5、15 基因工程--上下游技術(shù)

1、基因工程上、下游技術(shù)1定義：基因工程技術(shù)是指將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌（或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達?；蚬こ趟幬镏圃斓囊话懔鞒蹋海?）獲得目的基因；（2） 組建重組質(zhì)粒；（3）構(gòu)建基因工程菌；（4）培養(yǎng)工程菌；（5）產(chǎn)物別離純化；（6）除菌過濾；（7）半成品檢定；（8）包裝21、上游階段：首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將其插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)粒或噬菌體中并轉(zhuǎn)大腸桿菌或其它宿主菌（細胞），以便大量復(fù)制目的基因。選擇基因表達系統(tǒng)主要考慮的是保證表達功能，其次要考慮的是表達量的多少和別離純化的難易。其中的(

2、1)、(2)、(3)步驟屬于上游階段，在實驗室完成。32、下游階段：將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最正確參數(shù)確實立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效別離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，別離純化的優(yōu)化控制，高純度純品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。上述(4)、(5)、(6)、(7)、(8)屬于下游階段。4一：基因工程技術(shù)主要內(nèi)容 獲得具有遺傳信息的目的基因選擇基因載體獲得重組DNA將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞鑒定帶有目的基因的克隆目的基因的擴增及獲得目的產(chǎn)物51、獲得具有遺傳信息的目的基因1 鳥槍克隆法2 人工合成目的基因 酶促方法 化學(xué)合成法 聚

3、合酶鏈反應(yīng) (PCR) 62 選擇基因載體獲得重組DNA在體外將含目的基因的 DNA 片段和具有自我復(fù)制功能、并帶有選擇標記的載體分子進行酶切連接 , 獲得重組 DNA 分子?？梢宰鳛檩d體的主要有質(zhì)粒、噬菌體 (phage) 、黏粒 (cosmid) 、病毒載體等。 73 將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞采用特定的方法將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)受體細胞 (也稱寄主細胞), 并與之同步增殖。被導(dǎo)入的受體細胞分為兩大類：第一類為原核細胞,目前常用的有大腸桿菌、枯草芽 抱桿菌、鏈霉茵等。第二類為真核細胞 , 其中真核微生物主要有酵母、絲狀真菌等 , 此外為動物細胞、植物細胞。另外也可以導(dǎo)人動物和植物

4、體。導(dǎo)人的方法主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方法 , 此外也可采用電融合、顯微注射和基因槍等技術(shù)。 84 鑒定帶有目的基因的克隆 從大量的細胞繁殖群體中,篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細胞。為了挑選出重組子,針對不同基因的表達產(chǎn)物,采用各自特有的測活方法確定其生物活性;也可以采用酶聯(lián)免疫方法確定其抗原性;以目的基因為探針,通過DNA雜交方法可以直接確定重組子。 95 目的基因的擴增及獲得目的產(chǎn)物 培養(yǎng)克隆有目的基因的重組子,提取獲得擴增的目的基因以進行深入的研究。將目的基因克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_載體,采用特定的方法將基因?qū)胧荏w細胞,使其在新的遺傳背景下獲得活性表達,從而得到人類需要的特定目的物質(zhì)。 10二：

5、基因工程上游技術(shù)的主要內(nèi)容 1 聚合酶鏈反應(yīng) 2 DNA的序列測定 3 基因文庫的構(gòu)建 111 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)即PCR (polymerase chain reaction) 技術(shù),1983年由美國Mullis創(chuàng)造,是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法,該技術(shù)的創(chuàng)造對分子生物學(xué)開展起到極大的推動作用,創(chuàng)造者獲得了1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 121.1 PCR技術(shù)的根本原理 DNA是雙螺旋分子,在高溫條件下雙鏈會發(fā)生別離成為單鏈DNA分子,DNA聚合酶以單鏈DNA分子為模板,在與待擴增DNA片段兩端序列互補人工合成的引物及4種脫氧核苷三磷酸的存在條件下,合成新的DNA互補鏈

6、,該鏈的起點取決于一對寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點。兩條DNA單鏈均可成為合成新互補鏈的模板,鑒于引物是依擴增段兩端序列互補原則設(shè)計的,因此每一條新生鏈的合成均起始于引物的退火位點,繼而沿相反鏈延伸,因此每條新合成DNA鏈均具有新的引物結(jié)合位點。當(dāng)再度加熱高溫條件下,使新舊DNA雙鏈分開,重復(fù)下一輪的循環(huán)反應(yīng),經(jīng)過屢次循環(huán)后反應(yīng)體系中雙鏈DNA分子數(shù),即一對引物結(jié)合位點間DNA片段的拷貝數(shù)理論上可達2n 。13PCR反應(yīng)主要分為3個局部進行 (1)模板變性 (2)退火 (3)延伸 上述3個步驟構(gòu)成一個循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物將成為下一循環(huán)擴增的模板 14解釋：雙鏈DNA在9095變性；

7、再迅速冷卻至40 60，引物退火并結(jié)合到靶序列上；然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。15下面是一個參考程序循環(huán)：預(yù)變性 94 4分鐘，循環(huán)1次(1) 變性94 1分鐘 (2)退火54 1分鐘 延伸 72 1分鐘循環(huán)30次(3)終延伸 72 7分鐘循環(huán)1次161.2 耐熱DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 ：1988年Saiki等人將Taq DNA聚合酶成功應(yīng)用于PCR擴增技術(shù)。Tth DNA聚合酶是由嗜熱水生菌Tli DNA聚合酶 PfuDNA聚合酶 17Taq DNA poly-meraseTaq DNA聚合酶(Taq DNA poly-meras

8、e)是從嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)中別離獲得的,該酶基因全長2496個堿基對,編碼832個氨基酸,酶蛋白相對分子量為9.4104,在7075活性最高,即或在95高溫仍具有活性,因此無需在每一循環(huán)反應(yīng)中再加酶。在正常反應(yīng)條件下,經(jīng)過2530個擴增循環(huán)(即擴增倍數(shù)到達106)后,Taq DNA聚合酶量便成為了反應(yīng)進行的制約因素,如需繼續(xù)擴增,要將產(chǎn)物DNA樣品稀釋100010000倍,作為模板再進行新的PCR擴增反應(yīng)。和其他聚合酶一樣,TaqDNA聚合酶也是Mg2+依賴酶,對Mg2+濃度十分敏感。18Pfu DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶是從嗜熱菌Pyrococcus fu

9、riosis中別離得到的,稱高保真耐高溫DNA聚合酶,能夠糾正PCR擴增中發(fā)生的核昔酸錯誤。該酶比Taq DNA聚合酶及其變體錯誤率低10倍,Pfu DNA聚合酶的超常糾錯功能是由該酶性質(zhì)決定的,其他耐熱DNA聚合酶與Pfu DNA聚合酶合用可以局部降低錯誤率,但達不到單獨使用該酶的效果。然而Pfu DNA聚合酶擴增率低于Taq DNA聚合酶,這是由于該酶具有35外切酶活性。 191.3 引物設(shè)計 引物(primer)是指與待擴增靶DNA區(qū)兩端序列互補的人工合成寡核苷酸片段,包括引物1和引物2,引物1稱為Watson引物,是5端與正義鏈互補的寡核苷酸,用于擴增編碼鏈或mRNA鏈;引物2稱為Cr

10、ick引物,是3端與反義鏈互補的寡核苷酸,用于擴增DNA模板鏈或反密碼鏈。PCR擴增成功的關(guān)鍵因素之一是引物的設(shè)計,它將直接影響擴增產(chǎn)物的大小、位置及擴增區(qū)的Tm值。引物設(shè)計的目的是要在擴增特異性和擴增效率間取得平衡。20引物的長度一般以1530bp為宜,兩個引物與模板DNA結(jié)合點間的距離決定了待擴段的長度。GC含量和Tm,一般認為G+C含量在45%55%較好。引物末端的核苷酸 引物與非擴增區(qū)的同源性 簡并引物 嵌套式引物 211.4 PCR技術(shù)的新進展反向PCR (inverse PCR,IPCR) 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 定量PCR DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR 不對稱PCR (asy

11、mmetric PCR) 多重PCR 免疫PCR 221 反向PCR (inverse PCR,IPCR) 采用靶DNA片段無酶切位點的一種限制性內(nèi)切酶,在靶DNA片段兩外側(cè)一定位置進行酶切,獲得小于23kb的DNA片段,進行自身環(huán)化連接,依特定靶DNA片段兩端外側(cè)序列互補的原則設(shè)計一對引物,經(jīng)PCR擴增后,通過引物與5端互補結(jié)合,使得靶DNA片段兩側(cè)未知序列被擴增,擴增片段大小取決于酶切位點和靶DNA片段間的距離。 232 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用于直接擴增經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為CDNA的特定RNA序列的PCR方法稱為RT-PC方法。此方法敏感度極高,且簡單易行。目前許多公司設(shè)計了多種形式的RT-

12、PCR試劑盒,使用十分方便,例如一步法RT-PCR試劑盒,利用SuperScript逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶的混合體系,所有反應(yīng)在一個試管內(nèi)完成,靈敏度極高,只需0.1pg總RNA便可擴增3.5kb的CDNA片段;高溫反轉(zhuǎn)錄-PCR系統(tǒng)采用熱穩(wěn)定型RNAaseH-反轉(zhuǎn)錄酶,可在70條件下完成反轉(zhuǎn)錄過程,最長可反轉(zhuǎn)錄12kb的CDNA分子。 243 定量PCR定量PCR主要分為DNA-PCR和mRNA-PCR定量兩類。DNA-PCR采用同位素或熒光等標記經(jīng)電泳別離的PCR擴增產(chǎn)物,進行自顯影后根據(jù)底片的曝光強弱對模板DNA進行定量。本實驗需預(yù)先采用濃度的標準DNA模板,在PCR擴增后測定放射

13、性并繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線確定擴增產(chǎn)物量。mRNA-PCR需先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得CDNA后再進行PCR擴增,采取同DNA-PCR定量的方法確定RNA數(shù)量,這種方法由于誤差原因只能作為相對定量。 254 DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性是一種簡單易行鑒定擴增DNA序列變化的技術(shù),1989年Orita等發(fā)現(xiàn)單鏈DNA在進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時,遷移率與一級序列密切相關(guān),這說明序列的微小變化會極大影響其構(gòu)象。這是一種單鏈DNA凝膠電泳技術(shù),根據(jù)形成不同構(gòu)象等長DNA單鏈在非變性聚丙酷膠凝膠電泳時遷移率的變化來檢測基因的變異。 265 不對稱PCR (asymmetric PCR)

14、不對稱PCR是一種專用于制備單鏈DNA的不對稱PCR技術(shù),這種方法使用兩種濃度差100倍的引物,低濃度的稱為限制引物,在限制引物用盡前,PCR擴增產(chǎn)物為雙鏈DNA,其數(shù)量呈指數(shù)上升,經(jīng)約25個循環(huán)限制引物用盡只存在高濃度引物的條件下,PCR擴增產(chǎn)物為雙鏈DNA的一條鏈,數(shù)量呈線性增加,不對稱PCR技術(shù)可用于DNA序列測定。 276 多重PCR 在同一試管內(nèi)參加多對引物,擴增同一模板的若干部位,如基因某段缺失則電泳條帶會有相應(yīng)消失,多重PCR最多可同時擴增12條區(qū)帶。這種技術(shù)已用于地中海貧血等疾病的基因診斷中。 287 免疫PCR免疫PCR是一種檢測PCR產(chǎn)物的ELISA方法,用于抗原檢測。采用

15、PCR擴增的DNA分子代替ELISA中的酶以放大檢出信號,連接分子將DNA和抗體連接,因此可用擴增的DNA量來反映抗原的量,從而顯著提高檢測抗原的靈敏度。292 DNA的序列測定現(xiàn)在測定DNA序列主要有兩類方法：Sanger等提出的酶法。Maxam及Gilbert提出的化學(xué)降解法。兩種方法盡管大相徑庭,但結(jié)果卻是一致的。3020世紀70年代兩種方法剛問世時,化學(xué)方法測序重現(xiàn)率高,較易操作,只需高質(zhì)量的化學(xué)試劑,因此為多數(shù)研究人員所接受。而酶法需單鏈DNA模板和特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的聚合酶,操作較復(fù)雜。隨著M13噬菌體和載體的開展,引物合成日漸方便及測序技術(shù)的日臻完善,目前主要采用Sang

16、er等創(chuàng)造的酶法測序。Sanger,Maxam和Gilber共同獲得了1979年的諾貝爾化學(xué)獎。312.1 Sanger雙脫氧鏈終止法 Sanger雙脫氧鏈終止法由英國劍橋大學(xué)Sanger等于1977年創(chuàng)造。 其根本原理是DNA聚合酶具有兩種酶催化反應(yīng)的特點:能夠利用單鏈DNA作模板合成出DNA互補鏈;能夠利用2,3-雙脫氧核苷三磷酸作為底物,使之摻入到寡核苷酸鏈的3-未端,從而導(dǎo)致DNA鏈的終止。32現(xiàn)在采用的鏈終止法是在加減法基礎(chǔ)上開展起來的,加減法的創(chuàng)新點在于:在DNA聚合酶的作用下進行引物延伸反應(yīng);堿基特異的鏈終止;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳別離僅差一個核苷酸的單鏈DNA。由于此方法操作復(fù)

17、雜使多數(shù)研究人員難以接受。Sanger等將雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)作為鏈終止物引入上述方法后,此方法才獲得技術(shù)的突破進展,使其獲得廣泛使用。 332.2 Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法 此方法1977年由美國哈佛大學(xué)的Maxam和Gilbert創(chuàng)造,是基于體外研究Lac操縱子中阻抑物與操縱基因相互作用而開展起來的,最大優(yōu)點是可以探測DNA構(gòu)象和蛋白質(zhì)的相互作用。34其根本原理是用特定化學(xué)試劑處理末端標記的DNA片段,形成對堿基的特異性切割,從而產(chǎn)生一組具有不同長度DNA鏈的反應(yīng)混合物,進行凝膠電泳后可根據(jù)X光片顯示的相應(yīng)條帶,讀出待測DNA片段的序列。本方法的成敗取決于兩步降解反應(yīng)

18、的特異性,第一步先對特定堿基進行化學(xué)修飾;第二步為修飾堿基從糖環(huán)脫落,修飾堿基5和3的磷酸二酯鍵斷裂。 352.3 DNA測序技術(shù)的若干進展PCR測序：隨著PCR擴增技術(shù)的開展,可以從克隆質(zhì)粒或染色體DNA中擴增得到DNA測序的模板,并直接進行測序。熱循環(huán)測序法：根本原理和不對稱PCR相似,利用耐熱DNA聚合酶的耐熱性,通過退火延伸變性的循環(huán)變換使測序模板得以線性擴增。 362.4 DNA自動測序近年來基于雙脫氧鏈終止法開展了自動序列測定。采用非同位素標記方法如洋地黃毒苷(digoxigenin)標記、熒光標記和生物素標記等,目前測序主要采用熒光標記。自動測序標記方法主要有3種:引物末端標記法

19、、dNTP標記法和ddNTP標記法。 373 基因文庫的構(gòu)建基因文庫是指通過基因克隆的方法,在特定的宿主體系中保存許多DNA分子的混合物。在這些分子中插入的DNA片段總和代表了某種生物的全部基因組序列或全部mRNA序列,因此基因文庫分為基因組文庫和CDNA文庫。 383.1 基因組文庫 基因組文庫是包含有某物種全部基因隨機片段的重組DNA克隆的集合體。構(gòu)建時需首先提取細胞(真核或原核)染色體DNA,經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶酶切后,成為具有一定大小范圍的片段,與選擇的適當(dāng)載體連接后,經(jīng)體外包裝并轉(zhuǎn)染細菌,得到含不同DNA片段的重組噬菌體顆粒,由于其包括了所需基因組的全部基因片段,因此構(gòu)成了基因組文庫。

20、 39基因組文庫構(gòu)建過程 選擇載體。構(gòu)建文庫常用載體主要有3種:噬菌體、黏粒和YAC載體系統(tǒng)。外源 DNA。用于構(gòu)建基因文庫的外源DNA需較長,以噬菌體為載體時DNA長度至少為9Okb,對黏粒載體最低為200kb,而采用YAC載體時則更大,操作時要盡量防止機械剪切。連接及包裝。外源DNA片段與噬菌體載體間連接主要受兩種因素影響,插入片段與載體兩臂濃度比、每種DNA分子濃度。 403.2 CDNA文庫 通過逆轉(zhuǎn)錄酶將各種mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)镃DNA,與適當(dāng)載體連接重組后導(dǎo)入宿主保存,從而構(gòu)建成包含某種生物所有基因編碼序列的CDNA基因文庫。CDNA文庫分為表達型和非表達型兩類。41表達型CDNA文庫采

21、用表達型載體,插入的CDNA可表達為具有免疫活性或生物活性的融合蛋白,這類庫適用于氨基酸序列不完全清楚的蛋白質(zhì),不能用核苷酸探針篩選的目的基因,只能采用與表達產(chǎn)物可發(fā)生特異結(jié)合的抗體或化合物進行標記篩選。非表達型CDNA文庫適用于蛋白質(zhì)氨基酸序列。從而可用核苷酸探針進行雜交篩庫的基因 。 42CDNA基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建主要包括：mRNA的別離合成CDNA第一鏈合成CDNA第二鏈將雙鏈DNA連接至質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主細胞進行增殖。 431 mRNA的別離 研究顯示每一種真核mRNA的3端均有poly (A),將oligo (dT)結(jié)合于纖維素或瓊脂糖后裝柱,細胞總RNA通過該柱后

22、,基于mRNA的poly (A)和oligo (dT)序列雜交而黏附于纖維素(或瓊脂糖),非結(jié)合的rRNA和tRNA流出柱,先以100mmol/L NaCl洗柱以除去rRNA和tRNA,再用10mmol/L Tris-1mmol/L EDTA進行洗脫,使poly (A)和oligo (dT)解離,從而別離獲得純mRNA。442 合成CDNA第一鏈CDNA第一鏈的合成采用的方法一種是oligo(dT)引導(dǎo)的CDNA合成法。由1220個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)與mRNA混合后同poly(A)雜交,作為引物引導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄酶依m(xù)RNA模板合成CDNA第一條鏈,反應(yīng)產(chǎn)物是一種RNA-DNA雜

23、交分子。453 合成CDNA第二鏈將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈CDNA。主要采用如下幾種方法。自我引導(dǎo)合成法。 RNaseH酶降解取代法。 外加引物合成法。 46CDNA的克隆 接頭克隆。引物-接頭克隆。 同聚尾克隆。 Okayama-Berg載體克隆。 單鏈載體克隆。 mRNA-CDNA克隆。 47噬菌體文庫的擴增 將包裝混合液與適當(dāng)菌體混合并涂布于NZCYM瓊脂平板,37培養(yǎng)約10h,參加噬斑稀釋緩沖液(SM液)收集擴增文庫。噬菌體被包裝后要立即進行擴增。 48三：基因工程常用的工具酶491 核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)是一類

24、能夠識別雙鏈DNA分子上某段特定核苷酸序列,并在該序列中進行切割的核酸內(nèi)切酶,主要存在于原核微生物中o而在宿主菌中可識別相同序列的DNA甲基化酶只對本宿主DNA進行甲基化修飾,從而防止了內(nèi)切酶對宿主DNA的作用,構(gòu)成了原核微生物限制-修飾-保護機理的分子基礎(chǔ)。502 DNA連接酶DNA連接酶(DNAlipse)是催化DNA分子中5磷酸基與3起基間形成磷酸二酶鍵的酶,DNA連接酶的作用需要ATP或NAD+作為輔助因子。DNA連接酶的底物可以是帶缺刻的DNA、黏端DNA或平端DNA,連接效率依次降低。DNA連接酶有兩種來源,一種是大腸桿菌的DNA連接酶,以NAD+作為能源;另一種為T4噬菌體DNA

25、連接酶,以ATP為能源,兩種酶作用機理相同。513 DNA聚合酶DNA聚合酶(DNA polymerase)的共同特點是能夠?qū)⒚撗鹾颂呛塑账徇B續(xù)加至雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,但不從引物模板解離。該酶催化反應(yīng)時必須具備DNA模板、3-OH的引物及其他必需因子,合成DNA的方向是53。在基因工程中應(yīng)用較多的DNA聚合酶主要有大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA酶I的大片段(Klenow酶)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶等。 524 核酸修飾酶 1 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, BAP)主要有兩種,一種來自大腸桿菌稱細菌

26、堿性磷酸酶,另一種別離自小牛腸,稱為小牛腸堿性磷酸酶。該酶是在堿性條件下具有活性的磷酸單酯酶,可除去DNA線性分子末端的5-磷酸基,以防止片段間彼此相連。克隆載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后,為防止自身連接,需用此酶處理脫去5-磷酸基。DNA和RNA片段進行5端標記前需用該酶脫磷。532 T4多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)從T4噬菌體感染的大腸桿菌中別離獲得,是催化-磷酸基從ATP轉(zhuǎn)移到DNA、RNA、寡核苷酸或核苷3-磷酸等分子的5-羥基末端的酶。可用于DNA的5-羥基標記；使缺失5-P末端的DNA或寡核苷酸磷酸化。54四：基因表達的主要體系 551 原核表達體系 原核生物

27、細胞結(jié)構(gòu)的主要特征是不具核模,核物質(zhì)裸露,沒有有絲分裂過程,如細菌、放線菌等為原核生物。近年來原核生物特別是大腸桿菌對基因工程的開展已經(jīng)并繼續(xù)起到重要的作用,其他表達體系如芽孢桿菌、鏈霉菌等也有極大開展。561.1 大腸桿菌大腸桿菌體系的特點：作為細菌其繁殖能力極強,平均2030min即可繁殖一代,適于大規(guī)模培養(yǎng),本錢較低;外源基因表達水平較高,可達總蛋白5%30%;下游技術(shù)成熟,較易控制。其主要缺點在于:缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng),特別是缺少糖基化功能,鑒于許多活性蛋白生物活性和糖基化密切相關(guān),例如促紅細胞生成素(EPO)不能在本體系進行表達;大腸桿菌具有內(nèi)毒素、熱源等不易除去,對蛋白純化帶來一

28、定難度;由于蛋白不能正確折疊,復(fù)性較困難;多形成包含體,因此提取較繁瑣。 57大腸桿菌質(zhì)粒載體pSC101質(zhì)粒載體 ColE1質(zhì)粒載體 pBR322質(zhì)粒載體 pUC質(zhì)粒載體 581.2 芽孢桿菌 優(yōu)點采用天然感受態(tài)細胞容易進行轉(zhuǎn)化。枯草芽孢桿菌遺傳學(xué)研究深入。該菌在實驗室易于進行操作?？莶菅挎邨U菌基因組序列測定已經(jīng)完成。已有許多有用的質(zhì)粒載體。能夠?qū)⒌鞍追置谥僚囵B(yǎng)基。具有若干種有價值的信號膚序列。有成熟的發(fā)酵工藝。采用廉價的菌種保存方法菌種可有效生長。缺乏點工業(yè)菌株不易被轉(zhuǎn)化。酶連接液的轉(zhuǎn)化率低。大多數(shù)異源蛋白分泌表達低且存在被降解的問題。對發(fā)酵過程的有關(guān)遺傳和生理過程缺乏了解。591.3 鏈

29、霉菌 優(yōu)點: 對人畜根本無致病性近年來分子遺傳學(xué)研究取得顯著進展,已開展了一大批具有實用價值的載體質(zhì)粒;天藍色鏈霉菌的基因組序列測定已根本完成;具有強的外泌能力,有利于重組蛋白的別離純化;表達的蛋白根本能正確折疊,不形成包含體;變鉛青鏈霉菌是一種限制修飾作用弱的菌種,適于進行異源基因表達它是重要的工業(yè)微生物,下游技術(shù)成熟。缺乏:對其分子生物學(xué)研究不如大腸桿菌深入,尚需進一步加強;對外源基因表達的影響因素,特別是分泌機理等還需進行系統(tǒng)研究。 602真核生物表達體系 612.1 酵母表達體系以往多采用釀酒酵母作為表達體系,但近年來已根本被畢赤酵母所替代 作為表達體系該菌具有如下特點:是真核表達體系

30、,對表達的蛋白可進行折疊和翻譯后修飾;表達量高較其他真核表達體系本錢低,只需含鹽的簡單培養(yǎng)基;適于高密度培養(yǎng);雜蛋白較少,產(chǎn)物純化較易。622.2 昆蟲細胞表達體系具有完整的感染性,昆蟲病毒載體的重組區(qū)是基因組的非必需區(qū),即使缺失也不會影響病毒的復(fù)制和表達,保持了昆蟲桿狀病毒載體的完整感染性。容量大,由于昆蟲桿狀病毒的包含體蛋白可以延伸,因此容納外源DNA能力大,可達100kb標記顯著。在多角體蛋白基因區(qū)插入外源基因后,失去了多角體蛋白的空斑較易識別。表達產(chǎn)物可以被分泌表達。表達水平較高,外源基因置于多角病毒蛋白啟動子控制下,由于啟動子強,使外源蛋白表達量可達細胞總蛋白的50%,最高的可達幾毫

31、克/毫升。能有效進行翻譯后加工,可糖基化。宿主嚴格,對脊椎動物和植物無害,平安性好。細胞可連續(xù)傳代,2530培養(yǎng)無需二氧化碳?？蓱腋∨囵B(yǎng),適于規(guī)模化,BmNPV宿主窄,家蠶易于飼養(yǎng),可以大規(guī)模元菌飼養(yǎng),便于大量表達異源基因。可用于有細胞毒的重組蛋白表達。632.3 哺乳動物細胞表達體系許多哺乳動物細胞可以作為基因表達體系,其中以中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和猴腎細胞(COS)使用最多。CHO細胞屬成纖維細胞,該細胞缺乏二氫葉酸復(fù)原酶(DHFR),經(jīng)轉(zhuǎn)染可將DHFR重組至細胞中,含有DHFR表達載體的重組CHO細胞,經(jīng)氨甲喋嶺(MTX)培養(yǎng)篩選后可選擇出克隆表達異源基因的重組細胞。哺乳動物細胞表達

32、外源基因的主要優(yōu)點是能識別和剪切外源基因中的內(nèi)含子并加工為成熟的mRNA。642.3.1 哺乳動物細胞主要載體SV40衍生載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。腺病毒載體(AV)。腺相關(guān)病毒載體(AAV)。痘苗病毒載體(VV)。65五：轉(zhuǎn)基因動物 將人或哺乳動物的特定基因?qū)瞬溉閯游锸芫?該基因若能與受精卵染色體DNA整合,當(dāng)細胞分裂時染色體倍增,基因隨之倍增,從而使每個細胞都帶有導(dǎo)人的基因且能穩(wěn)定遺傳,這種新個體稱為轉(zhuǎn)基因動物 。661 開展概況近年來轉(zhuǎn)基因動物研究開展迅速,利用其作為生物反應(yīng)器可以大量生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥物,如細胞因子、抗體、激素等,也可以作為疾病的實驗動物模型進行新藥研究及疾病機理研究,為

33、嚴重疾病的預(yù)防和治療提供了重要基礎(chǔ),此外還可能為人體器官移植創(chuàng)造條件,因此本領(lǐng)域研究獲世人關(guān)注。例如荷蘭Phraming公司將乳鐵蛋白基因和促紅細胞生成素基因成功轉(zhuǎn)入牛乳腺,從而獲得了這兩種重組藥用蛋白；荷蘭還獲得了轉(zhuǎn)基因豬產(chǎn)生人凝血因子;英國PPL公司成功研制出產(chǎn)生-抗膜蛋白酶的轉(zhuǎn)基因羊和產(chǎn)生應(yīng)因子的轉(zhuǎn)基因綿羊；美國GTP公司獲得了凝血酶原的轉(zhuǎn)基因羊。672 轉(zhuǎn)基因技術(shù)核移植技術(shù)核移植和基因打靶技術(shù)的結(jié)合68六 轉(zhuǎn)基因植物采用基因工程植物病毒作為載體,可以瞬時高效表達大量外源基因,較農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系有明顯優(yōu)勢：病毒增殖快使外源基因伴之能高水平表達；植物病毒基因組小易于進行遺傳操作；植物病毒可侵

34、染單子葉等農(nóng)桿菌非寄生植物,因此擴大了基因工程適用范圍。現(xiàn)已開展了多種植物病毒載體構(gòu)建策略,包括基因插入、基因取代、融合抗原和基因互補等。已有幾十種植物病毒被改造成不同類型外源基因表達載體,如椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)、區(qū)豆花葉病毒(CPMV)等,其中采用TMV載體已成功表達了超過150種蛋白多肽。利用融合抗原表達方法已使如癥疾、口蹄疫、鼻病毒、人免疫缺陷性病毒(HIV)抗原決定簇的嵌合外殼蛋白等獲成功表達,為疫苗生產(chǎn)提供了一種重要途徑。 69第七節(jié) 基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程主要包括：(1)通過搖瓶操作了解工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳

35、氮比,分析表達產(chǎn)物的合成、積累對受體細胞的影響；(2)通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式常用的有：補料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)。1、補料分批培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng),經(jīng)過一段時間后,間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基,使菌體進一步生長的培養(yǎng)方式。702、連續(xù)培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中,攪拌培養(yǎng)至一定濃度后,開動進料和出料的蠕動泵,以控制一定稀釋率進行不間斷的培養(yǎng)。3、透析培養(yǎng)利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基別離,通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除對生產(chǎn)菌的不利影響。4、固定化培養(yǎng)二、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌的發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)的微生物

36、發(fā)酵工藝的區(qū)別：(1)生物材料方面(2)生產(chǎn)目的方面1、培養(yǎng)基的影響常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。71常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解產(chǎn)物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。另外還要加一些無機鹽、微量元素、維生素、生物素等。對營養(yǎng)缺陷型菌株還要補加相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)。2、接種量的影響接種量是指移入的種子液體和培養(yǎng)液體積的比例。接種量小,不利于外源基因的表達,大接種量有利于對基質(zhì)的利用,縮短生長延遲期,并使生產(chǎn)菌能迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境,減少污染時機,但接種量過高又會抑制后期菌體的生長。所以接種量大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中的生長繁殖速度。3、溫度的影響溫度對基因表達的調(diào)

37、控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子的合成水平上。72在復(fù)制水平上,可通過調(diào)控復(fù)制,改變基因拷貝數(shù),影響基因表達；在轉(zhuǎn)錄水平上,可通過影響RNA聚合酶的作用或修飾RNA聚合酶,來調(diào)控基因表達；溫度也可在mRNA復(fù)制和翻譯水平上影響基因表達,溫度還可能通過細胞內(nèi)小分子調(diào)節(jié)分子的量而影響基因表達,也可通過影響細胞內(nèi)ppGpp量調(diào)控一系列基因表達。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。4、溶解氧的影響溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個重要參數(shù),對菌體的生長和產(chǎn)物的生成影響很大。外源基因的高效表達和翻譯需要維持較高水平的O2值。通常采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法,可以改善培養(yǎng)過程中的氧供

38、給,提高活菌產(chǎn)量。735、誘導(dǎo)時機的影響一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達。6、pH的影響pH對細胞的正常生長和外源蛋白的高效表達都有影響,所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況,對pH進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)?？傊?工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化對異源蛋白的表達關(guān)系重大,必須建立最正確化工藝。三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備發(fā)酵罐的組成局部有：發(fā)酵罐體、保證高傳導(dǎo)作用的攪拌器、精細的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無菌過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測量與控制系統(tǒng)以及培養(yǎng)液配置及連續(xù)操作裝置等。74第八節(jié) 基因工程藥物的別離純化許多醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品都是活性肽或蛋白質(zhì)。這些產(chǎn)品的制得具有以下特點：(1)目的產(chǎn)物在初始物料中含量

39、較低(2)含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜,且影響較大(3)目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差(4)種類繁多(5)應(yīng)用面廣,對其質(zhì)量、純度要求高,甚至要求無菌、無熱原等。因此,為了獲得合格得目的產(chǎn)物,必須建立與上述特點相適應(yīng)的醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的別離純化工藝。75一、建立別離純化工藝的依據(jù)1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點：包括(1)菌種類型及其代謝特性(2)原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量(3)生產(chǎn)工藝和條件(4)初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)3、目的產(chǎn)物特性4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求二、別離純化的根本過程別離純化是基因工程藥物生產(chǎn)中極其重要的一環(huán)。一般不應(yīng)超過45個步驟,包括細胞破碎、固液別離、濃

40、縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。76三、別離純化的技術(shù)別離純化技術(shù)應(yīng)滿足以下要求：(1)技術(shù)條件要溫和(2)選擇性要好(3)收率要高(4)兩個技術(shù)之間要能直接銜接(5)整個別離純化過程要快1、細胞破碎與固液別離：有細胞收集、細胞破碎和細胞碎片別離等步驟。(1)細胞收集：細胞收集常用的是離心別離的方法,液膜過濾法逐步得到廣泛應(yīng)用。(2)細胞破碎：有機械破碎法和非機械破碎法。機械破碎法：高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法非機械破碎法：酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法等。77(3)固液別離：離心沉淀是固液別離的主要手段,包括高速離心和超速離心。常用的液膜過濾技術(shù)

41、有微濾、超濾和反滲透等。2、目的產(chǎn)物的別離純化主要依賴色譜別離方法。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜。親和色譜、凝膠色譜、高壓液相色譜等。蛋白質(zhì)純化方法的設(shè)計通常根據(jù)產(chǎn)物分子的物理、化學(xué)參數(shù)和生物學(xué)特性。選擇純化方法應(yīng)根據(jù)目的蛋白質(zhì)和雜蛋白的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異,尤其重要的是外表性質(zhì)的差異。78(1)離子交換色譜根本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換,從而到達別離的目的。蛋白質(zhì)的等電點和外表電荷的分布主要影響其離子交換的性能,影響蛋白質(zhì)離子交換色譜保存的其他因素,還有交換基團和交換介質(zhì)的種類、吸附和洗脫的條件等。(2)反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來別離純化的。(3)親和色譜是利用固定化配基與