PCR-RFLP基因分型方法

1、1PCR-RFLP 基因分型方法基因分型方法-關于序列查找、引物設計和酶切位點分析2概念聚合酶鏈式反應連接的限制性片段長度多態(tài)性分析 限制性片段長度多態(tài)性(restrition fragment length polymophism，RFLP): 是指由限制性酶切位點間的插入缺失重排或點突變所引起的基因型間限制性片段長度的變異。 PCR-RFLP: 是在 PCR 和 DNA 序列分析基礎上產(chǎn)生的 RFLP 技術。該方法是通過 PCR 擴增一段 DNA 片段，然后再選擇適當?shù)南拗菩詢惹忻?，消?PCR 產(chǎn)物，經(jīng)電泳，可得到有特異性的電泳譜帶，從而達到鑒定不同基因型的目的。 3概念4概念確定基因序

2、列設計引物選擇內切酶電 泳基 因 型Step by step5基因序列查找http:/www.genomatix.de//Genbank/sprot/6http:/www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/7基因序列查找選擇gene輸入基因名稱8基因序列查找基因的全稱基因的物種來源9引物設計引物設計10引物一般原則基本原則：1. 引物要跟模板緊密結合，2. 引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構存在，3. 引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應（即錯

3、配）。 需要考慮的因素：引物長度（primer length）、產(chǎn)物長度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、G值(internal stability)、引物二聚體及發(fā)夾結構（duplex formation and hairpin）錯誤引發(fā)位點（false priming site）、引物及產(chǎn)物GC 含量（composition） 11引物一般原則引物的長度：15-30bp，常用的是18-27bp 太短：特異性不好 太長：延伸溫度大于Taq酶的最適溫度 引物末端要求：3端的序列要比5端重要， 引物3端的堿基一般不用A A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)

4、效率相對比較高 ，5端序列對PCR 影響不大，常用來引進修飾位點或標物。 引物的GC含量 ：一般為40-60%，以45-55為宜 兩條引物之間的GC含量不宜相差太大 12引物一般原則Tm 值：盡量保證兩條引物的Tm值相匹配。最 好相差不要大于5 度引物二聚體及發(fā)夾結構的能量：絕對值一般不要超過4.5 最好不要位于3末端否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導致PCR 正常反應不能進行 ，如果在5末端對反應就沒有多大的影響了 G值: 反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的 G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高而 3端G值相對較低，且不要超過9。如此則有利于正確引 發(fā)反

5、應而可防止錯誤引發(fā) 13PCR-RFLP 引物特殊要求PCR產(chǎn)物的長度：200-1000bp酶切后產(chǎn)物片斷的大小差距：100bp以上14引物設計工欲善其事，必先利其器Primer Premier 5.0引物設計Oligo 6.0引物評價15引物設計新建窗口輸入序列16Primer Premier 5.0突變位點選取突變位點前后約500bp長度的堿基17Primer Premier 5.0引物設計酶切位點分析18Primer Premier 5.0自動搜索引物手動編輯引物19Primer Premier 5.0前引物的位置（必須超過突變位點）后引物的位置（必須在突變位點之后）PCR產(chǎn)物的長度引物

6、的長度20Primer Premier 5.0引物的綜合評分，分越高引物越好引物的詳細信息引物序列21Primer Premier 5.0發(fā)夾結構二聚體錯配交叉二聚體22Primer Premier 5.0更高級應用：參數(shù)的設置手動搜索或者修改引物搜索特殊引物（比如單條引物的搜索等）23引物純化方式的選擇去鹽（去鹽（ RPC 、Desalted）純化）純化它是一種對DNA有特異性的吸附的樹脂，能有效地去除鹽分及小片段的DNA分子。這種引物可以用于常規(guī)PCR、DNA測序等實驗。PAGE純化純化PAGE 純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。P

7、AGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化 后的純度大于95%，對長鏈OligoDNA(大于50mer)的純化特別有效。適用于PCR用引物(如定點誘變引物)，DNA測需用引物，各種探針等。HPLC純化純化采用高效液相色譜純化，產(chǎn)物純度極高，可達99%。適用于各種基因工程試驗，特別是：熒光標記DNA、長鏈DNA、PCR克隆，定點突變，人工合成基因等。24幾種特殊類型的引物設計引入酶切位點引物設計Takara定點誘變試劑盒 定點誘變引物設計Quikchange定點誘變試劑盒 定點誘變引物設計25引入酶切位點引物設計為什么要引入酶切位點？突變位點沒有內切酶或者合適的內切酶通過人為的在引物上改

8、變一個堿基從而使之與突變位點的堿基構成新的酶切位點26引入酶切位點引物設計tctcaacaaaaTcaaaactgtaag 突變位點，找不到合適的內切酶tctcaacaGaaTcaaaactgtaag Hinf I可以使用PCR-RFLP的方法基因分型27引入酶切位點引物設計基本原則：人為改變原序列上的一個堿基從而與突變位點的堿基構成新的合適的酶切位點具體要求： 內切酶的選擇：便宜、條件穩(wěn)定和常用。 引物的位置：引物3端的最后一個堿基一定不能超過突變位點 改變酶切位點的位置：盡量遠離突變位點，最好不要緊鄰突變位點，一般相隔2-3個堿基 引物的長度：在保證引物質量的前提下，盡可能的加長引物的長度

9、。最好不要小于20bp28引入酶切位點引物設計5. PCR產(chǎn)物的長度：最好能位于100-200bp之間，瓊脂糖凝膠電泳時更好區(qū)分。6. 突變位點附近的引物設計受限，因此，另外一條引物應該盡量設計好。7. 在有多種內切酶可供選擇時，盡量選擇切頻率高的基因型的內切酶。以提高靈敏度。29定點誘變引物設計（一）30定點誘變引物設計（一）31定點誘變引物設計（二）5-ggattcagaatgattctctccaagaaaacatcctttttggatg-33-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-532酶切位點分析新建窗口33酶切位點分析輸入序列，注意粘貼的序列不能有空格和段落標記符號大寫突變位點以便于辨認34酶切位點分析選擇菜單AnalyzeRestriction maping35酶切位點分析酶譜選擇點擊確定36酶切位點分析可供選擇的限制性內切酶37酶切位點分析酶切位點個數(shù)酶切位置酶切后片斷大小38電泳瓊脂糖凝膠電泳：操作簡便、快捷、靈敏。是分離、鑒定和純化核酸的首選的標準方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨力高于普通瓊脂糖凝膠電泳，適用于低分子質量蛋白、寡核苷酸的分離和DNA序列的分析。39電泳瓊脂糖凝膠濃度（%）線