微生物工程代謝調(diào)控h

1、第 三 章 微生物的代謝調(diào)節(jié)與代謝工程1第 三 章 微生物的代謝調(diào)節(jié)與代謝工程第一節(jié) 微生物代謝的自我調(diào)節(jié)第二節(jié) 微生物的代謝調(diào)控第三節(jié) 代謝工程2第一節(jié) 微生物代謝的自我調(diào)節(jié)3微生物代謝是受到高度調(diào)節(jié)的，如下事實(shí)可以說明1）微生物生長在含單一有機(jī)化合物為能源的合成培養(yǎng)基中，所有大分子單體（如氨基酸）的合成速率同大分子（如蛋白質(zhì)）的合成速率協(xié)調(diào)一致，不會(huì)浪費(fèi)能量去合成那些他們用不著的東西。2）任何一種單體的合成，如能從外源獲得并能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，單體的合成自動(dòng)停止，參與這些單體生成的酶的合成也會(huì)停止；3）微生物只有在有某些有機(jī)基質(zhì)（如乳糖）存在時(shí)，才會(huì)合成異化這些基質(zhì)的酶；4）如存在兩種有機(jī)基質(zhì)，

2、微生物會(huì)先合成那些能異化更易利用的基質(zhì)的酶，待易利用的基質(zhì)耗竭才開始誘導(dǎo)分解較難利用的基質(zhì)的酶；5）養(yǎng)分影響生長速率，從而相應(yīng)改變細(xì)胞大分子的組成（如RNA含量） 4微生物自我調(diào)節(jié)的部位： 1、養(yǎng)分吸收分泌的通道大多數(shù)親水分子難于透過細(xì)胞膜，需借助一些負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)拿赶到y(tǒng)（如透酶）才得以實(shí)現(xiàn)；有些是需能的。2、限制基質(zhì)與酶的接近 在真核生物中，各種代謝庫的基質(zhì)分別存在于由胞膜分隔的細(xì)胞器內(nèi)，如在鏈孢霉中精氨酸存在于細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)，這兩處參與精氨酸代謝的酶量有很大的差別。 原核生物的控制方式不同，其中有些酶是以多酶復(fù)合物或以細(xì)胞膜結(jié)合的方式存在，類似于酶的固定化形式，使它不能自由活動(dòng)。3、代謝途徑通

3、量的控制微生物控制代謝物流的方法有兩種： 調(diào)節(jié)現(xiàn)有酶的量、改變已有酶分子的活性 微生物自我調(diào)節(jié)的三個(gè)部位實(shí)際上也就是三個(gè)類型，但都涉及到酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)。 酶促調(diào)節(jié)的方式包括酶活性調(diào)節(jié)和酶合成調(diào)節(jié)兩大類。5原核生物真核生物6一、酶活性調(diào)節(jié)（一）酶的激活作用和酶的抑制作用 -兩個(gè)矛盾的過程；普遍存在于微生物代謝中 表3-1 大腸桿菌糖代謝中酶的激活劑與抑制劑 酶 激活劑 抑制劑磷酸果糖激酶 ADP 、GDP PEP丙酮酸脫氫酶 PEP、AMP、GDP NADH 、乙酰CoA7天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶ATP激活圖3-1 嘧啶生物合成的限速酶調(diào)節(jié)方式8大腸桿菌酵解和TCA循環(huán)中的促進(jìn)與抑制位點(diǎn)促進(jìn)抑制9一、酶

4、活性調(diào)節(jié)（二）酶活性的 調(diào)節(jié)方式變(別)構(gòu)效應(yīng)共價(jià)修飾締合與解離競爭性抑制101、變構(gòu)控制變構(gòu)或別構(gòu)(allosterism)效應(yīng) 是指一種小分子物質(zhì)與一種蛋白質(zhì)分子發(fā)生可逆的相互作用，導(dǎo)致這種蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變這種蛋白質(zhì)與第三種分子的相互作用。 變構(gòu)蛋白是表現(xiàn)變構(gòu)效應(yīng)的蛋白，如阻遏蛋白 具有變構(gòu)作用的酶稱作變構(gòu)酶11變構(gòu)調(diào)節(jié)理論：1）變構(gòu)酶具有一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)，除了結(jié)合底物的活性中心外，在同一分子內(nèi)還有一些分立的效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)（副位點(diǎn)）；2）主位點(diǎn)和副位點(diǎn)可同時(shí)被占據(jù)；3）副位點(diǎn)可結(jié)合不同的效應(yīng)物，產(chǎn)生不同的效應(yīng)；4）效應(yīng)物在副位點(diǎn)上的結(jié)合可隨后引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化，從而影

5、響酶活性中心的催化活性；5）變構(gòu)效應(yīng)是反饋控制的理論基礎(chǔ)，是調(diào)節(jié)代謝的有效方法。122、共價(jià)修飾指蛋白質(zhì)分子中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與一化學(xué)基團(tuán)共價(jià)連接或解開，使其活性改變的作用?；瘜W(xué)基團(tuán)：磷酸基、腺苷?；?、甲基、乙基等蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合部位一般為絲氨酸殘基的-CH2OH 共價(jià)修飾分可逆和不可逆兩種13有些酶存在活性和非活性兩種狀態(tài)，它們可以通過另一種酶的催化作共價(jià)修飾而互相轉(zhuǎn)換。如: 糖原磷酸化酶 通過激酶和磷酸酯酶來調(diào)節(jié)活性 磷酸化形式 有活性 去磷酸化形式 無活性 1）可逆共價(jià)修飾14磷酸化酶E-CH2-OH(無活性) 磷酸化酶E-CH2-O-P(有活性) H2OPi磷酸酯酶 ATPADP

6、磷酸化酶激酶15酶可逆共價(jià)修飾的意義：1） 因酶構(gòu)型的轉(zhuǎn)換是由酶催化的，故可在很短的時(shí)間內(nèi)經(jīng)信號(hào)啟動(dòng)，觸發(fā)生成大量有活性的酶；2）這種修飾作用可更易控制酶的活性以響應(yīng)代謝環(huán)境的變化。 這一系統(tǒng)具有能隨時(shí)響應(yīng)的特性，因而經(jīng)常在活化與鈍化狀態(tài)之間來回變換。 需消耗能量，但只占細(xì)胞整個(gè)能量消耗的一小部分162）不可逆共價(jià)修飾 典型的例子是酶原激活無活性的酶原被相應(yīng)的蛋白酶作用，切去一小段肽鏈而被激活 (胰蛋白酶原的活化靠腸肽酶從其N-端切去一個(gè)己肽 Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)腸肽酶胰酶原胰酶彈性蛋白酶原的活化彈性蛋白酶原的活化彈性蛋白酶原的活化自身催化 信號(hào)放大 酶完成使命后

7、便被降解，關(guān)閉酶活性 酶原變?yōu)槊甘遣豢赡娴?7二、酶合成的調(diào)節(jié) 凡是能促進(jìn)酶合成的調(diào)節(jié)稱為誘導(dǎo)；而能阻礙酶合成的調(diào)節(jié)稱為阻遏。 酶合成的調(diào)節(jié)是一種通過調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率的調(diào)節(jié)機(jī)制，這是一種在基因水平上（在原核生物中主要在轉(zhuǎn)錄水平上）的代謝調(diào)節(jié)。 同調(diào)節(jié)酶的活性的反饋抑制等相比，通過調(diào)節(jié)酶的合成而實(shí)現(xiàn)代謝調(diào)節(jié)的方式是一類較間接而緩慢的調(diào)節(jié)方式；其優(yōu)點(diǎn)是通過阻止酶的過量合成，有利于節(jié)約生物合成的原料和能量。18（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型誘導(dǎo)阻遏末端產(chǎn)物阻遏分解代謝產(chǎn)物阻遏19組成酶 不依賴于酶底物或類似物的存在而合成 如葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸過程中的各種酶誘導(dǎo)酶依賴于某種底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物

8、的存在而合成 如大腸桿菌乳糖利用酶1、酶合成的誘導(dǎo)（induction）20 誘導(dǎo)劑可以是誘導(dǎo)酶的底物，也可是底物的結(jié)構(gòu)類似物 如：乳糖是大腸桿菌-半乳糖苷酶合成的誘導(dǎo)劑，也是此酶的底物 誘導(dǎo)劑也可以不是該酶的作用底物 如異丙基- -D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合成的極佳誘導(dǎo)劑，但不是作用底物； 酶的作用底物不一定有誘導(dǎo)作用 如對(duì)硝基苯-L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶的底物，但不能誘導(dǎo)該酶的合成。21酶的誘導(dǎo)可分兩種：1）同時(shí)誘導(dǎo) 2）順序誘導(dǎo)當(dāng)誘導(dǎo)物加入后，同時(shí)或幾乎同時(shí)誘導(dǎo)幾種酶的合成；主要存在于短的代謝途徑中。如將乳糖加入到E.coli培養(yǎng)基后，可同時(shí)誘導(dǎo)出-半乳糖苷透性酶、

9、 -半乳糖苷酶、半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；?；不管誘導(dǎo)強(qiáng)度如何，所以這三種蛋白以同一比例合成。 （因?yàn)槿叩幕蚪M成同一操縱子）先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中間代謝物的酶，以達(dá)到對(duì)較復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。22苯乙醇胺苯乙酮酸苯乙醛苯甲酸順，順-粘康酸-酮己二酸L-犬尿氨酸O-氨基苯甲酸L-色氨酸N-甲酰犬尿氨酸-酮己二酰CoA乙酸+琥珀酸兒茶酚丙氨酸甲酸假單孢菌芳香氨基酸降解酶類的順序誘導(dǎo)232、酶合成的阻遏(repression)末端產(chǎn)物阻遏 (end-product repression)分解代謝物阻遏 (catabolite repression)24 指由某代謝途徑末端產(chǎn)物過量積累而

10、引起的阻遏。1）末端產(chǎn)物阻遏 (end-product repression) 對(duì)直線式途徑來說，末端產(chǎn)物阻遏的情況較簡單，即產(chǎn)物作用于代謝途徑中的各種關(guān)鍵酶，使之合成受阻；對(duì)于分支代謝途徑而言，情況較復(fù)雜，每種末端產(chǎn)物僅專一地阻遏合成它的那條分支途徑的酶。代謝途徑分支點(diǎn)以前的“公共酶”僅受所有分支途徑末端產(chǎn)物的阻遏（多價(jià)阻遏作用）。 末端產(chǎn)物阻遏在代謝調(diào)節(jié)中有重要作用，保證細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)維持適當(dāng)?shù)臐舛?；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途徑中?52）分解代謝物阻遏 (catabolite repression)是指兩種碳源（或氮源）分解底物同時(shí)存在時(shí)，細(xì)胞利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物

11、的有關(guān)分解酶合成的現(xiàn)象。or當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在有多種可供利用的底物時(shí)，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，這就是分解代謝阻遏。26 最典型的例子是細(xì)胞通過最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解產(chǎn)物來抑制一些酶的合成。 這個(gè)現(xiàn)象最早在青霉素的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，可快速利用的葡萄糖致使青霉素產(chǎn)量特別低，而緩慢利用的乳糖卻能較好地生產(chǎn)青霉素。 進(jìn)一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前體，它的價(jià)值僅在于緩慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解產(chǎn)物阻遏了青霉素合成酶的合成。27把大腸桿菌培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中，可明顯看到大腸桿菌經(jīng)歷了兩個(gè)對(duì)數(shù)期。葡萄糖在第一個(gè)周期中被利用。在葡萄糖代謝初期，-半乳糖苷酶

12、和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代謝所需的酶開始合成，于是出現(xiàn)了利用乳糖的第二個(gè)生長周期。28 阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的結(jié)果；而是其分解代謝過程中所產(chǎn)生的中間代謝物引起； 這種抑制青霉素合成及乳糖利用的現(xiàn)象，起初認(rèn)為只有葡萄糖才會(huì)產(chǎn)生，故稱為葡萄糖效應(yīng)。 所有可以迅速利用或代謝的能源，都能阻遏異化另一種被緩慢利用能源所需酶的合成 分解代謝阻遏涉及到的是一些誘導(dǎo)酶29（二）酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制目前認(rèn)為，由Monod和Jacob提出的操縱子假說能較好地解釋酶合成的誘導(dǎo)和阻遏操縱子(operon)啟動(dòng)基因(promoter)操縱基因(operat

13、or)結(jié)構(gòu)基因(structural gene)RNA聚合酶結(jié)合部位操縱基因位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間，能與阻遏物（一種調(diào)節(jié)蛋白）相結(jié)合，以此來決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄能否進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因?yàn)橐唤M功能相關(guān)的基因誘導(dǎo)型操縱子（inducible operon）阻遏型操縱子（repressible operon）只有當(dāng)存在誘導(dǎo)物時(shí)其轉(zhuǎn)錄水平才最高,并隨之轉(zhuǎn)譯出誘導(dǎo)酶 負(fù)責(zé)基質(zhì)分解 如 乳糖操縱子只有當(dāng)缺乏輔阻遏物時(shí)其轉(zhuǎn)錄頻率才最高，即只有通過去阻遏作用才能啟動(dòng)所編碼酶的合成 負(fù)責(zé)某些物質(zhì)合成 色氨酸操縱子30調(diào)節(jié)基因(regulator gene) 一般位于相應(yīng)操縱子的附近，也可遠(yuǎn)離操縱子; 編碼組成型調(diào)節(jié)蛋

14、白 調(diào)節(jié)蛋白(regulatory protein)是一類變構(gòu)蛋白，有兩個(gè)特殊位點(diǎn)，其一可與操縱基因結(jié)合，另一位點(diǎn)可與效應(yīng)物結(jié)合。能在沒有誘導(dǎo)物時(shí)與操縱基因結(jié)合只能在輔阻遏物存在時(shí)才能與操縱基因結(jié)合阻遏物(repressor): 阻遏物蛋白（aporepressor）調(diào)節(jié)蛋白(可分兩種)31效應(yīng)物(effector)指一類低分子質(zhì)量的信號(hào)物質(zhì)（如糖類及其衍生物、氨基酸、核苷酸等）。誘導(dǎo)物(inducer)輔阻遏物(corepressor)321.單一效應(yīng)物調(diào)節(jié)-酶的誘導(dǎo)機(jī)制：（乳糖操縱子） E.coli乳糖操縱子由lac啟動(dòng)基因(lacP)、lac操縱基因(lacO)和三個(gè)結(jié)構(gòu)基因(lacZ、

15、Y、A)所組成，三個(gè)結(jié)構(gòu)基因分別編碼-半乳糖苷酶、透過酶和轉(zhuǎn)乙酰酶。 乳糖操縱子是負(fù)調(diào)節(jié)的代表，在缺乏乳糖等誘導(dǎo)物時(shí)，由調(diào)節(jié)基因(lacI)編碼的調(diào)節(jié)蛋白（即lac阻遏物）一直結(jié)合在操縱基因上，抑制著結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。 當(dāng)有誘導(dǎo)物如乳糖存在時(shí)，乳糖與lac阻遏物相結(jié)合，使后者發(fā)生構(gòu)象變化，不能繼續(xù)結(jié)合在操縱子上，操縱子的“開關(guān)”被打開，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯可順利進(jìn)行。 當(dāng)誘導(dǎo)物耗盡后，lac阻遏物可再次與操縱基因結(jié)合，這時(shí)轉(zhuǎn)錄的“開關(guān)”又被關(guān)閉，酶就無法合成，細(xì)胞內(nèi)酶的合成速度急劇下降。33lacIPlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因控制部分轉(zhuǎn)錄mRNA-半乳糖苷酶透過酶轉(zhuǎn)乙?；咐?/p>

16、乳糖生長阻遏蛋白R(shí)NA聚合酶O誘導(dǎo)物無活性乳糖操縱子(lac operon) 酶的誘導(dǎo)機(jī)制342.單一效應(yīng)物調(diào)節(jié)-阻遏機(jī)制:(色氨酸操縱子)色氨酸操縱子的阻遏是對(duì)合成代謝酶類進(jìn)行正調(diào)節(jié)的典例 E.coli色氨酸操縱子也由啟動(dòng)基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因（5個(gè)）三部分組成。5個(gè)結(jié)構(gòu)基因分別編碼色氨酸合成途徑中的5種酶。調(diào)節(jié)基因(trpR)遠(yuǎn)離操縱基因，編碼阻遏物蛋白；其為由4個(gè)亞基組成的四聚體；單獨(dú)的四聚體不能和操縱基因(trpO)結(jié)合，只有先結(jié)合了色氨酸分子后改變了四聚體的分子構(gòu)象才能與trpO結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸濃度高時(shí)，色氨酸與阻遏物蛋白結(jié)合，形成完全阻遏物，與操縱基因結(jié)合，阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄（

17、色氨酸為輔阻遏物）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸缺乏或不足時(shí)，則導(dǎo)致阻遏物脫離操縱基因，使操縱基因“開關(guān)”打開，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄又可正常進(jìn)行。35trp ROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP鄰氨基苯甲酸合成酶-亞基鄰氨基苯甲酸合成酶 -亞基吲哚甘油磷酸合成酶Trp合成酶-亞基Trp合成酶-亞基分支酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸吲哚甘油磷酸色氨酸羧苯氨基脫氨核糖磷酸36trp ROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP阻遏物蛋白（無活性）阻遏物阻遏物（有活性）RNA聚合酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄翻譯色氨酸合成色氨酸轉(zhuǎn)錄將重新開始373.兩種效應(yīng)物的共同調(diào)節(jié): (乳糖操縱子的調(diào)

18、節(jié)與大腸桿菌內(nèi)的cAMP濃度有關(guān)) E.coli 含有一個(gè)代謝產(chǎn)物活化蛋白CAP (catabolite activated protein)，也稱cAMP受體蛋白CRP；CAP 和cAMP都是lac mRNA合成所必需的。 CAP能與cAMP形成復(fù)合物， cAMP- CAP復(fù)合物結(jié)合在lac 操縱子的啟動(dòng)基因上，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)正調(diào)節(jié)。 葡萄糖分解代謝的中間代謝物能抑制腺苷酰環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低cAMP濃度，此時(shí)CAP不能被活化形成cAMP- CAP復(fù)合物，從而抑制了lac的轉(zhuǎn)錄。雙重調(diào)控38lacIPlacZlacYlacA調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因控制部分阻遏蛋白R(shí)NA聚合酶

19、O誘導(dǎo)物乳糖操縱子(lac operon) 分解代謝阻遏 CAPcAMP-CAP復(fù)合物cAMP腺苷酰環(huán)化酶磷酸二酯酶葡萄糖分解轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn) 錄 394.RNA水平的調(diào)節(jié)機(jī)制: 弱化調(diào)節(jié) Yanofsky 1973年研究大腸桿菌色氨酸合成時(shí)發(fā)現(xiàn)；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有色氨酸存在時(shí)，可使轉(zhuǎn)錄過程在未到終點(diǎn)之前，便有80%-90%的轉(zhuǎn)錄停止。這種調(diào)節(jié)方式不是使正在轉(zhuǎn)錄的過程全部在中途停止，故稱弱化作用(attenuation) 弱化調(diào)節(jié)是通過操縱子的引導(dǎo)區(qū)內(nèi)類似于終止子結(jié)構(gòu)的一段DNA序列實(shí)現(xiàn)的，這段序列稱為弱化子或衰減子(attenuator) 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)某種氨基酰-tRNA缺乏時(shí)，該弱化子不表現(xiàn)為終止子功能；當(dāng)細(xì)

20、胞內(nèi)某種氨基酰-tRNA充足時(shí)，弱化子表現(xiàn)為終止子功能，但這種終止作用并不使所有正在轉(zhuǎn)錄中的mRNA全部都中途停止，而只是部分中途停止轉(zhuǎn)錄。40 弱化調(diào)節(jié)方式是在mRNA水平上起作用的； 較為廣泛地存在于氨基酸合成操縱子調(diào)節(jié)中，是細(xì)菌輔助阻遏作用的一種精細(xì)調(diào)控； mRNA含有一引導(dǎo)區(qū)（在第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的上游），顯示出一種不平常的氨基酸密碼子的堆積。 如:色氨酸操縱子 兩個(gè)Trp密碼子相鄰地位于引導(dǎo)區(qū)41trp ROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP？組氨酸操縱子弱化子中存在7個(gè)組氨酸密碼子；苯丙氨酸操縱子弱化子中存在7個(gè)苯丙氨酸密碼子42游離mRNA中1與2，3與4配對(duì)低

21、濃度色氨酸使核糖體停留在1部位，轉(zhuǎn)錄得以完成高濃度色氨酸使核糖體到達(dá)2部位，3與4配對(duì)，轉(zhuǎn)錄終止43三、分支生物合成途徑的調(diào)節(jié)1、同工酶（isoenzyme）調(diào)節(jié)某一分支途徑中的第一步反應(yīng)可由多種酶催化，但這些酶受不同的終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié). (酶的分子結(jié)構(gòu)不同)如：大腸桿菌的天門冬氨酸族氨基酸的合成途徑中，有三個(gè)同工酶：天門冬氨酸激酶、，分別受賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸的反饋調(diào)節(jié)442、協(xié)同反饋調(diào)節(jié)(concerted feedback regulation)需有一種以上終產(chǎn)物的過量存在方有明顯的效果單個(gè)終產(chǎn)物過量，不產(chǎn)生或只產(chǎn)生很小的影響ABCDEFG453、累加反饋調(diào)節(jié) (cumulative

22、 feedback regulation) 每一種末端產(chǎn)物過量只能部分抑制或阻遏，總的效果是累加的BACDEFG30%40%58%464、增效反饋調(diào)節(jié) (cooperative feedback regulation) 代謝途徑中任一末端產(chǎn)物過量時(shí)，僅部分抑制共同反應(yīng)中第一個(gè)酶的活性，但兩個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)，其抑制作用可超過各末端產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制作用的總和。BACDEFG15%20%90%475、順序反饋調(diào)節(jié) (sequential feedback regulation) 分支途徑中幾個(gè)末端產(chǎn)物抑制分支點(diǎn)后面第一個(gè)酶，使分支點(diǎn)產(chǎn)物積累，結(jié)果分支點(diǎn)產(chǎn)物又反饋抑制共同途徑中的第一個(gè)酶，最后使整個(gè)

23、代謝途徑停止。486、聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié) 由一種生物合成的中間產(chǎn)物參與兩個(gè)完全獨(dú)立的、不交叉的合成途徑的控制。這種中間體物質(zhì)濃度的變化會(huì)影響這兩個(gè)獨(dú)立代謝途徑的代謝速率。49腸細(xì)菌氨甲酰磷酸合成酶的聯(lián)合激活和抑制腸細(xì)菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途徑是完全獨(dú)立的，但它們有一共同的中間體氨甲酰磷酸。負(fù)責(zé)合成該中間體的酶氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代謝途徑的代謝物UMP反饋抑制，也可被精氨酸合成途徑中的中間體鳥氨酸激活。氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸50四、能荷調(diào)節(jié)能荷（energy charge）指細(xì)胞中ATP、ADP、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸鍵的量度。能荷調(diào)節(jié)指細(xì)胞通過改變ATP、ADP、AM

24、P三者比例來調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)，也稱腺苷酸調(diào)節(jié)。51 能荷不僅調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類（如磷酸果糖激酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶等）的活性，也調(diào)節(jié)利用ATP的生物合成酶類（如檸檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）的活性。R代表ATP合成的酶系統(tǒng)U代表ATP消耗的酶系統(tǒng) 5253第 二 節(jié) 微生物的代謝調(diào)控54 在工業(yè)生產(chǎn)中卻往往需要單一地積累某種產(chǎn)品，這些產(chǎn)品的量又經(jīng)常是大大地超出了細(xì)胞正常生長和代謝所需的范圍； 要達(dá)到過量積累某種產(chǎn)品的目的，提高生產(chǎn)效率，必須使原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)失去控制，在保證微生物適當(dāng)生存的條件下，建立起新的代謝方式，使微生物代謝產(chǎn)物按照人們的意志積累。 代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)是

25、通過細(xì)胞自身的代謝調(diào)控系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞機(jī)能實(shí)行精細(xì)控制來達(dá)到的； 對(duì)于生命過程來說，代謝反應(yīng)的協(xié)調(diào)是必要的；概述55一、克服反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻恼{(diào)控反饋調(diào)節(jié)反饋抑制反饋?zhàn)瓒艨朔答佌{(diào)節(jié)，可從以下兩方面著手： 降低末端產(chǎn)物濃度 應(yīng)用抗反饋突變株561、降低末端產(chǎn)物濃度1）營養(yǎng)缺陷型的利用 營養(yǎng)缺陷型是指原菌株因基因突變致使合成途徑中斷，喪失了合成某種必須物質(zhì)的能力，而必須在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)物質(zhì)才能正常生長的突變菌株。 營養(yǎng)缺陷型突變株的代謝流受阻，末端產(chǎn)物減少，解除了末端產(chǎn)物參與的反饋調(diào)節(jié)，可使代謝途徑中的某一中間產(chǎn)物積累。57例1：利用營養(yǎng)缺陷型積累直鏈代謝途徑中間代謝產(chǎn)物58ABCDEEaEbEc

26、Ed 若要積累C，首先要獲得缺失酶c 的營養(yǎng)缺陷型。 酶c缺失后，物質(zhì)C便不再轉(zhuǎn)變成物質(zhì)D，不再合成物質(zhì)E。 由于這種突變體已不能合成末端產(chǎn)物E，所以就解除了E對(duì)酶a和酶b的反饋調(diào)節(jié)。反饋抑制反饋?zhàn)瓒鬍c缺陷C59 但是，完全不能合成產(chǎn)物E的突變體，因?yàn)椴荒芾肊去進(jìn)一步合成必須的細(xì)胞物質(zhì)，所以無法正常生長。為了保證突變體的正常生長，培養(yǎng)時(shí)須提供低濃度的、不足以引起反饋調(diào)節(jié)的物質(zhì)E。這樣高濃度的中間產(chǎn)物C就能積累起來了。例如：利用枯草桿菌的精氨酸缺陷型生產(chǎn)瓜氨酸，利用大腸桿菌的賴氨酸缺陷型生產(chǎn)蘇氨酸，都是這個(gè)道理。60例2：利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑中的中間產(chǎn)物61ABCDEFGHIJMN

27、KL末端產(chǎn)物L(fēng)和N共同對(duì)酶a施以反饋;此外， L抑制酶J1，N抑制酶J2J1J2選用缺失酶J1的突變株，則L的合成受阻。L和N共同對(duì)酶a的反饋被解除。又由于酶J2還受到N的調(diào)節(jié)，只有少量的J能轉(zhuǎn)變成N，于是中間產(chǎn)物J大量積累。J1缺陷J 62谷氨酸棒桿菌的IMP合成途徑和代謝調(diào)節(jié)工業(yè)上用谷氨酸棒桿菌的腺苷酸缺陷型生產(chǎn)肌苷酸（IMP）即是此例的應(yīng)用。63在分支途徑中，如果減少某一末端產(chǎn)物的濃度，常?？梢苑e累另一末端產(chǎn)物。例3：利用營養(yǎng)缺陷型積累分支代謝途徑末端產(chǎn)物工業(yè)上應(yīng)用的重要例子是賴氨酸發(fā)酵64C. glutamicum 的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn) 天冬氨酸半醛生成高絲氨酸的途徑受阻之后，蘇氨酸

28、的生成減少。 蘇氨酸與賴氨酸合作進(jìn)行的反饋抑制便被打破，于是賴氨酸能夠大量積累。652）滲漏缺陷型的利用滲漏缺陷型是一種特殊的營養(yǎng)缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點(diǎn)是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長。 不會(huì)產(chǎn)生過量的末端產(chǎn)物，因而可以避開反饋調(diào)節(jié)，但它又能合成微量的末端產(chǎn)物，用來進(jìn)行生物合成；在培養(yǎng)這種突變體時(shí)，可不必在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的物質(zhì)，就能積累所需的產(chǎn)物。66滲漏缺陷型的獲得方法：把大量營養(yǎng)缺陷型菌株接種在基本培養(yǎng)基平板上，挑選生長特別慢而菌落小的即可。應(yīng)用實(shí)例:利用滲漏型育成天門冬氨轉(zhuǎn)甲酰酶活力提高500倍的菌株該菌株為尿嘧啶滲漏缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中少量的

29、尿嘧啶消耗后，為尿嘧啶所反饋抑制的天門冬氨轉(zhuǎn)甲酰酶活力增加500倍673）提高細(xì)胞滲透性 細(xì)胞內(nèi)合成的發(fā)酵產(chǎn)物若要分泌到培養(yǎng)基中，必須經(jīng)過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。如果產(chǎn)物不易分泌出細(xì)胞，而積累在細(xì)胞內(nèi)，則會(huì)引起反饋調(diào)節(jié)。 改變細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性，使其有利于產(chǎn)物的分泌，也是降低末端產(chǎn)物濃度的一種途徑。68 谷氨酸生產(chǎn)菌的細(xì)胞膜磷脂含量高時(shí)，細(xì)胞的通透性較差，磷脂含量低時(shí)，通透性較好。 通常在培養(yǎng)基中添加一些控制因素，以達(dá)到影響細(xì)胞膜磷脂含量的目的。如可使用青霉素來使細(xì)胞壁的完整合成受阻。 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性增大后，產(chǎn)物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)的積累。692、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的利用 在

30、以積累末端產(chǎn)物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，如果代謝途徑單一無分枝，往往不能選用營養(yǎng)缺陷型突變株。要提高產(chǎn)量，最好采用抗反饋調(diào)節(jié)突變株。 抗反饋調(diào)節(jié)突變株是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的突變型菌株。其特點(diǎn)是所需產(chǎn)物不斷積累，不會(huì)因其濃度超量而終止生產(chǎn)。70 抗反饋突變株由于基因突變，它們的酶或無活性的原阻遏物不再與末端產(chǎn)物結(jié)合，從而不再發(fā)生酶的變構(gòu)及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再與發(fā)生了突變的操縱基因結(jié)合，因此反饋調(diào)節(jié)被打破，即使在末端產(chǎn)物過量的情況下，也同樣可以積累高濃度的末端產(chǎn)物。71 末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成。 在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后

31、，未突變的細(xì)胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成 所需的該種末端產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 那些對(duì)類似物不敏感的突變體，則由于原來受反饋控制的酶的結(jié)構(gòu)，或是酶的合成系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)生了改變，它們不再受抑制或阻遏的影響，在類似物充斥的情況下照常能合成該種末端產(chǎn)物。72 在工業(yè)上，生產(chǎn)氨基酸、嘌呤、嘧啶和維生素的生產(chǎn)菌種大都是抗反饋突變株。例如，用類似物D-精氨酸選出的谷氨酸棒桿菌的抗反饋突變株可使L-精氨酸的產(chǎn)量得到提高。 73二、克服分解代謝阻遏的調(diào)控生產(chǎn)中要克服分解代謝阻遏可采取下列措施741、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源可采用相對(duì)來說不引起分解代謝阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有機(jī)酸和黃豆

32、餅粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培養(yǎng)熒光假單胞菌，由于克服了半乳糖的分解代謝阻遏，結(jié)果在細(xì)胞中所產(chǎn)生的纖維素酶提高了1500倍。752、流加碳源或氮源在考慮經(jīng)濟(jì)效益而必須使用有阻遏作用的碳源或氮源時(shí)，緩慢流加碳、氮源可使分解代謝產(chǎn)物維持在較低的水平上，而不至于產(chǎn)生阻遏。76如調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使產(chǎn)生的阻遏蛋白失活，不能與末端分解代謝產(chǎn)物結(jié)合；或操縱基因發(fā)生突變使阻遏蛋白不能與其結(jié)合，都能獲得抗分解代謝阻遏的突變株。3、利用抗分解代謝阻遏的突變體77篩選方法： 在以酶受阻遏的底物為唯一氮源的培養(yǎng)基上，選擇能正常生長的菌落。例如： 把鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)在葡萄糖-脯氨酸瓊脂上，因?yàn)楦彼嵫趸副黄咸烟?/p>

33、阻遏，所以采用脯氨酸為唯一氮源。 未突變菌株的脯氨酸氧化酶被阻遏，而無法利用脯氨酸作為氮源，菌株不能生長；抗分解代謝阻遏突變株則能夠利用脯氨酸而正常生長。78三、對(duì)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的控制 在生產(chǎn)上為了提高誘導(dǎo)酶的產(chǎn)量，對(duì)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)控制的常用手段有：791、添加誘導(dǎo)物類似物 在誘導(dǎo)物就是酶的底物的情況下，添加底物類似物來加強(qiáng)誘導(dǎo)作用是最好的。 因?yàn)榈孜镱愃莆锊灰妆凰纬傻拿阜纸?，而在?xì)胞中始終保持較高的濃度，能夠持續(xù)地誘導(dǎo)酶的合成，獲得較高濃度的酶。例如: 用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)-半乳糖苷酶的合成802、添加輔酶或輔助因子在有些情況下，必須在培養(yǎng)基中添加輔酶才會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用例如：丙酮酸脫羧

34、酶的合成需有硫胺存在813、利用組成型突變株 突變可以除去酶合成時(shí)對(duì)誘導(dǎo)物的依賴組成酶突變株在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，能照常合成誘導(dǎo)酶 在生產(chǎn)中使用組成酶突變株時(shí)，可不必在發(fā)酵液中添加誘導(dǎo)物，且產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶活性也比原菌株強(qiáng)。82例如 把大腸桿菌半乳糖苷酶的誘導(dǎo)型菌株經(jīng)誘變處理后，先在含乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，由于組成型突變株半乳糖苷酶的合成不需誘導(dǎo)即能產(chǎn)生，因此可較誘導(dǎo)型的出發(fā)菌株較早開始生長，在一定時(shí)間內(nèi)菌數(shù)的增加便較快。 如持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，由于誘導(dǎo)酶形成后，原菌株生長速率亦逐漸增加，這種選擇性造成的差別就會(huì)減少。 可用交替在乳糖、葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。兩者利用葡萄糖時(shí)的生長速率是相同的，乳糖為

35、碳源造成的組成型菌株的優(yōu)勢生長會(huì)持續(xù)下去。83 在平板上識(shí)別組成型突變株的方法，主要是利用在無誘導(dǎo)物存在時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，它能產(chǎn)生酶，加入適當(dāng)?shù)牡孜镞M(jìn)行反應(yīng)顯示酶活以識(shí)別。 如甘油培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不產(chǎn)酶，組成型菌株可產(chǎn)生半乳糖苷酶。菌落長出后噴布鄰硝基苯半乳糖苷，組成型菌株的菌落由于能水解它而呈現(xiàn)硝基苯的黃色，誘導(dǎo)型則無顏色變化。 通常使用酶解后可以有顏色變化的底物，便于迅速檢出組成型菌落。8485第 三 節(jié) 代 謝 工 程86一、代謝工程概述1、代謝工程的基本定義代謝工程(Metabolic Engineering) 利用生物學(xué)原理，系統(tǒng)分析細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，并通過DNA重組技術(shù)

36、合理設(shè)計(jì)細(xì)胞代謝途徑及遺傳修飾，進(jìn)而完成細(xì)胞特性改造的應(yīng)用性學(xué)科。87 1974年，Chakrabarty在假單胞菌屬的兩個(gè)菌種中分別引入幾個(gè)穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，從而提高了對(duì)樟腦和萘等復(fù)雜有機(jī)物的降解活性。這是代謝工程技術(shù)應(yīng)用的第一實(shí)例。1991年 James E. Bailey (California Institute of Technology) 首次使用該術(shù)語又稱 途徑工程(Pathway engineering)882、代謝工程的基本過程1）靶點(diǎn)設(shè)計(jì) 最后，根據(jù)代謝流分布和控制的分析結(jié)果確定途徑操作的合理靶點(diǎn)。 通常包括擬修飾基因的靶點(diǎn)、擬導(dǎo)入途徑的靶點(diǎn)或擬阻斷途徑的靶點(diǎn)等。至少包括三個(gè)

37、基本過程 正確的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)必須對(duì)現(xiàn)有的代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)信息進(jìn)行更深入的分析。 首先，根據(jù)化學(xué)動(dòng)力學(xué)和計(jì)量學(xué)原理定量測定網(wǎng)絡(luò)中的代謝流分布（即代謝流分析; Metabolic flux analysis, MFA），其中最重要的是細(xì)胞內(nèi)碳和氮元素的流向比例關(guān)系。 其次，在代謝流分析的基礎(chǔ)上調(diào)查其控制狀態(tài)、機(jī)制和影響因素（即代謝流控制分析；Metabolic flux control analysis, MCA）。892) 基因操作 利用代謝工程戰(zhàn)略修飾改造細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的核心是在分子水平上對(duì)靶基因或基因簇進(jìn)行遺傳操作。 其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表達(dá)、修飾、敲除、調(diào)控以及重組基因在目標(biāo)細(xì)

38、胞染色體DNA上的穩(wěn)定整合。903）效果分析 一次性的代謝工程設(shè)計(jì)和操作往往不能達(dá)到實(shí)際生產(chǎn)所要求的產(chǎn)量、速率和濃度，因?yàn)榇蟛糠謱?shí)驗(yàn)涉及的只是單一代謝途徑有關(guān)的基因、操縱子或基因簇的改變。 通過對(duì)新代謝進(jìn)行全面的效果分析，這種由初步途徑操作構(gòu)建出來的細(xì)胞所表現(xiàn)出的限制與缺陷，可以作為新一輪實(shí)驗(yàn)的改造目標(biāo)。913、代謝工程的基本原理代謝工程是多學(xué)科高度交叉的新型領(lǐng)域，涉及諸多基本原理：1）涉及細(xì)胞物質(zhì)代謝規(guī)律及途徑組合的化學(xué)原理，它提供了生物體的基本代謝圖譜和生化反應(yīng)機(jī)制。2）涉及細(xì)胞代謝流及其控制分析的化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)和控制學(xué)原理，這是代謝途徑修飾的理論依據(jù)。3）涉及途徑代謝

39、流推動(dòng)力的酶學(xué)原理，包括酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、別構(gòu)抑制效應(yīng)、修飾激活效應(yīng)等。4）涉及基因操作與控制的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)原理，它們闡明了基因表達(dá)的基本規(guī)律，同時(shí)也提供了基因操作的一整套技術(shù)。925）涉及細(xì)胞生理狀態(tài)平衡的細(xì)胞生理學(xué)原理，它為細(xì)胞代謝機(jī)能提供了一個(gè)全景式的描述，因此是一個(gè)代謝速率和生理狀態(tài)表征研究的理想平臺(tái)。6）涉及發(fā)酵或細(xì)胞培育的工藝和工程控制的生化工程和化學(xué)工程原理，它為速率過程受限制的系統(tǒng)分析提供了獨(dú)特的工具和經(jīng)驗(yàn)。7）涉及生物信息收集、分析與應(yīng)用的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)原理，為代謝途徑設(shè)計(jì)提供信息，是代謝工程技術(shù)迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用的最大推動(dòng)力。93二、代謝工程的研究對(duì)象簡單地說，代謝工程的研究對(duì)象就是代謝網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜傳輸系統(tǒng)的有序組合構(gòu)成代謝網(wǎng)絡(luò)。廣義的代謝網(wǎng)絡(luò)包括物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)和能量代謝網(wǎng)絡(luò)。94 代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)（Node） 其中對(duì)終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。 主節(jié)點(diǎn)不是固定不變的。95根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)處代謝物流量的調(diào)控機(jī)制和特性節(jié)點(diǎn)分為：柔性節(jié)點(diǎn) （flexible node）剛性節(jié)點(diǎn) （rigi