轉(zhuǎn)錄組測序技術原理及應用（行業(yè)知識）

1、RNA測序技術原理及應用1沐風書苑r遺傳的中心法則基因組轉(zhuǎn)錄組表觀遺傳組蛋白組層次2沐風書苑r什么是轉(zhuǎn)錄組？All transcripts All mRNAs3沐風書苑rRNA是解讀基因組的關鍵RNAProteinPhenotypeGenotype DNA4沐風書苑r測序技術RNA-SeqSmall RNA測序降解組測序Non-coding RNA測序研究對象mRNASmall RNAmRNANon-coding RNA鑒定新分子OOOO表達譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST 測序O/XXXX 篩選分子標記 OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達O/XXXXRNA 測序技術5沐風書苑rWorkfl

2、ow of RNA-Seq樣品檢測文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析6沐風書苑rTotal RNA樣品檢測 Agilent 2200 檢測OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0; RIN7 新型安捷倫2200 TapeStation系統(tǒng)是新一代測序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對生物樣品進行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案?？蓴U展的通量16聯(lián)或96孔微量滴定板快速得到結(jié)果平均每個樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果使用簡單可直接使用的ScreenTape預制膠條簡化了工作流程樣品

3、用量少每次運行僅需要不到2ul樣品7沐風書苑r檢測報告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅8沐風書苑r檢測報告-不合格樣品9沐風書苑rWorkflow of RNA-Seq樣品檢測文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析10沐風書苑r真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3的poly A與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素

4、標記Oligo（dT）25+poly（A）11沐風書苑r原核mRNA的純化Ambion MICROExpress KitLNA扣鎖型探針12沐風書苑rmRNA反轉(zhuǎn)錄-fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。加入1l的stop buffer終止反應。加入沉淀劑（NaAc 糖原 無水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTds cDNA13沐風書苑r末端修復(防止自連）cDNA 3末端加AAdapter連接14沐風書苑r第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成第二天末端修復 加接頭膠回收3端加A第三天PCRPCR膠回收 文庫制備 文

5、庫質(zhì)量檢測：Aligent 2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測：跑膠驗證。15沐風書苑rWorkflow of RNA-Seq樣品檢測文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析16沐風書苑rApplicationRNA-Seq (單端測序-Quantification)RNA-Seq (雙端測序-Transcriptome)Expression-profilingAlternative SplicingFusion GeneSNP detectionHiSeq 2500Applications of RNA-Seq171

6、7沐風書苑rRNA-Seq (Transcriptome)18沐風書苑rWorkflow of RNA-Seq(Transcriptome)生物信息學分析19沐風書苑rRNA-Seq (Transcriptome)Characterize the transcriptome in unparalleled detailTechnique 220RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)RNA-Seq (Transcriptome resequencing)20沐風書苑rRNA-Seq (De novo transcriptome assembly)文庫構(gòu)建

7、測序組裝21沐風書苑rDe novo assemble a transcriptome組裝流程22沐風書苑r數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估組裝結(jié)果分析（Contig 長度分布、Scaffold 長度分布、Unigene 長度分布）Unigene （transcript）功能注釋Unigene 的GO 分類Unigene 代謝通路分析預測編碼蛋白框（CDS）Unigene 表達差異分析（兩個或兩個以上樣品）Unigene 在樣品間的差異GO 分類（需兩個或兩個以上樣品）和Pathway 富集性分析De novo assembly transcriptome 信息分析主要內(nèi)容：23沐風書苑

8、rDe novo assembly transcriptome信息分析流程24沐風書苑rUnigenes的GO 注釋25沐風書苑rPathway 分析26沐風書苑rRNA-Seq (Transcriptome resequencing)cDNA文庫構(gòu)建測序比對到參考序列27沐風書苑rTranscriptome resequencing比對流程28沐風書苑r比對統(tǒng)計基因表達注釋基因差異表達分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接分析預測新轉(zhuǎn)錄本cSNP分析Transcriptome resequencing信息分析主要內(nèi)容29沐風書苑rTranscriptome resequencing信息分析流程30沐風書苑

9、r應用-優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析31沐風書苑rGenomic intergenic regionReadsclusterPaired Readsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End (PE) ReadsReads 比對到參考序列基因間區(qū)域32沐風書苑r鑒定可變剪接（ Alternative Splicing ）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3common readsjunction readsmRNA33沐風書苑r鑒定基因融合Paired ReadsSingle

10、ReadsGene AGene B34沐風書苑r分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測序比對軟件：SOAPDe novo 轉(zhuǎn)錄組測序: 組裝軟件：SoapDenovo比對軟件： SoapSNP35沐風書苑r36轉(zhuǎn)錄組研究技術橫向比較TechnologyTiling ArraycDNA or EST sequesing Transcriptome SequencingPrincipleHybridizationSanger sequencingNext-GensequencingResolutionFrom several to 100Single baseSingle baseThroughputHi

11、ghLowHighReliance on genomic sequenceYesNoIn some casesBackground noiseHighLowLowApplicationSimutaneously map transcribed regions and gene expressionYesLimited for expressionYesDynamic range to quantify gene expression levelUp to a few-hundred foldNot practical 8,000-foldAbility to distinguish diffe

12、rent isoforms and allelic expressionLimitedYesYes36沐風書苑r轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢RNA測序與芯片檢測基因數(shù)比較 RNA測序與芯片檢測基因的表達量分布Technique 137沐風書苑rGenome Res 2010Case 實驗材料收集： 葉片，花序, 果實, 根 時間點：0 , 4, 8, 12, 16, 20和 24 h 將每個時間點采集的樣品均勻混合 測序策略： Illumina 測序，1G data38沐風書苑r1. High light 2.Heat 3. Cold 4. Salt 5.Drought抗逆相關可變剪接39沐風書苑r外包膜

13、蛋白16 (AT2G28900)Intron-retentionControlLow Temperature Resistance低溫脅迫相關的AS低溫脅迫下這個內(nèi)含子和對照相比被保留了下來，揭示了可變剪接有重要功能。40沐風書苑rAS調(diào)節(jié)機制CCA1生物鐘相關基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關等41沐風書苑rRNA-Seq單端測序（Quantification）等同于數(shù)字表達譜(DGE)42沐風書苑rWorkflow of RNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息學分析43沐風書苑rRNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測序數(shù)據(jù)評估篩選差異表達基因

14、表達模式聚類分析GO 功能富集分析Pathway 富集分析蛋白互作網(wǎng)絡分析44沐風書苑rRNA-Seq單端測序（Quantification）信息分析流程45沐風書苑rRNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點比較技術優(yōu)點缺點RNA-seq1）檢測基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準，可重復性高（重復相關系數(shù)0.99）3）數(shù)字化信號，無背景噪音，無交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測6）數(shù)據(jù)可與時俱進，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎，

15、才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊含的豐富信息基因芯片1）平臺應用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺要求樣品量少1）檢測靈敏度較低、重復性差、檢測閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽性率1%3）受物種限制，只能檢測部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度基因5）只能檢測已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設計的，可能出現(xiàn)注釋不準確的情況46沐風書苑rcasePlant Physiology 2010取樣： 選取在成熟季節(jié)開花后 5, 10, 和15個星期葡萄分別代表葡萄果實成熟中的三個時期（post setting, veraison和ripening）數(shù)據(jù)量： 超過59M reads數(shù)據(jù)， 長度在36-44bp之間運用RNA-Seq技術對葡萄果實發(fā)育過程中復雜轉(zhuǎn)錄特征的研究。47沐風書苑r表二 reads在基因組上的分布情況表一 測序數(shù)據(jù)葡萄RNA-Seq單端測序48沐風書苑r漿果發(fā)育三個階段共有、特有基因表達分布圖基因表達量分布49沐風書苑r表達簇的分類分布情況