血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化

1、血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的變化 楊軍,伍衛(wèi)梁蔚文,王景峰,潘秋輝,方昶黃至斌【摘要】【目的】研究血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后連接蛋白43(x43)表達(dá)的變化及與細(xì)胞周期分布的關(guān)系?！痉椒ā縿e離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞,用血管緊張素誘導(dǎo)心肌肥大,72h后用RT-PR和免疫熒光方法觀察心肌細(xì)胞x43基因和蛋白表達(dá),用流式細(xì)胞儀測(cè)定法觀察心肌細(xì)胞周期分布變化以及x43表達(dá)量的關(guān)系。【結(jié)果】血管緊張素處理后的心肌細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞肥大且細(xì)胞活力增強(qiáng)，S期、G2-期細(xì)胞百分比增加,細(xì)胞內(nèi)G2-二倍體DNA含量降低，x43蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，x43RNA表達(dá)程度也較對(duì)照組明顯下調(diào)，x43蛋白

2、表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞周期分布的改變相關(guān)。【結(jié)論】血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后x43基因表達(dá)明顯下調(diào)，導(dǎo)致x43蛋白表達(dá)亦出現(xiàn)下調(diào)，這一改變可能與心肌肥大過(guò)程中的細(xì)胞周期變化有關(guān),提示血管緊張素可能通過(guò)調(diào)控x43基因的表達(dá)而參與縫隙連接重構(gòu)過(guò)程，而x43表達(dá)的變化可能與心肌肥大的機(jī)制有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】血管緊張素；心肌細(xì)胞肥大；連接蛋白43；縫隙連接；細(xì)胞周期JSUNYat-senUniv(edSi),2022,28(3):292-296心肌肥大是多種心血管疾病過(guò)程中的一個(gè)共同的病理過(guò)程，盡管心肌肥大曾被認(rèn)為是心臟的一種適應(yīng)性代償反響，但目前已認(rèn)識(shí)到心肌肥大(yardialhypertrphy)是心血管疾

3、病中的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素，心肌肥大本身即明顯增加心血管病死亡率，而其內(nèi)在機(jī)制認(rèn)為與心肌肥大所致的電生理重構(gòu)有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間縫隙連接的改變?cè)谛募‰娚碇貥?gòu)起著重要作用?？p隙連接蛋白43(nnexin43,x43)是心肌細(xì)胞間隙連接的主要蛋白成分,該連接構(gòu)成相鄰細(xì)胞間親水管道，對(duì)于細(xì)胞間信息傳導(dǎo),細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及維持心肌節(jié)律性同步收縮有重要意義1。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)心肌肥大后的心肌x43表達(dá)下降2-4,但也有學(xué)者報(bào)道實(shí)驗(yàn)性高血壓引起心肌肥大時(shí)其心肌x43表達(dá)無(wú)改變5或x43表達(dá)增加8；而對(duì)于心肌肥大過(guò)程中x43改變的機(jī)制以及血管緊張素對(duì)縫隙連接蛋白重構(gòu)的影響至今還鮮見(jiàn)報(bào)道，我們通過(guò)本實(shí)驗(yàn)觀察了血管緊張

4、素對(duì)心肌x43基因和蛋白表達(dá)及細(xì)胞周期影響,討論心肌肥大過(guò)程中x43的變化及血管緊張素對(duì)縫隙連接蛋白重構(gòu)的可能作用和機(jī)制。1材料與方法1.1主要試劑和儀器DE-F12培養(yǎng)基(Gib)；胎牛血清(BS,四季青公司)；血管緊張素(Siga)；5-溴脫氧嘧啶核苷(Siga)；胰蛋白酶(Dif)；兔抗大鼠x43多抗(博士德公司)；FIT羊抗兔IgG(博士德公司);纈沙坦原藥(北京諾華制藥)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TYB公司)；TrizlRNA提取液(R公司)；PR引物(北京賽百特公司合成)；PR主要試劑購(gòu)自TAKARA公司；其它常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞檢測(cè)儀(EpisAltra型,美國(guó)Bek

5、anunter公司)。1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組每次取13d齡的istar大鼠20只，按改良的sipsn法進(jìn)展心肌細(xì)胞培養(yǎng)。主要過(guò)程為：將大鼠心室肌用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，離心棄上清后，參加含20%胎牛血清的DE-F12培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至752培養(yǎng)瓶中,置于5%2培養(yǎng)箱內(nèi)37差速貼壁90in，再取未貼壁細(xì)胞均勻地接種96孔及6孔培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng)。僅在培養(yǎng)第一天中加0.1l/L的5-溴脫氧嘧啶核苷抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，24h后換無(wú)5-溴脫氧嘧啶核苷的培養(yǎng)基8。約3d后,心肌細(xì)胞成簇生長(zhǎng)并出現(xiàn)搏動(dòng)。1周左右,細(xì)胞密集嚴(yán)密接觸，到達(dá)同步收縮，此時(shí)培養(yǎng)心肌細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)

6、驗(yàn)分為兩組：血管緊張素組：每天所換培養(yǎng)液中加血管緊張素以無(wú)血清培養(yǎng)液溶解使終濃度為1.010-6l/L，正常對(duì)照組(ntrl)：培養(yǎng)液中加等量無(wú)血清培養(yǎng)液。處理72h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)分別取兩組細(xì)胞作TT、細(xì)胞周期檢測(cè)、免疫熒光和RT-PR檢測(cè)。1.3四氮甲唑藍(lán)(TT)法測(cè)定對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響采用TT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。取原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞接種于96孔平內(nèi)幕胞培養(yǎng)板上，每組10個(gè)孔，培養(yǎng)24h，然后換含10L/L血清的培養(yǎng)液，24h后,實(shí)驗(yàn)組換用添加含濃度為1.010-6l/L血管緊張素的無(wú)血清的培養(yǎng)液200L，對(duì)照組換含一樣濃度DS的無(wú)血清的培養(yǎng)液200L，72h后,

7、參加TT(5g/L)20L/孔繼續(xù)培養(yǎng)4h。參加二甲基亞砜原液200L/孔，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀下選擇波長(zhǎng)490n測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附A值。1.4流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期取血管緊張素終濃度1.010-6l/L處理72h后的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以750L/L酒精固定細(xì)胞后，參加200LPI(0.110-3g/L),4染色1h后上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)。經(jīng)數(shù)據(jù)獲取軟件分析，重復(fù)4次。1.5免疫熒光檢測(cè)x43表達(dá)細(xì)胞以1.0105/L的密度接種于置小蓋玻片的24孔培養(yǎng)板,取血管緊張素處理72h后，取出蓋玻片，PBS沖洗，950L/L乙醇固定，1TritnX-100室溫孵育20in。滴加一抗x43,

8、4過(guò)夜后滴加y3-羊抗兔IgG(1100)，熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)展照相分析。1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響(RTPR)參照Genebank資料設(shè)計(jì)并合成引物6。引物序列為:x43,F:5-TTGTTTTGTAAGTAA-3,R:5-GATGAGGAAGGAAGAGA-AG-3,擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為588bp;-atin，F(xiàn):5-AGGATTGTAAAATG-3,5-TTAGTGTGGTGGTGAAG-3,擴(kuò)增長(zhǎng)度為400bp。取處理72h后的細(xì)胞按TRIZL試劑盒所示方法提取總RNA,取6LRNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。PR反響條件：94變性2in后，9430s、5530s、7245s順序循環(huán)35次,最后72延伸

9、5in。電泳及圖像掃描及定量分析。測(cè)目的基因與-atin的RT-PR產(chǎn)物電泳帶的D值比。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以表示,使用SPSS11.0及Exel統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn),變量間的相關(guān)分析采用雙變量相關(guān)性分析，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1鏡下心肌細(xì)胞觀察結(jié)果2.2血管緊張素對(duì)細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示，正常對(duì)照組A值為0.1900.016，血管緊張素組A值為0.2140.024，提示血管緊張素可增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力(n=4,P0.01)。2.3血管緊張素對(duì)細(xì)胞周期的影響血管緊張素組中S期、G2-期細(xì)胞百分比增加(n=4,P0.05)，G0-G1期細(xì)胞百

10、分比與正常對(duì)照組相比有減少趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=4,P0.05)。血管緊張素刺激心肌細(xì)胞72h，細(xì)胞內(nèi)G2-二倍體DNA含量低于對(duì)照組P0.05，G0-G1單倍體DNA含量與對(duì)照組比較未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=4,P0.05)。結(jié)果提示培養(yǎng)心肌細(xì)胞在血管緊張素作用下出現(xiàn)心肌肥大(表1)。2.4血管緊張素對(duì)x43蛋白表達(dá)的影響2.5血管緊張素對(duì)x43RNA表達(dá)的影響2.6x43表達(dá)與細(xì)胞周期特征變化的相關(guān)性對(duì)血管緊張素處理后心肌細(xì)胞x43表達(dá)與細(xì)胞周期分布變化進(jìn)展雙變量相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)：血管緊張素處理后x43蛋白表達(dá)的變化，即免疫熒光檢測(cè)中單位面積熒光陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，與x43RNA表達(dá)程度的變化

11、相關(guān)r=0.995,P0.01，而前者與S期細(xì)胞百分比變化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.912,P0.05)，與細(xì)胞內(nèi)G2-二倍體DNA含量呈正相關(guān)r=0.896,P0.05；但與G2-期細(xì)胞百分比，G0-G1單倍體DNA含量的變化以及TT測(cè)得的吸附A值變化未表現(xiàn)出明顯相關(guān)關(guān)系P0.05。結(jié)果提示：x43表達(dá)的變化與心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期改變可能相關(guān)。3討論心肌肥大作為心血管疾病中的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素明顯增加心血管病死亡率，其機(jī)制與心肌肥大所致的電生理重構(gòu)有關(guān)。心肌電生理重構(gòu)包括細(xì)胞膜離子通道的變化和/或細(xì)胞間縫隙連接的改變，在某些情況下后者顯得更為重要。細(xì)胞縫隙連接(GapJuntin,GJ)是心肌細(xì)胞間唯

12、一具有電連接作用的細(xì)胞間連接形式，相鄰細(xì)胞間通過(guò)GJ進(jìn)展著信息和能量物質(zhì)的交換，并對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過(guò)程也起著重要的調(diào)控作用1。在連接蛋白這個(gè)多基因大家族中，其中x43是心肌最主要的連接蛋白，尤其是心室肌細(xì)胞間電流的主要導(dǎo)體。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)有效致心肌細(xì)胞肥大劑量的血管緊張素處理培養(yǎng)心肌細(xì)胞72h后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯肥大，同時(shí)更多細(xì)胞進(jìn)入S期，心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布特征也提示心肌細(xì)胞在經(jīng)血管緊張素處理后處于肥大狀態(tài)。而在免疫熒光檢測(cè)中可觀察到肥大心肌細(xì)胞的x43蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外多數(shù)學(xué)者從在體實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果一致2-4,7。而作為縫隙連接的主要構(gòu)造蛋白

13、，心肌x43表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致心肌興奮性、傳導(dǎo)性改變，故更易發(fā)生心律失常，這也可能是心肌肥大為何成為心血管疾病的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素的重要原因。實(shí)驗(yàn)中同樣也看到血管緊張素處理后的心肌細(xì)胞的x43RNA表達(dá)程度也出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示x43蛋白表達(dá)下調(diào)與基因程度的調(diào)控有關(guān)，血管緊張素可能通過(guò)基因程度的調(diào)控參與了肥大心肌的縫隙連接蛋白的重構(gòu)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后x43基因和蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，而在心肌肥大過(guò)程中x43的變化可能并非如此簡(jiǎn)單。如有學(xué)者就發(fā)現(xiàn)慢性壓力超負(fù)荷引起的肥大心肌左心室x43在每個(gè)心肌表達(dá)及分布形式與正常無(wú)顯著差異2,7。而Ddge8用0.1l/L的血管緊張素作用于

14、培養(yǎng)乳鼠心室肌6h和24h后，發(fā)現(xiàn)x43蛋白的表達(dá)增加。Frigli等9證實(shí)增加豬心臟的容量負(fù)荷可以引起x43增加,并伴有心室肥厚。Peters等在對(duì)5例主動(dòng)脈瓣狹窄所致左室肥厚的左室心肌活檢標(biāo)本的研究中,發(fā)現(xiàn)無(wú)缺血的肥大心肌細(xì)胞每單位體積的縫隙連接中x43含量減少40%2。同時(shí)國(guó)內(nèi)也有學(xué)者用去甲腎上腺素或苯腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥大，作用48h后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞中x43蛋白表達(dá)減少，推測(cè)可能與心肌細(xì)胞進(jìn)入S期有關(guān)11。因此在心肌肥大過(guò)程中x43的變化可能是非常復(fù)雜的，其演變規(guī)律目前并不是十清楚確12，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)心肌肥大時(shí)x43變化觀察的結(jié)果并不盡一樣，其原因可能與觀察的動(dòng)物模型和動(dòng)物種屬

15、不同有關(guān)，而心肌細(xì)胞x43表達(dá)本身的變化也很有可能具有與心肌肥大進(jìn)程相關(guān)的時(shí)相特征，正如有學(xué)者通過(guò)對(duì)心室機(jī)械負(fù)荷增加引起心肌肥大和心力衰竭的模型分析所發(fā)現(xiàn)的；在早期階段，x43表達(dá)上調(diào)；而在心力衰竭晚期階段,那么心肌傳導(dǎo)速度及x43表達(dá)下調(diào)13。與此同時(shí)，雖已有學(xué)者證實(shí)：x43參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié),并與橫紋肌肉瘤分化以及平滑肌細(xì)胞的表型改變有關(guān)10,14，而在心肌肥大過(guò)程中的作用目前仍不確定。實(shí)驗(yàn)中我們不僅發(fā)現(xiàn)血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后x43基因和蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，而且我們還發(fā)現(xiàn)x43蛋白表達(dá)的變化與細(xì)胞周期分布變化相關(guān)：提示血管緊張素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后x43蛋白表達(dá)的變化可能是心肌肥

16、大過(guò)程中的一個(gè)重要特征，心肌細(xì)胞肥大后出現(xiàn)以x43表達(dá)程度下調(diào)為主要特征的縫隙連接蛋白重構(gòu)，而這種重構(gòu)已發(fā)現(xiàn)與心律失常的發(fā)活力制親密相關(guān)。但x43變化在心肌肥大和心肌重塑中的時(shí)相特征和詳細(xì)意義，以及與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系,仍有待進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】RUIANIV,IKALSENS.nnexins,gapjuntininterellularuniatinandkinasesJ.Bilell,2002,947-8:433-443.ITH,TAKEiSHIY,NAKADA,etal.Lng-tertreatentithangitensintype1reeptrantagnist,V-11974,r

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