結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用

1、會計學(xué)1結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用結(jié)核病的實驗室診斷技術(shù)及應(yīng)用分子診斷時代分子診斷時代DNA診斷：診斷：PCRLAMPGeneXpert基因芯片基因芯片RNA診斷：診斷：TMANASBA免疫學(xué)檢測：免疫學(xué)檢測：Ab Ag PPDT-SPOT 細(xì)菌法：細(xì)菌法：直接鏡檢直接鏡檢體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)SAT19世紀(jì)中葉世紀(jì)中葉20世紀(jì)世紀(jì)60年代年代20世紀(jì)世紀(jì)80年代年代20世紀(jì)世紀(jì)90年代年代n靈敏度低靈敏度低n檢測周期長檢測周期長n成本低成本低n交叉污染交叉污染n儀器要求復(fù)雜儀器要求復(fù)雜n反應(yīng)抑制反應(yīng)抑制n高靈敏度高靈敏度n高特異性高特異性n交叉污染少交叉污染少n血清學(xué)檢測血清學(xué)檢測WHO不推薦不

2、推薦nr-干擾素釋放實干擾素釋放實驗驗結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展歷程結(jié)核病檢測技術(shù)發(fā)展歷程不能區(qū)分真假、死活；培養(yǎng)仍是金標(biāo)準(zhǔn)但耗時長、液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)（BD MGIT960）固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)（羅氏（羅氏L-J）疑似新發(fā)患者報陽時間（d）13.637.1428.6710.04復(fù)診患者報陽時間(d)22.949.5528.5310.40疑似新發(fā)患者陽性率32.00%17.90%復(fù)診患者陽性率9.30%2.60%污染率6.57%4.0%液體培養(yǎng)在提高陽性率、縮短報陽時間上均優(yōu)于固體培養(yǎng)。吳學(xué)兵，陸彬，桂曉虹等。液體MGIT培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用評估。檢驗醫(yī)學(xué)，2013,3（28）：211-214仍

3、然不能滿足臨床快速診斷的需要WHO關(guān)于血清學(xué)檢測聲明2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（ WHO ）正式聲明，要求禁止將 血清學(xué)檢測方法 （抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。WHO warns against the use of inaccurate commercialserological tests for pulmonary and extra-pulmonaryTB.蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展 3、4、7種結(jié)核桿菌優(yōu)勢表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、 Mtb16.3）制備多靶點蛋白微陣列 大量的文獻(xiàn)報道其敏感性特異

4、性均顯著高于涂片與培養(yǎng)法 可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，提高痰涂片和痰培養(yǎng)假陰性的檢測率參考文獻(xiàn)略-干擾素釋放實驗（IGRAs)10Interferon-Gamma Release Assays 結(jié)核桿菌特異抗原：ESAT-6與CFP10由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失RD1和RD2絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌(NTM)也不存在RD1和RD2區(qū)11ESAT-6 : 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）CFP10 : 培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）12結(jié)核桿菌特異抗原：ES

5、AT-6與CFP10結(jié)核菌群結(jié)核菌群抗原抗原ESAT6CFP-10M tuberculosis+M africanum+M bovis+BCG substrain gothenburg- moreau- tice- tokyo- danish- glaxo- montreal- pasteur-抗原抗原 ESAT6CFP-10M abcessus-M avium-M branderi-M celatum-M chelonae-M fortuitum-M gordonii+Mintracellulare-+M malmoense-M marinum+M oenavense-M crofulace

6、um-M szulgai+M terrae-M vaccae-M xenopi-環(huán)境分枝桿菌環(huán)境分枝桿菌 M smegmatisM kansasii- 特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)13陰性預(yù)測值：93.9%（478/509）陽性預(yù)測值：95.4%（624/654）14用BD

7、CPT 管或Ficoll提取液收集外周血單個核細(xì)胞結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞使其分泌-干擾素效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌的-干擾素與膜板預(yù)包被的抗-干擾素抗體結(jié)合并固定在細(xì)胞周圍1個斑點=1個效應(yīng)T細(xì)胞加入顯色液，觀察結(jié)果過夜孵育，洗板，加入酶標(biāo)二抗15實驗效果圖陰性結(jié)果陰性結(jié)果陽性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照空白對照抗原抗原AESAT-6抗原抗原BCFP10陽性對照陽性對照（PHA）一個斑點一個斑點=一個結(jié)核效應(yīng)淋巴細(xì)胞一個結(jié)核效應(yīng)淋巴細(xì)胞T-SPOT結(jié)果的解讀-陽性結(jié)果 活動性結(jié)核病 典型結(jié)核中毒癥狀 影像學(xué)支持 排除其他診斷 MTB感染狀態(tài) 典型結(jié)核中毒癥狀 未

8、發(fā)現(xiàn)結(jié)核患病證據(jù) 潛伏性結(jié)核感染 無結(jié)核中毒癥狀 無其它結(jié)核患病證據(jù) 陳舊性結(jié)核 無結(jié)核中毒癥狀 既往TB史或明確TB證據(jù) NTM（四種）感染高孟秋 ，-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果的臨床意義解讀，中華結(jié)核和呼吸雜志，2014T-SPOT結(jié)果解讀-陰性結(jié)果除外結(jié)核感染 所用抗原為MTB特異性抗原 機(jī)體沒有結(jié)核特異抗原致敏的T淋巴細(xì)胞 目前未感染結(jié)核分枝桿菌假陰性：感染階段不同（窗口期）少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/基礎(chǔ)疾病的情況，如HIV感染者、腫瘤患者、嬰幼兒等特殊肺外結(jié)核：結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核靈敏度相對較低實驗非正常操作：細(xì)胞計數(shù)不夠等高孟秋 ，-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果的臨床意義解讀，中華結(jié)核和呼吸

9、雜志，2014能否療效監(jiān)測？無大量數(shù)據(jù)結(jié)果判讀：顯色目測或SYBR Green I等熒光染料臨床試驗 LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果靈敏度89.54% 陽性結(jié)果預(yù)期值98.13% 特異性98.93% 陰性結(jié)果預(yù)期值93.77% 總符合率95.31%26 Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(10): 36543660.結(jié)核 胞內(nèi) 通量：可同時檢測 16-2216-22種常見分枝桿菌速度：6 6小時小時 靈敏度： 10 103 3 CFU/ml CFU/ml可自動或肉眼判讀結(jié)果 3. 基因芯片檢測技術(shù)基因芯片檢測技術(shù)檢測全程僅需6小時

10、MSM恥垢分枝桿菌 MTC結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTR次要分枝桿菌MIN胞內(nèi)分枝桿菌MAV鳥分枝桿菌MGA胃分枝桿菌MKA堪薩斯分枝桿菌MSC瘰癘分枝桿菌MUA母牛分枝桿菌MCH龜分枝桿菌龜亞種MAB龜分枝桿菌膿腫亞種MSZ蘇爾加分枝桿菌MMA海/潰瘍分枝桿菌MXE蟾蜍分枝桿菌MDI迪氏分枝桿菌MFO偶發(fā)/豬分枝桿菌MGI淺黃分枝桿菌MSI猿猴分枝桿菌MTE土分枝桿菌MPH草分枝桿菌CC質(zhì)控點MNO不產(chǎn)色分枝桿菌MGO戈登分枝桿菌同時鑒定MTC與21種NTM 4.Xpert MTB/RIF 4.Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)檢測技術(shù) DNA用于臨床檢驗的不足用于臨床檢驗的不足“死菌檢測呈陽性死

11、菌檢測呈陽性”，與臨床相關(guān)性差不能區(qū)分“潛伏感染”“活動性感染” 易交叉污染易交叉污染 反應(yīng)易受抑制反應(yīng)易受抑制NASBA（國外）TMA（國外）SAT（國內(nèi)）（國內(nèi)）四、常見的四、常見的RNA檢測技術(shù)檢測技術(shù) SAT SAT技術(shù)是將核酸恒溫擴(kuò)增和實時熒光技術(shù)是將核酸恒溫擴(kuò)增和實時熒光 檢測相結(jié)合的一種新型檢測相結(jié)合的一種新型RNARNA檢測技術(shù)。檢測技術(shù)。 TBSAT TBSAT 檢測技術(shù)檢測技術(shù)TB-RNA釋放釋放恒溫擴(kuò)增恒溫擴(kuò)增實時檢測實時檢測超聲波（超聲波（300W）15 min痰液預(yù)處理痰液預(yù)處理42 40 min與反應(yīng)液混合與反應(yīng)液混合6010 min42 5 minTB-SATTB

12、-SAT操作流程操作流程50 l 稀釋液稀釋液全程2小時，會做PCR，就學(xué)的會SAT靈敏靈敏 檢測檢測下限下限1-101-10條菌條菌/ml/ml快速快速 4242恒溫擴(kuò)增恒溫擴(kuò)增, ,3030分分鐘內(nèi)擴(kuò)增鐘內(nèi)擴(kuò)增1010億億倍倍簡便簡便 無提無提取步驟，擴(kuò)增取步驟，擴(kuò)增結(jié)束即得出結(jié)結(jié)束即得出結(jié)果。果。特異特異 rRNA rRNA特異性非常高特異性非常高污染率低污染率低 RNARNA易降解，環(huán)易降解，環(huán)境中存在時間境中存在時間短短靈敏度高：靈敏度高：RNA DNA拷貝數(shù)與臨床相關(guān)性好與臨床相關(guān)性好：區(qū)分“死活菌”： 減少抗生素濫用減少抗生素濫用可以診斷可以診斷“活動性感染活動性感染”： 活動性

13、感染：活動性感染：RNA轉(zhuǎn)錄活躍轉(zhuǎn)錄活躍 潛伏感染：潛伏感染：RNA不轉(zhuǎn)錄不轉(zhuǎn)錄不易污染不易污染：靶標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物都是RNA結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）：人型結(jié)核分枝桿菌牛型結(jié)核分枝桿菌非洲型結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以區(qū)分如下NTM：堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌、戈登分枝桿菌、海分枝桿菌等18種Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Comple

14、x J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.VIVIAN JONAS,et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Sept.1993, p.2410-2416CLAUDIO PIERSIMONI, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.1997, p.193196.GABRIELLE M. E. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1994, p. 1959-1965 免疫法常有既

15、往感染問題SATSAT更有利于治愈判斷更有利于治愈判斷窗口期時間示意相對濃度示意抗體RNADNA病原體感染前后各檢測靶標(biāo)的含量變化死菌的RNA快速降解，有助治愈判斷用藥治療DNA需要一段時間降解RNA快速降解相比相比DNA,RNADNA,RNA檢測能更好的體現(xiàn)療效檢測能更好的體現(xiàn)療效服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度變化，相比DNA,RNA與藥物濃度變化的符合率更高，RNA檢測能更好的進(jìn)行療效評估。GABRIELLE M. E. Assessment of Mycobacterial Viability by RNA Amplification. ANTIMICROBI

16、AL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 1994, p. 1959-1965 DNARNASAT與培養(yǎng)的監(jiān)測結(jié)果一致，與培養(yǎng)的監(jiān)測結(jié)果一致，可應(yīng)用于療效評估可應(yīng)用于療效評估監(jiān)測項目監(jiān)測項目 陽性患者數(shù)（陽性患者數(shù)（%）0月0.5月1月2月4月6月集菌涂片150（100.0） 53（35.3） 20（13.3） 9（6.0）4（2.7） 6（4.0）羅氏培養(yǎng)150（100.0） 83（55.3） 32（21.3） 16（10.7） 12（8.0） 12（8.0）TB-PCR148（98.7）84（56.0） 47（31.3） 20（13.3） 12（8.0） 13（8

17、.7）SAT法150（100.0） 86（57.3） 35（23.3） 16（10.7） 12（8.0） 12（8.0）胡永領(lǐng)，劉成永，成松. 應(yīng)用RNA恒溫擴(kuò)增實時熒光檢測技術(shù)觀察抗結(jié)核藥物的療效. 海峽藥學(xué),2015年第27卷第1期SAT在抗結(jié)核治療藥物效果檢測方面，雖不能直接作出藥物敏感試驗，但可以最在抗結(jié)核治療藥物效果檢測方面，雖不能直接作出藥物敏感試驗，但可以最快地直接判斷所用藥物的療效，及時調(diào)整藥物使用，可大大降低醫(yī)療成本和耐藥快地直接判斷所用藥物的療效，及時調(diào)整藥物使用，可大大降低醫(yī)療成本和耐藥產(chǎn)生的機(jī)會，大幅度減少醫(yī)療時間和費用。產(chǎn)生的機(jī)會，大幅度減少醫(yī)療時間和費用。TB-SA

18、T檢測體液、病灶組織標(biāo)本的靈敏度檢測體液、病灶組織標(biāo)本的靈敏度蔡杏珊, 馬品云, 張院良，譚耀駒 中國防癆雜志, 2014,36(6): 458-461結(jié)核病診斷專家組：莊玉輝、萬利亞潘毓瑄、成詩明趙雁林、王國治吳雪瓊、萬康林周林、許衛(wèi)國居金良、胡忠義專家共識：TB-SATTB-SAT顯著提高結(jié)核分枝桿菌顯著提高結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率，對早期發(fā)現(xiàn)傳的陽性檢出率，對早期發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核患者，控制結(jié)核病染性肺結(jié)核患者，控制結(jié)核病傳染源有極其重要的意義傳染源有極其重要的意義中國防癆協(xié)會，2012年6月胡忠義. 實驗結(jié)核病學(xué). 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社. 2014.趙雁林. 結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程. 中國防

19、癆協(xié)會. 201547 固液體培養(yǎng)（時間、生物安全等）分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用使快速檢測耐藥成為可能MDR、XDR的出現(xiàn)對結(jié)核病的防控提出了嚴(yán)峻的考驗48檢測已知的突變位點耐藥分子診斷檢測的靈敏度：103CFU/ml結(jié)核病耐藥與基因64-68% rps L 基因突變70% emb B基因突變70%65%耐藥基因93%95%95% rpo B基因突變利福平異煙肼50-70% kat G基因突變5-10% inh A基因突變6-13% ahp C基因啟動子區(qū)域突變鏈霉素乙胺丁醇 多數(shù)研究報告提示：耐藥的發(fā)生與結(jié)核桿菌的基因突變有關(guān)?？傮w上是基因一個或幾個核苷酸突變（表現(xiàn)增加、缺失、替代），造成核苷酸編碼錯誤致氨基酸錯位排列，影響藥物與靶位酶結(jié)合產(chǎn)生耐藥5051核心基因芯片技術(shù)生物素生物素鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物TMBH2O2:耐藥突變基因鑒定同時鑒定4種一線藥物5個基因13個位點N1N2N3N4N5315N-15NCCD516VD516GH526YH526DS531LS531W315M-15M43N88N306N43M88M306M1306M2306M3抗結(jié)核藥耐藥基因 野生位點突變位點利福平rpo BN1、N2、