分子生物學(xué)：第十五章 代謝組中的生物小分子

1、第十五章 代謝組中的生物小分子第一節(jié) 代謝組學(xué)的概念代謝物組代謝物組（metabolome）指生物體內(nèi)或一個細(xì)胞、組織或器官中,所有小分子代謝物的組合，是生物體的特定部分在特定環(huán)境中，經(jīng)基因組表達(dá)和新陳代謝產(chǎn)生的中介物及終產(chǎn)物，是在某一時刻細(xì)胞內(nèi)所有代謝物的集合。其主要研究體系有生物體液、生物組織及單個細(xì)胞的代謝組。 代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics） 代謝組學(xué)是一門“在新陳代謝的動態(tài)進(jìn)程中,系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,揭示機(jī)體生命活動代謝本質(zhì)”的科學(xué)。它所關(guān)注的是相對分子質(zhì)量為1,000以下的小分子。它是通過考察生物體系受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境

2、變化后）其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的代謝途徑的一種方法。是研究生物體系(細(xì)胞,組織或生物體) 受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物的變化的科學(xué)。 第二節(jié) 代謝組學(xué)與其他組學(xué)的聯(lián)系及比較 各種組學(xué)的迅速發(fā)展催生了一門新的學(xué)科系統(tǒng)生物學(xué),系統(tǒng)生物學(xué)的研究內(nèi)容涵蓋基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。 與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)比較,代謝組學(xué)還具有以下優(yōu)點: （1） 基因和蛋白表達(dá)的有效的微小變化，會在代謝物上得到放大,從而使檢測更容易；（2） 代謝組學(xué)的技術(shù)不需建立全基因組測序，及大量表達(dá)序列標(biāo)簽( EST) 的數(shù)據(jù)庫；（3） 代謝物的種類要遠(yuǎn)小于基因和蛋白的數(shù)目。每個生物體(org

3、anism)中代謝產(chǎn)物大約在103 數(shù)量級,而最小的細(xì)菌,其基因組中也有幾千個基因；（4） 因為給定的代謝物在每個組織中都是一樣的緣故，代謝產(chǎn)物在各個生物體系中都是類似的,所以代謝組學(xué)研究中采用的技術(shù)更通用。（5）基因組學(xué)研究的是生物體在一定的病理生理條件下,基因表達(dá)譜的改變。但“沉默基因”及基因之間的互相調(diào)控,使得基因的“開”、“關(guān)”與生物學(xué)效應(yīng)并無直接聯(lián)系。而且不能與生物體作用的靶位點直接聯(lián)系。（6）蛋白質(zhì)組學(xué)主要是針對細(xì)胞蛋白質(zhì)的變化,進(jìn)行半定量測定。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者,研究它可以很大程度地揭示病理生理機(jī)制,發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志。但蛋白質(zhì)組學(xué)也存在信號通路蛋白相互影響,靶位點難以定位

4、等缺點,而且不能動態(tài)、實時的反映整體信息。（7）代謝組學(xué)關(guān)注的是各種代謝路徑底物和產(chǎn)物的小分子代謝物(MW 1KD) ,反映細(xì)胞或組織在外界刺激或是遺傳修飾下代謝應(yīng)答的變化,包括糖、脂質(zhì)、氨基酸、維生素等。特別是基于NMR 技術(shù)的研究方法,并不需要進(jìn)行樣品的提取、純化,可以無損傷地監(jiān)測組織代謝表達(dá)譜的改變,動態(tài)地評估代謝信息。并在此基礎(chǔ)上,定位相應(yīng)的靶組織、作用過程以及生物學(xué)標(biāo)志 代謝組學(xué)與基因調(diào)控相關(guān)的“-組學(xué)”的關(guān)系 第三節(jié) 代謝組學(xué)研究方法代謝組學(xué)研究的技術(shù)平臺包括以下幾個部分:（1）樣品制備（2）代謝產(chǎn)物檢測、分析與鑒定（3）數(shù)據(jù)分析與模型建立。 （1）代謝組學(xué)研究常用的檢測技術(shù),一般

5、不需要對標(biāo)本行特別的分離、純化等。但離體條件下,細(xì)胞或組織內(nèi)的代謝狀態(tài)可迅速改變,代謝物的質(zhì)與量亦隨之變化,為正確反映在體的真實信息,須立即阻斷內(nèi)在酶的活性。最為常用的是冰凍/液氮降溫法及冷凍、干燥的保存技術(shù),盡管如此,細(xì)胞間仍始終有一低水平的代謝活動,需盡量避免氧化等活化因素。 （2）代謝產(chǎn)物的檢測、分析與鑒定是代謝組學(xué)技術(shù)的核心部分,最常用的是NMR 及質(zhì)譜(MS)兩種技術(shù)。 3）代謝組學(xué)研究，需借助于生物信息學(xué)平臺。它往往借助于一定的軟件,聯(lián)合多種數(shù)據(jù)分析技術(shù),將多維、分散的數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)、分類及判別分析,發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)間的定性、定量關(guān)系,解讀數(shù)據(jù)中蘊藏的生物學(xué)意義,闡述其與機(jī)體代謝的關(guān)系。如果

6、說分析技術(shù)在我們面前打開了“一扇門”,正確的數(shù)據(jù)分析方法和模型建立便是“找到寶藏”的鑰匙。主成分分析法( PCA) 是最常用的分析方法。最終是模型建立部分。 代謝組學(xué)分析層次 與其它組學(xué)不同,代謝組學(xué)關(guān)注的對象是分子量1000 以下的小分子化合物。根據(jù)研究的對象和目的不同,Oliver Fiehn把生物體系的代謝產(chǎn)物分析分為四個層次:（1) 代謝物靶標(biāo) (Metabolite target)分析:（2) 代謝輪廓(譜) 分析(metabolic profiling analysis) （3) 代謝組學(xué)(metabonomics) （4) 代謝指紋分析(metabolic fingerprint

7、ing analysis) （1) 代謝物靶標(biāo) (Metabolite target)分析: 某個或某幾個特定組分的分析，在這個層次中, 需要采取一定的預(yù)處理技術(shù), 除掉干擾物, 以提高檢測的靈敏度。（2) 代謝輪廓(譜) 分析(metabolic profiling analysis) : 對少數(shù)所預(yù)設(shè)的一些代謝產(chǎn)物的定量分析。如某一類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相關(guān)的化合物(如氨基酸、順二醇類) 、某一代謝途徑的所有中間產(chǎn)物或多條代謝途徑的標(biāo)志性組分。進(jìn)行代謝輪廓(譜) 分析時, 可以充分利用這一類化合物的特有的化學(xué)性質(zhì), 在樣品的預(yù)處理和檢測過程中,采用特定的技術(shù)來完成。3) 代謝組學(xué)(metabonom

8、ics) : 對限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量。進(jìn)行代謝組學(xué)研究時, 樣品的預(yù)處理和檢測技術(shù)必須滿足對所有的代謝組分具有高靈敏度、高選擇性、高通量的要求,而且基體干擾要小。代謝組學(xué)涉及的數(shù)據(jù)量非常大 ,因此需要有能對其數(shù)據(jù)進(jìn)行解析的化學(xué)計量學(xué)技術(shù)。（4) 代謝指紋分析(metabolic fingerprinting analysis) : 不分離鑒定具體單一組分, 而是對樣品進(jìn)行快速分類(如表型的快速鑒定) 。代謝組學(xué)分析樣品的采集和預(yù)處理 樣品制備：生物代謝物樣品制備分為組織取樣、勻漿、抽提、保存和樣品預(yù)處理等步驟。 目前還沒有適合所有代謝物的抽提方法，通常只能根據(jù)所要

9、分析的代謝物特性及使用的鑒定手段選擇合適的提取方法 常用儀器分析技術(shù) 化學(xué)分析技術(shù)中最常用的主要技術(shù)手段的是1H核磁共振（1H -NMR），質(zhì)譜（MS），色譜（HPLC，GC），以及色譜（毛細(xì)管電泳）-質(zhì)譜聯(lián)用（X-MS）。其中以NMR為主。色譜、質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜、庫侖分析、紫外吸收、熒光散射、發(fā)射性檢測、光散射等分離分析手段及其組合都出現(xiàn)在代謝組學(xué)的研究中。其中,色譜以其高分離度、高通量,質(zhì)譜以其普適性、高靈敏度和特異性,核磁共振技術(shù)特別是H1-NMR 以其對含氫代謝產(chǎn)物的普適性而成為最主要的分析工具。由于液-質(zhì)聯(lián)用(LC/MS) 和氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)，以及傅里葉變換紅外光譜與質(zhì)

10、譜聯(lián)用 (FTIR/MS)，能分析范圍很廣的代謝組分,因此也成為代謝組學(xué)研究分析中的很重要的工具。一般根據(jù)樣品的特性和實驗?zāi)康?，可選擇最合適的分析方法。 代謝組學(xué)中的NMR方法 核磁共振技術(shù)是利用高磁場中原子核對射頻輻射的吸收光譜，鑒定化合物結(jié)構(gòu)的分析技術(shù),生命科學(xué)領(lǐng)域中常用的是氫譜(1H NMR ) 、碳譜(13 CNMR)及磷譜(31 P NMR)三種。 NMR 方法有如下特點: (1) 無損傷性,不破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),無輻射損傷；(2) 可在一定的溫度和緩沖液范圍內(nèi)選擇實驗條件,能夠在接近生理條件下進(jìn)行實驗；(3) 可研究化學(xué)交換、擴(kuò)散及內(nèi)部運動等動力學(xué)過程,給出極其豐富的有關(guān)動態(tài)特性

11、的信息；(4) 可設(shè)計多種編輯手段,實驗方法靈活多樣。 (5)圖譜中包含了成百上千個化合物的譜峰，一張譜圖可包含數(shù)百種有關(guān)疾病和中毒等過程的信息 小鼠尿樣的核磁共振氫譜 質(zhì)譜技術(shù) 質(zhì)譜技術(shù)是將離子化的原子、分子或是分子碎片按質(zhì)量，或是質(zhì)荷比(m / e)大小順序排列成圖譜,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行各種無機(jī)物、有機(jī)物的定性或定量分析。新的離子化技術(shù)則使質(zhì)譜技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確度均有很大程度的提高。 色譜及其聯(lián)用技術(shù) LC/MS 中目前應(yīng)用較廣的是高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 (HPLC/MS)。HPLC 與 GC 原理相似，但在進(jìn)樣前不需進(jìn)行衍生化處理，適合那些不穩(wěn)定、不易衍生化、不易揮發(fā)和分子量較大的化合物

12、。HPLC/MS 選擇性和靈敏度都較好，但分析的時間相對較長，且需依賴純的參照物。 傅里葉變換紅外光譜與質(zhì)譜聯(lián)用 傅里葉變換紅外光譜質(zhì)譜聯(lián)用（FTIR/MS）最近也被應(yīng)用于植物代謝組學(xué)分析。FTIR 主要測定樣品中各成分的功能基團(tuán)和高極性鍵的振動，而特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)有特定的吸收頻率，通過測定實驗樣品的紅外吸收頻率和強(qiáng)度，可以辨別出各個成分。FTIR 具有掃描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比及測定光譜范圍寬的特點；缺點在于不可區(qū)分異構(gòu)物，且組分片段和一些絡(luò)合離子也對其有影響， 常用數(shù)據(jù)分析技術(shù) 目前,模式識別技術(shù)已在代謝組學(xué)中具有十分重要的作用。模式識別是一種借助大量信息和經(jīng)驗進(jìn)行推理的方法,

13、通?？蛇M(jìn)一步分為二類, 即指導(dǎo)性模式識別( supervised pattern recognition) 和非指導(dǎo)性模式識別( unsupervised pattern recognition) 。 歸一化與濾噪 在得到分析對象的原始譜圖后,首先需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理(一般包括歸一化和濾噪) ,處理后保留與分類有關(guān)的大部分信息,消除多余的干擾因素的影響。廣泛應(yīng)用的濾噪技術(shù)是正交信號校正技術(shù)(orthogonal signal correction , OSC) 。與普通的譜圖濾噪技術(shù)不同,OSC 濾掉與類別判斷正交(不相關(guān)) 的變量信息,只保留與類別判斷有關(guān)的變量, 從而使類別判別分析能集中在

14、這些與類別的判別相關(guān)的變量上,提高了判別的準(zhǔn)確性。OSC 等效于從數(shù)據(jù)中去除了額外的影響因素,因此該方法經(jīng)常用于易受環(huán)境因素影響的分析,例如在微量藥物引發(fā)的生化效應(yīng)中,分析結(jié)果經(jīng)常被研究對象的性別、飲食和其他環(huán)境因素所淹沒,在這種情形下,應(yīng)用OSC能收到較好的效果。非監(jiān)督(un-supervised) 學(xué)習(xí)方法 非監(jiān)督方法是用來探索完全未知的數(shù)據(jù)特征的方法，對原始數(shù)據(jù)信息依據(jù)樣本特性進(jìn)行歸類，把具有相似特征的目標(biāo)數(shù)據(jù)歸在同源的類里，并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來。應(yīng)用在此領(lǐng)域的常見方法有聚類分析 (cluster analysis) 和主成分分析 (principal component

15、s analysis，PCA) 等。這類方法用于從原始譜圖信息或預(yù)處理后的信息中對樣本進(jìn)行歸類,并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀的表達(dá)出來。該方法將得到的分類信息和這些樣本的原始信息(如藥物的作用位點或疾病的種類等)進(jìn)行比較,建立代謝產(chǎn)物與這些原始信息的聯(lián)系,篩選與原始信息相關(guān)的標(biāo)記物,進(jìn)而考察其中的代謝途徑。用于這個目的的方法沒有可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本,所以稱為非監(jiān)督(無師) 學(xué)習(xí)方法。應(yīng)用在此領(lǐng)域的方法有: 主成分分析(principal components analysis , PCA) 、非線性映射( nonlinear mapping ,NLM) 、簇類分析(hierarchical c

16、luster analysis ,HCA)等。聚類分析 聚類分析依據(jù)物以類聚的原理分析具有相似性的事物，將分類對象置于一個多維空間中，根據(jù)事物彼此不同的屬性進(jìn)行辨認(rèn)，將性質(zhì)相近的歸入一類，這樣歸在同一類的事物具有高度的相似性；聚類分析就是把事物按其相似程度進(jìn)行分類，并找出每一類事物共同特征的分析工具。具體到代謝組學(xué)中，被歸入一類的物質(zhì)有相同的特征，可能有相同的功能作用，這樣通過同一類事物中一個研究較為清晰的物質(zhì)可以推斷該類中其他物質(zhì)的功能作用。聚類分析過程通?？煞譃橐韵虏襟E：數(shù)據(jù)收集并且收集相應(yīng)的變量；產(chǎn)生一個相似矩陣；決定把目標(biāo)總體細(xì)分為幾類，及其對每一種類別相應(yīng)的定義；實施聚類分析，產(chǎn)生結(jié)

17、果。 主成分分析 目前在代謝組學(xué)的研究中, 代謝組數(shù)據(jù)處理最常用也是最有效的方法是，應(yīng)用主成分分析(principal component analysis ,PCA)等，將從原始圖譜信息或預(yù)處理后的信息進(jìn)行歸類，并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來（圖3）；建立類別間的數(shù)學(xué)模型，使各類樣品間達(dá)到最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對未知的樣本進(jìn)行預(yù)測；最終建立可利用的該領(lǐng)域的應(yīng)用數(shù)據(jù)庫和專家系統(tǒng)。PCA 的特點是將分散在一組變量上的信息集中到幾個綜合指標(biāo)即主成分(principal component ,PC) 上 代謝主成分( PCA)分析示意圖 有監(jiān)督(supervised )學(xué)習(xí)方法如果

18、存在一些有關(guān)數(shù)據(jù)的先驗消息和假設(shè)，有監(jiān)督方法比非監(jiān)督方法更適合且更有效。有監(jiān)督方法在已有知識的基礎(chǔ)上建立信息組 (class information)，并利用所建立的組對未知數(shù)據(jù)進(jìn)行辨識、歸類和預(yù)測。在這類方法中，由于建立模型時有可供學(xué)習(xí)利用的訓(xùn)練樣本，所以稱為有監(jiān)督學(xué)習(xí)。有監(jiān)督方法這類方法用于建立類別間的數(shù)學(xué)模型,使各類樣品間達(dá)到最大的分離,并利用建立的多參數(shù)模型對未知的樣本進(jìn)行預(yù)測。 第四節(jié) 代謝組學(xué)在藥物研究中的意義應(yīng)用代謝組學(xué)可進(jìn)行疾病診斷、對藥物進(jìn)行毒性評價和研究中藥植物細(xì)胞代謝等，以及功能基因組的研究。隨著研究的深入，代謝組學(xué)方法將逐步應(yīng)用于藥物毒理篩選過程，對藥物的研發(fā)和安全使用起到更大的作用。NMR 與模式識別技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,以及與毒理基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合,代謝組學(xué)可以從基因型到表型完整地評價藥物的毒性。代謝組學(xué)技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于新藥研制從早期發(fā)現(xiàn)到臨床開發(fā)的全過程。發(fā)現(xiàn)階段,它包括早期動物毒性試驗、先導(dǎo)化合物的選擇和優(yōu)化以及動物模型的有效性篩選。在開發(fā)階段,代謝組學(xué)的應(yīng)用包括發(fā)現(xiàn)新的臨床前安全性生物標(biāo)志物、探討作用機(jī)制、確定代謝類型和人類疾病動物模型的認(rèn)證，以及發(fā)現(xiàn)新的