EBV抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑

1、1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院朱振宇教授、醫(yī)學(xué)博士、博士生導(dǎo)師中山大學(xué)達(dá)安基因股份首席科學(xué)家2l鼻咽癌（NPC）是來(lái)源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的低分化或未分化癌。本病可見于世界各地，但NPC有明顯的種族傾向，大部分患者是中國(guó)人及其后裔，在愛(ài)斯基摩人、北非洲人和馬來(lái)人中也較常見。 l 病人的腫瘤細(xì)胞中有規(guī)律地隱匿著潛伏狀態(tài)的EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）。3l 發(fā)現(xiàn)l EB病毒是1964年Epstein與Barr在非洲兒童惡性淋巴瘤的瘤細(xì)胞中觀察到的一種皰疹病毒。l 1966年Old等采用免疫擴(kuò)散法發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人的血清能與非洲兒童淋巴細(xì)胞的抽提液起反應(yīng)。4l 證據(jù)（1）： l 1969

2、年de-the從鼻咽癌活檢培養(yǎng)的類淋巴細(xì)胞中分離出EB病毒。l 國(guó)內(nèi)也已經(jīng)從鼻咽癌組織培養(yǎng)所建立的類淋巴母細(xì)胞株中證明帶有EB病毒殼抗原（VCA）和早期抗原（EA），并在電鏡下找到了典型的皰疹病毒顆粒，其形態(tài)與EB病毒相同。 5 證據(jù)（2）： Kottaridis SD等（1996年）認(rèn)為鼻咽癌患者血清中抗EBNA的水平反映腫瘤的大小 。Anticancer Res,1996,16(2):785-789 Vera-Sempere FJ等（1996年）采用巢式PCR和免疫組化分析說(shuō)明了不論組織學(xué)類型，鼻咽癌中均有EB病毒感染。 Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B

3、(3):163-168 6l 在我國(guó)，幾乎所有四歲以上的人群均已感染過(guò)EBV，80%以上的健康成人是EBV攜帶者。特別在珠江三角洲及香港地區(qū)，是世界上NPC的高發(fā)區(qū)。l 根據(jù)中山市的腫瘤統(tǒng)計(jì)資料（流行病學(xué) ），NPC的年齡和性別的校正發(fā)病率為18.12/10萬(wàn) (男：25.60 /10萬(wàn)；女：11.05/10萬(wàn))。97%的NPC為非角化性癌。經(jīng)EBER1原位雜交（所謂“金標(biāo)準(zhǔn)” ）證實(shí)癌細(xì)胞中有EBV感染。78 NPC的顯著特征是病人血清中對(duì)EB病毒各種抗原的抗體（尤其是IgA亞型）水平普遍升高，借此可區(qū)分NPC與健康攜帶者。（ Werner Henle et al., 1976. ） 中國(guó)醫(yī)

4、學(xué)科學(xué)院等單位采用間接免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血清中IgA/VCA的陽(yáng)性率為90.14，幾何平均滴度為1:15.3,而其它癌瘤和健康攜帶者血清中IgA/VCA的陽(yáng)性率為2.61%-3.30% ，幾何平均滴度為1:1.3。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人放療后，其IgA抗體水平隨存活時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，在放療后 422年者僅39.29為陽(yáng)性；但當(dāng)病者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)，陽(yáng)性率又再次升至85.75。9l 小結(jié)：小結(jié)：流行病學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)的資料證實(shí), EBV感染與NPC有密切關(guān)系。l 鼻咽癌患者癌細(xì)胞中證實(shí)有EB病毒的DNA，經(jīng)原位雜交，多數(shù)癌細(xì)胞呈EBERs陽(yáng)性、核抗原（EBNA-1）陽(yáng)性。l

5、鼻咽癌患者腫瘤細(xì)胞中有EB病毒，血清有一套抗EB病毒的抗體，血清中的EBV抗體水平普遍升高。 l 1997年世界衛(wèi)生組織在國(guó)際抗癌聯(lián)盟年會(huì)上把EBV歸類為第一類致癌物（特別是鼻咽癌） 。10l EBV血清學(xué)診斷利用NPC的一個(gè)特征，即患者多種EBV抗體的水平較非患者高（Werner Henle et al.,1976.）。l EBV血清學(xué)診斷已用于NPC高危人群的篩查和對(duì)NPC可疑病例的診斷。根據(jù)從70年代后期以來(lái)的研究結(jié)果，VCA-IgA檢測(cè)通常被用于篩查以排除NPC的診斷 ；EA-IgA檢測(cè)目前被用于NPC的確定性檢測(cè)。 11l檢測(cè)哪種抗體？l檢測(cè)抗體哪種類型？l 因?yàn)楸茄拾∟PC）是來(lái)

6、源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的低分化或未分化癌。 所以我們可以先了解EB病毒在上皮細(xì)胞中的潛伏感染以及兩種形式的EB病毒感染所表達(dá)的各種抗原。l 各種抗原相應(yīng)產(chǎn)生不同的特異性抗體中哪種有代表性？12 上皮細(xì)胞中病毒復(fù)制循環(huán)中的B淋巴細(xì)胞池 長(zhǎng)期潛伏感染 如果感染了無(wú)復(fù)制缺陷突變的病毒 EB病毒感染口咽上皮細(xì)胞 如果感染了復(fù)制缺陷突變的病毒 待上皮細(xì)胞增生后個(gè)別細(xì)胞死亡EB病毒引自: J Immmunol. 2005; 17498:4972-813潛伏性感染潛伏性感染(latent infection)I型潛伏性感染: 表達(dá)EBNA1，病征為 Burkitt 淋巴瘤II型潛伏性感染:表達(dá)EBNA1和LM

7、P1、LMP2A、LMP2B，病征為Hodgkin 淋巴瘤、鼻咽癌、鼻型 NK/T-細(xì)胞淋巴瘤、 T-細(xì)胞淋巴瘤III型潛伏性感染:表達(dá)EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、 EBNA6，病征為傳染性單核細(xì)胞增多癥、移植后淋巴 組織增生性疾病溶解性感染溶解性感染(lytic infection) 在EBV潛伏感染的淋巴細(xì)胞中有小部分（約15%20%）出現(xiàn)溶解性感染，溶解性感染出現(xiàn)三個(gè)時(shí)相（phase）。 立即早期: 表達(dá)Zta(ZEBRA)、EBNA1等 早期: 表達(dá)EA(D)、EA (R) 、 EBNA1等 晚期: 表達(dá)VCA、EBNA1等EBNA-1 是在所有不同EB

8、V感染細(xì)胞中都出現(xiàn)的唯一抗原。14l遵循免疫學(xué)抗體產(chǎn)生的基本原則遵循免疫學(xué)抗體產(chǎn)生的基本原則l IgGl IgMl IgA是上皮細(xì)胞的分泌型抗體l IgDl IgE15檢測(cè)對(duì)象 例數(shù) EBNA1/IgA（rOD） 中位數(shù) 范圍 鼻咽癌 121 2.6 0.47.5患者 健康 332 0.5 0.23.9攜帶者16EBNA1-IgA檢測(cè)的檢測(cè)的OD值范圍分布圖值范圍分布圖05101520253035-(0.8-0.7)-(0.6-0.5)-(0.4-0.3)-(0.2-0.1)0-0.10.2-0.30.4-0.50.6-0.70.8-0.9OD Range% Normal%NPCCutoff

9、OD?17lNPC主要表現(xiàn)是EBV潛伏感染伴少量溶解性感染。 EBNA-1 是在所有不同EBV感染細(xì)胞中都出現(xiàn)的唯一抗原。lNPC是來(lái)源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞，檢測(cè)上皮細(xì)胞的分泌型IgA抗體水平對(duì)NPC較有診斷意義。l NPC的顯著特征是病人血清中的EBV抗體（尤其是IgA亞型）水平普遍升高，這種變化在NPC發(fā)病前期將先于癥狀出現(xiàn)，借此可區(qū)分NPC與其它EB病毒感染相關(guān)疾病或健康攜帶者。l我們認(rèn)為EBNA1/IgA抗體水平的檢測(cè)對(duì)NPC高危人群的篩查可作為早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌的有效手段之一。18NPC是來(lái)源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤，組織病理學(xué)檢查是確診NPC的唯一方法。 NPC的早期癥狀是非特異

10、的，EBV血清學(xué)體外診斷最常用于診斷程序的初期及NPC高危人群的篩查。 NPC的顯著特征是病人血清中的EBV多種抗體水平普遍升高，因此一種抗體的檢測(cè)有一定的局限性。本品的設(shè)計(jì)應(yīng)用ELISA技術(shù) ，采用了高度純化的EBNA 1的抗原 ，它的抗體水平在鼻咽癌和非鼻咽癌患者之間的差異，大于那些不是由腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的抗原的特異性抗體。同時(shí)每個(gè)試劑盒中加入了一份定值參考對(duì)照，在每次的檢測(cè)中與測(cè)試樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，使抗體的水平以標(biāo)準(zhǔn)的rOD單位來(lái)表示 ，這樣可以減少實(shí)驗(yàn)之間和實(shí)驗(yàn)室之間的誤差，從而可以直接地比較不同的實(shí)驗(yàn)室在不同的時(shí)間所獨(dú)立得出的檢測(cè)結(jié)果。 19 用途 本品適用于疑似鼻咽癌病人的血清學(xué)檢測(cè)

11、，檢測(cè)結(jié)果有助于臨床醫(yī)生作出排除或進(jìn)一步確認(rèn) NPC 的診斷。 主要可用于高危人群的篩查。局限性 本品并非本品并非NPC診斷的確診試劑，診斷的確診試劑，只有組織只有組織病理學(xué)檢查能確診病理學(xué)檢查能確診NPC。 檢測(cè)結(jié)果只提供了額外的信息，以指導(dǎo)對(duì)疑似NPC病例的診斷。同時(shí)對(duì)健康人群來(lái)說(shuō)，檢測(cè)結(jié)果可能反映可能反映NPC的風(fēng)險(xiǎn)程度。的風(fēng)險(xiǎn)程度。 20l推薦使用的診斷參數(shù)及其臨床意義：推薦使用的診斷參數(shù)及其臨床意義：當(dāng)疑似鼻咽癌癥狀的病人首次到?？崎T診就診時(shí)，血清當(dāng)疑似鼻咽癌癥狀的病人首次到?？崎T診就診時(shí)，血清學(xué)診斷可作初步篩選，學(xué)診斷可作初步篩選，此時(shí)敏感性為主要的診斷參數(shù)此時(shí)敏感性為主要的診斷參

12、數(shù)。其目的是評(píng)估病人被診斷為鼻咽癌的可能性大小。其目的是評(píng)估病人被診斷為鼻咽癌的可能性大小。推薦推薦使用當(dāng)使用當(dāng) rOD值低于值低于0.700時(shí)，可判定為陰性（此時(shí)敏感性時(shí)，可判定為陰性（此時(shí)敏感性大于大于94.1%），支持排除），支持排除NPC，但應(yīng)建議病人定期復(fù)查；，但應(yīng)建議病人定期復(fù)查；當(dāng)普查時(shí)，絕大部分人均非鼻咽癌患者，因此特異性為當(dāng)普查時(shí)，絕大部分人均非鼻咽癌患者，因此特異性為主要的診斷參數(shù)。推薦使用當(dāng)主要的診斷參數(shù)。推薦使用當(dāng) rOD值高于值高于1.500時(shí)，可判時(shí)，可判定為陽(yáng)性（此時(shí)特異性大于定為陽(yáng)性（此時(shí)特異性大于94.4%），即高度懷疑病人患），即高度懷疑病人患有有NPC，應(yīng)

13、繼續(xù)進(jìn)行組織學(xué)檢查以確診。，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行組織學(xué)檢查以確診。當(dāng)當(dāng)rOD值在值在0.700至至1.500之間時(shí)，判定為可疑之間時(shí)，判定為可疑NPC（此時(shí)（此時(shí)敏感性和特異性在敏感性和特異性在70%95%之間），須結(jié)合臨床作進(jìn)一之間），須結(jié)合臨床作進(jìn)一步檢查和隨訪，必要時(shí)進(jìn)行組織學(xué)檢查。步檢查和隨訪，必要時(shí)進(jìn)行組織學(xué)檢查。 21l 相對(duì)抗體水平與罹患相對(duì)抗體水平與罹患NPC的關(guān)系的關(guān)系 ：l 對(duì)1402例1998年以來(lái)在NPC高發(fā)區(qū)普通門診和耳鼻喉科就診病人的血清進(jìn)行檢測(cè)，其相對(duì)抗體水平（rOD）與罹患NPC的關(guān)系見下表。1402例病人中有321例經(jīng)組織學(xué)檢查確診為NPC，其他1081例臨床經(jīng)多種血清

14、學(xué)方法或組織學(xué)方法檢查，結(jié)合臨床觀察，不能確診為NPC，應(yīng)考慮排除NPC。22rOD % 敏感性敏感性 % 特異性特異性 陽(yáng)性試驗(yàn)似然陽(yáng)性試驗(yàn)似然比（比（LR） 0.200 99.7 (320/321) 8.0 (86/1081) 1.1 0.400 98.1 (315/321) 38.6 (417/1081) 1.6 0.600 94.7 (304/321) 62.6 (677/1081) 2.5 0.700 94.1 (302/321) 70.1 (758/1081) 3.1 0.800 90.0 (289/321) 76.3 (825/1081) 3.8 1.000 85.0 (273/

15、321) 84.4 (912/1081) 5.4 1.300 76.0 (244/321) 91.5 (989/1081) 8.9 1.500 69.2 (222/321) 94.4 (1021/1081) 12.5 1.600 63.6 (204/321) 95.9 (1037/1081) 15.6 1.800 57.9 (186/321) 97.4 (1053/1081) 22.4 2.000 47.7 (153/321) 98.1 (1061/1081) 25.8 注：陽(yáng)性試驗(yàn)似然比（LR）= 敏感性 ( 1特異性 ) 23EBNA1-IgA01020304050607080901000

16、1234特異度 controls敏感度 NPClrOD值l百分比24 三個(gè)醫(yī)療單位的非鼻咽癌個(gè)體的抗體水平相似，并且明顯低于鼻咽癌患者的抗體水平。詳見下表 鼻咽癌患者抗體鼻咽癌患者抗體中位數(shù)水平中位數(shù)水平 非鼻咽癌個(gè)體抗非鼻咽癌個(gè)體抗體體中位數(shù)水平中位數(shù)水平 瑪麗醫(yī)院瑪麗醫(yī)院 2.1 rOD 2.1 rOD 0.56 rOD 0.56 rOD 東莞市人民醫(yī)院東莞市人民醫(yī)院 1.8 rOD 1.8 rOD 0.67 rOD 0.67 rOD 中山市腫瘤研究所中山市腫瘤研究所 1.9 rOD 1.9 rOD 0.63 rOD 0.63 rOD 綜合綜合 1.9 rOD 1.9 rOD 0.63 r

17、OD 0.63 rOD 25三個(gè)醫(yī)療單位的檢測(cè)中，敏感性和特異性的水平相似。詳見下表 界限值界限值 = 0.7 rOD = 0.7 rOD 界限值界限值 = 1.5 rOD = 1.5 rOD 靈敏度靈敏度 特異性特異性 靈敏度靈敏度 特異性特異性 瑪麗醫(yī)院瑪麗醫(yī)院93% 93% 77% 77% 77% 77% 95% 95% 東莞市人民醫(yī)院東莞市人民醫(yī)院 94% 94% 70% 70% 63% 63% 94% 94% 中山市腫瘤研究所中山市腫瘤研究所 96% 96% 68% 68% 68% 68% 94% 94% 綜合綜合 94% 94% 69% 69% 66% 66% 94% 94% 26

18、進(jìn)行了VCA IgA 和EA IgA的免疫熒光檢測(cè)以及EBV DNA檢測(cè)對(duì)比 。作為篩查實(shí)驗(yàn)排除鼻咽癌的應(yīng)用與VCA IgA相比較 VCA IgA 界值 0.7 rOD 陰性預(yù)測(cè)率 94% 97% 假陰性率 13% 7% 被排除的疑似鼻咽癌病例 59% 77% 作為確定實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)鼻咽癌的應(yīng)用與EA IgA 和EBV DNA檢測(cè)相比較 EA IgA EBV DNA 界值 1.5 rOD陽(yáng)性預(yù)測(cè)率 86% 89% 83% 假陽(yáng)性率 4% 2% 5% 被預(yù)測(cè)的疑似鼻咽癌病例 75% 57% 77% 結(jié)果表明，本品在篩查試驗(yàn)中的應(yīng)用與目前所使用的VCA IgA相似，在確定實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用與目前所使用的EA IgA，或與最新使用的EBV DNA檢測(cè)相似。 27l臨床考核檢測(cè)441例鼻咽癌患者，1523例非鼻咽癌患者。考核結(jié)果顯示：l以R0.7為臨界值（與目前所使用的VCA IgA相似 ），本品檢測(cè)陰性符合率為94%。假陰性率為6%；特異性為69%，假陽(yáng)性31%。l以R1.5為 臨界值（與目前所使用的EA IgA ），本品檢測(cè)的陽(yáng)性符合率為66%，假陽(yáng)性率為6%，特異性94%，假陰性34%。 l上述結(jié)果與本品的使用說(shuō)明書推薦使用的上述結(jié)果與本品的使用說(shuō)明書推薦使用的診斷參數(shù)及其臨床意義相一致。診斷參數(shù)及其臨床意義相一致。l 2