二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

1、二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究涂洪波1 陳劉通1 孫 麗2 廖 晨1 白 莉1 (1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶，400037；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科，重慶，400038)摘要 目的：明確二甲雙胍（metformin）對(duì)尼古?。╪icotine）誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（ pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）增殖的影響，并探討其機(jī)制。方法：組織貼塊法原代培養(yǎng)SD大鼠PASMCs，不同濃度的尼古丁分別刺激PASMCs，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，確定尼古丁促PASMCs增殖的最佳作用濃度，并觀察二甲雙

2、胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響。ELISA法觀察二甲雙胍對(duì)尼古丁暴露下PASMCs白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-（TNF-）表達(dá)水平的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)二甲雙胍對(duì)尼古丁暴露下PASMCs產(chǎn)生ROS水平變化；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)AMP K表達(dá)和活性變化。結(jié)果：成功分離培養(yǎng)并鑒定PASMCs，-actin蛋白在細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)并呈絲狀分布。與對(duì)照組相比，0.1 mmol/L尼古丁處理48h后可顯著促進(jìn)PASMCs增殖（P0.05)；2 mmol/l二甲雙胍預(yù)處理后，尼古丁誘導(dǎo)的 PASMCs增殖受到明顯抑制。尼古丁處理組PASMCs細(xì)胞中IL-6、TNF-和ROS水平明

3、顯升高(P0.05)；而二甲雙胍干預(yù)后抑制尼古丁暴露下PASMCs中IL-6、TNF-和ROS的產(chǎn)生 (P0.05)。尼古丁刺激PASMCs后可引起AMPK磷酸化水平（p-AMPK）表達(dá)一過性升高，而二甲雙胍引起p-AMPK持續(xù)升高(P0.05)。結(jié)論：尼古丁刺激PASMCs引起IL-6、TNF-水平增加，及ROS過度生成，促進(jìn)PASMCs增殖；二甲雙胍抑制上述炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)，及尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs增殖，其機(jī)制可能依賴于AMPK的持續(xù)活化。關(guān)鍵詞二甲雙胍；尼古??；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；磷酸腺苷蛋白激酶；細(xì)胞增殖Effect of metformin on proliferation o

4、f pulmonary arterial smooth muscle cells induced by nicotine and its underlying mechanismTu Hongbo，Chen Liutong ，Sun Li，(Department ofInfectious Disease，XiNan Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，400038，China), Liao Chen, Bai Li (Department of Respiratory Medicine，Xinqiao Hospital，Th

5、ird Military Medical University，Chongqing，400037，China)AbstractObjective: To investigate the effect of metformin on the proliferation of rat pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) exposed to nicotine, and explore the underlying mechanisms. Methods: Rat PASMCs from rat pulmonary artery were

6、isolated and primarily cultured. The proliferation of PASMCs exposed to nicotine was determined by CCK-8 assay after pretreatment with Metformin. Expression of IL-6 and TNF- were detected by ELISA assay. The level of ROS was detected by ROS Fluorescent Probe-DHE and flow cytometry. The level of tota

7、l AMPK and phosphorylated AMPK in the PASMCs was determined by Western blot analysis. Results: Alpha actin protein distributed in the cytoplasm of PASMCs by immunocytochemistry, which identified the primarily isolated and cultured PASMCs. Compared with control PASMCs，the proliferation of PASMC was i

8、nduced obviously after 48h treatment with nicotine at 0.1mmol/L (P0.05)，However, the proliferation of PASMCs induced by 0.1mmol/L nicotine was inhibited significantly (P0.05). Additionally, the level of IL-6 and TNF- released by PASMCs increased after treatment with Nicotine，the ROS level also incre

9、ased significantly (P0.05). Nicotine induced the transient phosphorylation of AMPK at 2h exposure to Nicotine, while Metformin maintained phosphorylation of AMPK for almost 12 hours (P 0.05). Conclusion: Nicotine induced proliferation of PASMCs and release of IL-6, TNF- and ROS, accompanied by the t

10、ransient phosphorylation of AMPK. Metformin might inhibit the aboved effects induced by nicotine in AMPK-dependent pathwayKeywords: metformin；nicotine；pulmonary artery smooth muscle cell；AMPK； proliferation 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81370139）通信作者 白莉，電話E-mail：HYPERLINK mailto:肺血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓的病理生理基礎(chǔ)，

11、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）過度增殖是肺血管重構(gòu)的重要病理環(huán)節(jié)。研究表明，香煙煙霧中的主要成分尼古丁成分促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài) 1-2，從而引起PASMCs的增殖 3-4，在吸煙相關(guān)慢性阻塞性肺病（COPD）患者肺血管重構(gòu)中起關(guān)鍵作用。二甲雙胍是糖尿病的一線降糖藥物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍有著降血糖作用以外的諸多效應(yīng)，尤其是其抗炎、抗氧化效應(yīng)倍受關(guān)注5-6。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示二甲雙胍具有不依賴降血糖效應(yīng)的心血管保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗炎、抗氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍抑制野百合堿和低氧環(huán)境下

12、對(duì)肺循環(huán)有保護(hù)作用，抑制肺動(dòng)脈高壓形成7；鑒于二甲雙胍的抗炎、抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，及其對(duì)肺循環(huán)的保護(hù)作用，我們推測(cè)二甲雙胍可能對(duì)于香煙煙霧暴露下的肺血管重構(gòu)具有抑制效應(yīng)。本研究通過觀察二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs增殖、細(xì)胞上清IL-6、TNF-和ROS產(chǎn)生的影響，并對(duì)二甲雙胍的主要作用底物AMPK表達(dá)和活性水平進(jìn)行檢測(cè)，明確二甲雙胍對(duì)尼古丁暴露下PASMCs增殖、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，并探討及其可能機(jī)制。1 材料和方法 主要材料和試劑DMEM/F-12培養(yǎng)基與胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購自Hyclone公司。小鼠抗-actin、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(

13、H+L)、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒及CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。尼古丁、Anti-phospho-AMPK (pThr172)抗體購自美國Sigma公司。大鼠IL-6、TNF- ELISA試劑盒購自上海滬尚生物公司。Anti-AMPK alpha 1+AMPK alpha 2購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗購自中衫生物科技公司。Western blot相關(guān)試劑購自碧云天公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由新橋醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Bio-Rad電泳儀、FACS Verse流式細(xì)胞儀及Bio-rad imark酶標(biāo)儀由新橋醫(yī)院呼吸研究所提供。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 P

14、ASMCs的培養(yǎng)與鑒定雄性SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，體重200-300g，戊巴比妥麻醉后引臼處死，無菌條件下取出肺動(dòng)脈，刮去內(nèi)膜和外膜，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，用0.25%的胰酶消化離心后傳代。用免疫組化法對(duì)細(xì)胞內(nèi)平滑肌肌動(dòng)蛋白-actin進(jìn)行熒光標(biāo)記，激光共聚焦鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)-actin蛋白呈綠色高表達(dá)并呈絲狀分布，證實(shí)細(xì)胞為SD大鼠PASMCs。所有實(shí)驗(yàn)均采用3-8代細(xì)胞。 1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取3-8代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液置于37、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PASMCs胰酶消化，計(jì)數(shù)后每孔加100 l 以410

15、4接種到96孔板貼壁24h，無血清培養(yǎng)基處理24h后，更換10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，用不同濃度尼古丁（0.01mmol/L、0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L）處理細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，加入CCK-8試劑10l培養(yǎng)30min，酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度值。確定尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的最佳濃度。為進(jìn)一步觀察二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響及可能機(jī)制，實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組（Control）：加含10%FBS DMEM/F-12培養(yǎng)液；尼古丁處理組（N組）；尼古丁+二甲雙胍處理組(N+M組)：加入尼古丁處理時(shí)同時(shí)加入2mmol/

16、L二甲雙胍預(yù)處理。 1.2.3 IL-6和TNF-表達(dá)檢測(cè)取第4代PASMCs胰酶消化后，以4106接種到6孔板貼壁24h，無血清培養(yǎng)基處理24h后，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基并加入0.1mmol/L 尼古丁處理，分別在0h, 30min, 1h, 3h，6h，12h時(shí)收集細(xì)胞上清，3000rpm離心10min后放入-20冰箱保存。用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)并用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度值。取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PASMCs胰酶消化，用上述實(shí)驗(yàn)條件處理細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入二甲雙胍和AICAR干預(yù)后，在6h用酶標(biāo)儀（Bio-rad imark）檢查各孔光密度值。1.2.4 活性氧（

17、ROS）表達(dá)檢測(cè)。取第4代PASMCs胰酶消化后，以4105接種到6孔板貼壁24h，無血清培養(yǎng)基處理24h后，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基并加入0.1mmol/L尼古丁處理，分別在0, 30min, 60min, 3h, 6h加入含有10mmol/L無血清DCFH-DA原位裝載探針，于恒溫培養(yǎng)箱孵育20min，之后用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。收集細(xì)胞，并設(shè)陽性對(duì)照（加Rosup），用流式細(xì)胞儀（FACS Verse）觀察平均熒光強(qiáng)度。另取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PASMCs胰酶消化，用上述實(shí)驗(yàn)條件處理細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入二甲雙胍干預(yù)后，60min用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

18、平均熒光強(qiáng)度。1.2.5 Western blot檢測(cè)AMPK蛋白表達(dá)和活性取第4代PASMCs胰酶消化后，以4105接種到25cm2培養(yǎng)瓶貼壁24h，無血清培養(yǎng)基處理24h后，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基并加入尼古丁使其終濃度為0.1mmol/L。分別在0h, 1h, 6h, 12h, 24h提取細(xì)胞總蛋白，每孔上樣20g以4%-12%的十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠（SDS）電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，5%BSA的TBST封閉2h，加入一抗（1：200稀釋）40C孵育過夜，洗膜3次，二抗室溫孵育1h, ECL試劑盒顯帶分析并測(cè)灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；另取第4代PASMCs胰酶消化后，用上述實(shí)驗(yàn)條件處

19、理細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入二甲雙胍干預(yù)后，在以上相同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組灰度值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，通過SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，各組間比較用單因素方差分析。P0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 PASMCs培養(yǎng)及鑒定光鏡下可見，傳代培養(yǎng)的第4代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，及典型的“峰谷”樣生長(zhǎng)，（圖1）。PASMCs免疫熒光染色后，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)-actin被FITC標(biāo)記的熒光 = 2 * ROMAN 二抗染成綠色，與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的絲狀分布，胞核經(jīng)DAPI染為藍(lán)色（圖2）。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為PASMCs。圖 1 細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，“峰-谷”樣生長(zhǎng)（倒置顯微鏡20

20、0）圖 2 免疫熒光鑒定-actin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)（激光共聚焦顯微鏡400）2.2 二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs增殖的影響經(jīng)CCK-8法檢測(cè)不同濃度的尼古丁對(duì)PASMCs增殖的影響，尼古丁處理48 h結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 0.1 mmol/L尼古丁后促PASMCs增殖效應(yīng)最強(qiáng)；高濃度的尼古丁反而抑制PASMCs增殖 (P0.05)（圖3）。因此，我們確定0.1 mmol/L尼古丁為誘導(dǎo)PASMC增殖的最佳濃度。2 mmol/L二甲雙胍預(yù)處理后能顯著逆轉(zhuǎn)尼古丁的促增殖作用(P0.05)（與N組相比，加入二甲雙胍24 h、48 h、72 h時(shí)抑制率分別為14%、16%、28%。（表1）a：P0.05，與

21、陰性對(duì)照組相比較；b：P0.05，與0.01mmol/L 尼古丁組及0.1mmol/L尼古丁組比較；c：P0.05，與陰性對(duì)照組比較。圖3 CCK-8檢測(cè)不同濃度的尼古丁刺激48h對(duì)PASMCs增殖的影響表 1 各實(shí)驗(yàn)組于不同時(shí)間點(diǎn)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果n=3，(s)時(shí)間點(diǎn)Control N組 N+M組24h1.020.051.190.04a1.030.03b48h1.040.031.200.06a1.010.03b72h 1.090.05b1.230.05a0.940.10ba：P0.05，與同時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組比較；b：P0.05，與同時(shí)相點(diǎn)N組比較。2.3 二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs

22、釋放IL-6、TNF-的影響尼古丁可明顯促進(jìn)PASMCs中IL-6、TNF-表達(dá)，在6h達(dá)峰值圖4，而二甲雙胍組在6h時(shí)能顯著降低IL-6、TNF-的表達(dá)(P0.05)，見圖5。a：P0.05，與對(duì)照組比較。圖 4 尼古丁處理PASMCs對(duì)細(xì)胞分泌IL-6、TNF-表達(dá)的影響a：P0.05，與對(duì)照組比較，b：P0.05，與N組比較。圖 5 二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs分泌IL-6、TNF-表達(dá)的影響2.4 二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs 內(nèi)ROS生成的影響使用DCFH-DA探針檢測(cè)尼古丁處理PASMCs后細(xì)胞內(nèi)ROS濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼古丁可明顯誘導(dǎo)PASMCs 中ROS的生成 。尼古丁處理

23、30min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組相比開始升高（P0.05），在60min時(shí)達(dá)高峰（P0.05），隨后開始下降，見圖6。因此，我們選取60min這一關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)觀察二甲雙胍對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生是否存在影響作用。結(jié)果顯示尼古丁誘導(dǎo)PASMCs內(nèi)ROS的生成水平能明顯被二甲雙胍抑制(P0.05)。 各組細(xì)胞ROS生成水平：Control組 (1009.49497)，尼古丁組（23610.879）,尼古丁加二甲雙胍組( 1347.979)。各組細(xì)胞ROS生成量以對(duì)照組為100%基準(zhǔn)值進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 a：P0.05，與對(duì)照組比較, b:60min組與30min組比較; c:3h組與60m

24、in組比較圖 6 不同時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)尼古丁誘導(dǎo)PASMCs 產(chǎn)生ROS水平2.5 二甲雙胍對(duì)尼古丁暴露下PASMCs 中AMPK表達(dá)和活性的影響與對(duì)照組相比，尼古丁處理后1h時(shí)，磷酸化AMPK水平明顯升高，隨后逐漸減低，而AMPK表達(dá)水平在各時(shí)相點(diǎn)無明顯變化；見圖7。而在二甲雙胍同時(shí)處理的PASMCs中，PASMCs中磷酸化AMPK水平在尼古丁處理1h、6h、12h、24h均持續(xù)活化。與對(duì)照組相比，處理12h后磷酸化AMPK水平有明顯升高（P0.05），與12h組相比，24h組磷酸化AMPK水平明顯降低（P0.05），各組AMPK表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化。見圖8。 圖 7 Western

25、blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)PASMCs AMPK活化情況ABA:蛋白表達(dá)結(jié)果，B：定量分析結(jié)果。注：# P0.05 .圖 8 Western blot檢測(cè)二甲雙胍干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)PASMCs AMPK活化情況3 討論 80%-85%COPD患者與吸煙有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)吸煙致COPD患者的早期無低氧階段，甚至在肺功能正常階段，就已經(jīng)出現(xiàn)了肺血管重構(gòu)；香煙煙霧中的主要成分尼古丁引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引起IL-6、TNF-和ROS的過表達(dá)，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖。有研究證實(shí)，尼古丁可激活NF-kB通路，上調(diào)炎癥因子IL-6及TNF-的表達(dá) 8-9。Brandes RP等研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可通過NADP

26、H氧化酶和線粒體途徑，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性ROS10。炎癥因子、ROS與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)。IL-6可通過誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌的增殖11；HYPERLINK :801/zh/search.jsp孟亮等在研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6過表達(dá)的PASMCs中TIMP1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、I型膠原(CollagenI)表達(dá)增加，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖及遷移12；TNF-可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶過表達(dá)，調(diào)控其增殖13；TNF-過表達(dá)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化,通過刺激IL-6釋放,促

27、進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖14。有證據(jù)表明，ROS可誘導(dǎo)eNOS表達(dá)減少及活性降低，也直接滅活內(nèi)皮源性NO，導(dǎo)致NO的明顯降低，促使血管舒縮功能障礙，導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖15。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0.1mmol/L尼古丁促PASMCs增殖的同時(shí)，促進(jìn)PASMCs IL-6、TNF-的表達(dá)和釋放，PASMCs中ROS生成明顯增加；提示尼古丁促進(jìn)PASMCs中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)PASMCs增殖。調(diào)控細(xì)胞能量代謝平衡的腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）的抗炎、抗氧化應(yīng)激效應(yīng)近年來備受關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，AMPK活性較低與

28、機(jī)體高氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)密切相關(guān)，AMPK與體循環(huán)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化和球囊損傷后再狹窄中的研究結(jié)果顯示上調(diào)AMPK活性保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制平滑肌細(xì)胞增殖16。本研究中我們采用尼古丁處理PASMCs1h后，磷酸化AMPK表達(dá)一過性升高，而后逐漸降低，同時(shí)伴隨著PASMCs ROS生成、IL-6、TNF-A水平升高；尼古丁引起AMPK的短暫活化，可能是因?yàn)槟峁哦≌T發(fā)了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，觸發(fā)了細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，致使AMPK活性一過性升高，隨著AMPK的活化降低，其不足以抑制炎癥因子和ROS持續(xù)高表達(dá)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖；由此我們推測(cè)上調(diào)AMPK活性可能抑制尼古丁誘導(dǎo)PASMCs中的氧

29、化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制PASMCs增殖。二甲雙胍是治療糖尿病的一線降糖藥物。AMPK的上游激酶是LKB1，是二甲雙胍的作用底物17；二甲雙胍可以活化LKB1/AMPK信號(hào)通路。Agard18等研究顯示傳統(tǒng)降糖藥物Metformin（AMPK激活劑）抑制野百合堿和低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成，此項(xiàng)研究雖然未直接探討其機(jī)制，但推測(cè)其機(jī)制可能與AMPK激活有關(guān)。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，降脂藥他汀類藥物抑制吸煙所致的肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓形成，其部分機(jī)制也可能與AMPK激活有關(guān)。本研究使用尼古丁處理PASMCs組同時(shí)加入二甲雙胍，與單純尼古丁處理組相比，磷酸化AMPK在尼古丁處理24h仍然處于較

30、高水平；且二甲雙胍可顯著抑制尼古丁誘導(dǎo)的PASMCs中IL-6、TNF-釋放和ROS生成（P0.05）；同時(shí)PASMCs增殖明顯受到抑制（P0.05）。表明二甲雙胍抑制尼古丁誘導(dǎo)PASMCs中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制PASMCs增殖。與尼古丁處理組p-AMPK一過性升高相比，二甲雙胍處理組維持AMPK的持續(xù)磷酸化，最終抑制尼古丁暴露下PASMCs的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激及過度增殖。綜上所述，本研究結(jié)果初步從體外研究證實(shí)二甲雙胍有效抑制尼古丁誘導(dǎo)PASMCs中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制PASMCs增殖。其機(jī)制可能與二甲雙胍上調(diào)AMPK的活性相關(guān)19，但是否存AMPK以外的其他機(jī)制尚需進(jìn)一步

31、研究。如能進(jìn)一步從體內(nèi)研究或臨床研究證實(shí)二甲雙胍能夠抑制或逆轉(zhuǎn)吸煙相關(guān)肺血管重構(gòu)，將對(duì)于開拓Metformin的臨床新用途及COPD相關(guān)肺動(dòng)脈高壓的早期防治具有重要意義。參考文獻(xiàn)：1 Lao QF,Zhong XN, He ZY,et al.HYPERLINK /pubmed/22321324The clinical characteristics of intra-acinar pulmonary artery inflammation and its effect on clinical parameters in smokers with normal lung function and

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