TMTED是一種脂肪族叔胺，是一種脂肪族叔胺，TEMED催化催化AP生成硫酸自由基：生成硫酸自由基：S2O82 2SO4硫酸自由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長(zhǎng)鏈：?jiǎn)误w并形成單體長(zhǎng)鏈：影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素 試劑的純度試

27、劑的純度 溫度溫度 氧氣氧氣 APTEMED原則：盡量少的催原則：盡量少的催化劑并在最佳時(shí)間內(nèi)聚合化劑并在最佳時(shí)間內(nèi)聚合。聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)： 分辨率高，幾乎無(wú)帶電基團(tuán)，電內(nèi)滲小。分辨率高，幾乎無(wú)帶電基團(tuán)，電內(nèi)滲小。 化學(xué)惰性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，親水性好。化學(xué)惰性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，親水性好。 具有很好的光學(xué)透明度和一定的剛性。具有很好的光學(xué)透明度和一定的剛性。 抗對(duì)流和擴(kuò)散?？箤?duì)流和擴(kuò)散。 具有可控的孔徑大小。具有可控的孔徑大小。樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理鹽離子可干擾鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進(jìn)梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進(jìn)

28、行行IEF-PAGE時(shí)，樣品應(yīng)透析或用時(shí)，樣品應(yīng)透析或用Sephadex G-25脫鹽，也可脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。粒引起拖尾。為提高疏水蛋白在水中的溶解度，可添加尿素，無(wú)離子為提高疏水蛋白在水中的溶解度，可添加尿素，無(wú)離子/兩性離兩性離子去污劑。子去污劑。加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測(cè)方法的靈加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測(cè)方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍(lán)敏度。如用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，加樣量可為染色，加樣量可為50-150 g；一；一般樣品濃度以般樣品濃度

29、以0.5-3 mg/mL為宜為宜操作方法：操作方法：1. 1. 凝膠柱的制備凝膠柱的制備（1 1）玻璃管的一端）玻璃管的一端7 cm7 cm處作標(biāo)記處作標(biāo)記 用膠布封底，用膠布封底， 插入插座，垂直插入插座，垂直放置放置（2）配膠）配膠 10mL 7.5%凝膠的配制凝膠的配制試試 劑劑 名名 稱稱 體積體積(mL)凝膠貯液凝膠貯液 2.0兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)載體 0.2蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)樣品 各各0.1蒸餾水蒸餾水 7.010%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨 0.1520%TEMED 0.06（3 3）將配好的凝膠溶）將配好的凝膠溶液用細(xì)長(zhǎng)頭滴管加液用細(xì)長(zhǎng)頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，管中，至至7 cm7 cm處處，再用注射器緩緩加再用注射