促排卵藥物對小鼠胚胎發(fā)育影響及機制的研究

1、獨 創(chuàng) 性 聲 明秉承學校嚴謹?shù)膶W風與優(yōu)良的科學道德，本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，不包含本人或他人已申請學位或其他用途使用過的成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何奉獻均已在論文中作了明確的說明并表示了致謝。申請學位論文與資料假設(shè)有不實之處，本人承當一切相關(guān)責任。論文作者簽名：日期：保 護 知 識 產(chǎn) 權(quán) 聲 明本人完全了解第四軍醫(yī)大學有關(guān)保護知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬第四軍醫(yī)大學。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用

2、論文工作成果時署名單位仍然為第四軍醫(yī)大學。學校可以公布論文的全部或局部內(nèi)容含電子版，保密內(nèi)容除外，可以采用影印，縮印或其他復(fù)制手段保存論文。學校有權(quán)允許論文被查閱和借閱，并在校園網(wǎng)上提供論文內(nèi)容的瀏覽和下載效勞。同意學校將論文參加?中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫?和編入?中國知識資源總庫?，同意按?中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫出版章程?規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：日期：促排卵藥物對小鼠胚胎發(fā)育的影響及機制研究研 究 生：尉春華學科專業(yè)：婦產(chǎn)科學生殖醫(yī)學所在單位：中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科導(dǎo)師：姚元慶教授主任醫(yī)師輔導(dǎo)教師：王莉博士資助基金工程：國家重點根底研究開展方案課題編號

3、 2007CB948102關(guān)鍵詞：輔助生殖技術(shù) 超排卵 胚胎 植入前 評估 IL-6中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學2021 年 5 月第四軍醫(yī)大學博士學位論文目錄縮略語表 1中文摘要 4英文摘要 8前言 13文獻回憶 15正文 31實驗一 促排卵對小鼠胚胎發(fā)育的影響 31實驗二 促排卵對小鼠囊胚基因表達譜的影響 46實驗三 促排卵對 IL-6 分泌的影響 60小結(jié) 71參考文獻 73個人簡歷和研究成果 92致謝 93第四軍醫(yī)大學博士學位論文縮略語表縮略詞ARTPGDCOHIVF-ETICSIEDTA英文全稱Assisted Reproductive TechnologyPreimplantatio

4、n Genetic DiagnosisControlled Ovarian HyperstimulationIn-Vitro Fertilization And Embryo TransferIntracytoplasmic Sperm InjectionEthylenediaminetetraacetate中文全稱輔助生殖技術(shù)著床前胚胎遺傳學診斷控制性超排卵體外授精卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)乙二胺四醋酸GnRHaGonadotropinAnalogueReleasingHormone 促 性 腺 激 素 釋 放 激 素 興奮劑PCRFISHGnAICOHOHSSPCOSeCGPMSGhCGPol

5、ymerase Chain ReactionFluorescence In Situ HybridizationGonadotropinArtificial InseminationControlled Ovarian HyperstimulationOvarian Hyperstimulation SyndromePolycystic Ovary SyndromeEquine Chorionic GonadotropinPregnant MareS Serum GonadotrophinHuman Chorionic Gonadotrophin-1-聚合酶鏈反響熒光原位雜交促性腺激素人工授精

6、控制性超排卵卵巢過度刺激綜合征多囊卵巢綜合征馬絨毛膜促性腺激素孕馬血清促性腺激素人絨毛膜促性腺激素第四軍醫(yī)大學博士學位論文ECDFSCGHBWSASCOCsPBSBSAFSHDPCEarly CleavageDNA-Fragmented SpermatozoaComparative Genomic HybridizationBeckwith-Wiedemann Syndrome,Angelman SyndromeCumulus-Oocyte ComplexPhosphate-Buffered SalineBovine Serum AlbuminFollicle-Stimulating Horm

7、oneDay Post Coitum早期卵裂片段化的 DNA 精子比擬基因組雜交貝威氏綜合征安格曼癥候群卵丘-卵母細胞復(fù)合體磷酸鹽緩沖液牛血清白蛋白卵泡刺激素交配后的天數(shù)KEGGKyoto EncyclopediaGenomesOfGenesAnd 京都基因與基因組百科全書GOGAPDHRT-PCRTimp-3qRT PCRMAPKECMMMPTGFBIGene OntologyGlyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenaseReversed Transcript Polymerase ChainReactionTissue Inhibitor Of Metall

8、oproteinases-3Quantitative Real-Time PCRMitogen Activated Protein KinaseExtracellular MatrixMetalloproteinasesTransforming Growth Factor Beta Induced-2-基因本體論甘油醛-3-磷酸脫氫酶反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響組織金屬蛋白酶抑制劑- 3實時定量聚合酶鏈反響絲裂原活化蛋白激酶細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶轉(zhuǎn)化生長因子- 誘導(dǎo)第四軍醫(yī)大學博士學位論文MAPKMitogen-Activated Protein Kinase絲裂原活化蛋白激酶EFEMP1Epiderma

9、l Growth Factor Extracellular 表皮生長因子細胞外基質(zhì)Matrix Protein 1 蛋白 1LY96H2-K1IL-6ELISALIFCNTFOSMCLCFLymphocyte Antigen 96Histocompatibility 2, K1, K RegionInterleukin-6Enzyme Linked Immunosorbent AssayLeukaemia Inhibitory FactorCiliary Neurotrophic FactorOncostatin MCardiotrophin-Like Cytokine Factor-3-淋巴

10、細胞抗原 96組織相容性 2 的 k1，k 區(qū)白細胞介素-6酶聯(lián)免疫吸附法白血病抑制因子睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子抑瘤素 M心肌樣細胞因子第四軍醫(yī)大學博士學位論文促排卵藥物對小鼠胚胎發(fā)育的影響及機制研究博士研究生 ：尉春華導(dǎo)師 ：姚元慶教授第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710038中文摘要研 究 背 景 ： 近 30 年 來 ， 輔 助 生 殖 技 術(shù) assisted reproductivetechnology, ART在臨床上的廣泛使用使許多不育不孕夫婦有了自己的親生孩子。但是目前輔助生育技術(shù)的成功率比擬低,而且臨床上 ART后存在多胎妊娠率高引發(fā)高的母嬰病死。如何提高成功率是各個輔助生殖中心

11、所要解決的問題。為此各國生殖機構(gòu)人員致力于研究一種更接近生理過程的單個囊胚移植,希望能有效提高妊娠率、降低多胎率。目前胚胎評估的方法還主要是采用形態(tài)學評估，因為是人為操作評估，難免有主觀因素介入。著床前胚胎遺傳學診斷 preimplantationgenetic diagnosis，PGD那么對胚胎有損傷。因而繼續(xù)尋找無創(chuàng)的、客觀量化的胚胎評估方法預(yù)測胚胎發(fā)育潛能成為目前生殖醫(yī)學領(lǐng)域面臨的問題之一。超排卵 controlled ovarian hyperstimulation, COH是體外受精-胚胎移植 in-vitro fertilization and embryo transfer ,

12、 IVF-ET技術(shù)中非常重要的方法, 能募集卵母細胞，獲得恰當數(shù)量的囊胚,為體外受精-胚胎移植技術(shù)廣泛順利開展提供了前提和保障。令人失望的是體外授精的受精率和卵裂率比擬高，但是移植成功率很低，IVF胚胎多數(shù)發(fā)生移-4-第四軍醫(yī)大學博士學位論文植失敗，只有少數(shù)胚胎能發(fā)育到活產(chǎn)。而且超排卵導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低，妊娠率明顯下降，胚胎質(zhì)量降低。目前，超排卵影響胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能的機制尚不明確，需要對其進行深入研究。說明促排卵藥物對胚胎發(fā)育的影響及其可能的機制，為尋找有效的生物學標記物進行準確預(yù)測胚胎發(fā)育潛能提供了理論根底。研究目的： 1 采用 ICR 小鼠模型，通過體內(nèi)體外實驗體系，研究超排卵對囊胚

13、發(fā)育、胚胎植入的影響。2 通過基因芯片的方法，研究超排卵對小鼠囊胚基因表達譜的影響。3 根據(jù)基因芯片的結(jié)果，選擇編碼分泌蛋白的差異基因，通過 ELISA 方法驗證胚胎培養(yǎng)液中其分泌蛋白水平的變化，從而為開展早期胚胎的無創(chuàng)性臨床診斷提供新思路。研究方法： 1 通過超排卵受孕與自然受孕獲取囊胚，采用體視顯微鏡進行囊胚形態(tài)學觀察，測量囊胚直徑并分級。2 采用小鼠胚胎植入的體外模型，通過建立囊胚和子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)體系，在 24h,48h 和72h 采用體視顯微鏡觀察，比擬自然受孕和超排受孕的囊胚在孵化、黏附和擴展方面的差異。3 應(yīng)用基因芯片雜交技術(shù)，研究超排卵對囊胚基因表達譜的影響。數(shù)據(jù)采用聚類分析、基

14、因本體論Gene Ontology,GO分析和京都基因與基因組百科全書Kyoto Encyclopedia Of Genes AndGenomes, KEGG)分析等方法進行處理。4 通過實時定量聚合酶鏈反響 quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT PCR鑒定隨機選取的 14 個差異表達基因。5 在差異基因中尋找編碼分泌蛋白的基因，采用酶聯(lián)免疫吸附法Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA法檢測超排組和對照組胚胎培養(yǎng)液中 IL-6 蛋白的含量。結(jié)果： 1 通過測量囊胚的直徑，發(fā)現(xiàn)超排組囊

15、胚的直徑為m，與對照組m相比明顯減小，統(tǒng)計結(jié)果表 明 差 異 非 常 顯 著 。 此 外 ， 超 排 卵 組 囊 胚 細 胞 總 數(shù)-5-第四軍醫(yī)大學博士學位論文亦明顯少于對照組囊胚細胞總數(shù)。形態(tài)學觀察進一步發(fā)現(xiàn)，超排組中三級囊胚數(shù)為，對照組為，差異具有非常顯著性意義。2 采用囊胚/子宮上皮細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察 24h,48h 和 72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，超排卵對胚泡孵化，黏附和擴展的影響不大，兩者差異無統(tǒng)計學意義。3 基因芯片雜交結(jié)果顯示，和對照組相比，超排組囊胚一共有 180個差異表達基因 ( 倍, p0.01)，其中有 108 個基因表達下調(diào)，72基因表達上調(diào)。有 5 個編碼分泌型

16、蛋白的基因差異表達 IL-6、Efemp1、H2-K1、Ly96 和 Tgfbi, 其中 IL-6， Efemp1 和 Tgfbi 的功能是與胚胎發(fā)育相關(guān)的。4 qRT-PCR 結(jié)果顯示，隨機挑選的 14 個差異基因表達變化與相應(yīng)的微陣列實驗結(jié)果相一致。5 體外培養(yǎng)胚胎從 發(fā)育到 時，超排組胚胎培養(yǎng)液中 IL-6 含量為，顯著低于正常組，兩者比擬差異具有非常顯著性意義。并且培養(yǎng)液滴中 IL-6 含量越高，液滴中囊胚形成率越高。結(jié)論：我們結(jié)果證實超排卵對胚胎質(zhì)量和發(fā)育有影響。表現(xiàn)在囊胚直徑減小、囊胚評估等級降低、但是胚胎植入能力沒有發(fā)生改變。提示超排卵可能主要影響胚胎日后發(fā)育成胎兒局部的內(nèi)細胞團

17、，進而進一步影響胎兒的發(fā)育。通過我們的研究首次發(fā)現(xiàn)超排卵引起小鼠囊胚 180 個基因表達改變，其中 108 個上調(diào)，72 個下調(diào)，隨機選擇的 14 個基因進行 qRT-PCR鑒定，結(jié)果與基因芯片結(jié)果相一致。研究中我們首次從差異表達的基因中找出了 5 個能編碼分泌蛋白的基因 IL-6， H2-K1， ly96, Efemp1 和 Tgfbi，其中 IL-6， Efemp1 和-6-第四軍醫(yī)大學博士學位論文Tgfbi 這 3 個基因的功能是與胚胎發(fā)育相關(guān)的。通過 ELISA 方法我們驗證了超排卵能夠降低體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育到囊胚時胚胎培養(yǎng)液中IL-6 蛋白的水平，與超排卵降低 IL-6 基因表達相一

18、致。同時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液滴中 IL-6 蛋白含量越高，液滴中囊胚形成率越高?？傊?，差異表達基因的發(fā)現(xiàn)，為促排卵藥物對胚胎發(fā)育的影響提供了可能的機制。與胚胎發(fā)育有關(guān)的差異基因編碼的分泌型蛋白 IL-6的發(fā)現(xiàn)和進一步研究，為尋找有效的生物學標記物進行準確預(yù)測胚胎發(fā)育潛能提供了生物學研究資料。對指導(dǎo)臨床實踐，優(yōu)化 ART 技術(shù)，建立無創(chuàng)性胚胎質(zhì)量評估方法，從而提高臨床的妊娠成功率、減少多胎妊娠率具有重要意義。關(guān)鍵詞: 輔助生殖技術(shù) 超排卵 胚胎 植入前 評估 IL-6-7-第四軍醫(yī)大學博士學位論文Research On The Effect Of Ovarian StimulationDrug On Mi

19、ce Embryo DevelopmentCandidate for: Yu ChunhuaSupervisor: Prof.Yao YuanqingDepartment of Obstetric and Gynecology, Tangdu hospital, Fourth MilitaryMedical University, Xian. 710038, ChinaAbstractBackgroud ： Assisted reproductive technology (ART) has become aneffective treatment for infertility for ne

20、arly three decades. To avoidmulti-pregnancy, great efforts have been made to minimize number of embryostransferred. Since Single-embryo transfer resulted in a lower pregnancy rate.During the last 3 decades, morphological evaluation is the mostly usedmethod to select embryos. Preimplantation genetic

21、diagnosis (PGD) is thealternative, but is limited by its embryo-invassion. Hence, it is necessary todevelop a non-invasive, objective and quantitative biomarker to choose the bestembryo.Ovarian hyperstimulation is routinely used to increase the number of matureoocytes produced per cycle in human-ass

22、isted reproduction techniques.Disappointingly, implantation rates of in vitro fertilized (IVF) embryos are low,in contrast with high fertilization and cleavage rates. The majority of IVFembryos fail to implant, even fewer embryos develop to live birth. It has beenreported that excessive ovarian stim

23、ulation is associated with a significant-8-第四軍醫(yī)大學博士學位論文reduction in pregnancy rate and results in a shift in the window of receptivity inIVF cycles. Ovarian hyperstimulation caused low endometrial receptivity andpossibly poor embryo quality. Little information is available about the geneticbasis of

24、the negative impact of gonadotrophin stimulation on embryodevelopment. More extensive research is required to achieve a more wholeunderstanding of the effection of super-ovulation on embryo, which providedbiological research data for people to find effective biological marker for accurateevaluation

25、of preimplantation embryos.Objectives： 1 To study the effects of superovulation on blastocysts, embryoimplantation in vitro and in vivo by mice modle. 2 To study the effects ofsuperovulation on genes express in mice blastocysts between the superovulatedand control group. 3 To confirm the change of i

26、nterested genes caused bysuperovulation at mRNA and proteins level.Methods: 1 The morphology of mice blastocysts in the superovulated groupand the control groups were observed by microscope, then measure the diametersand evaluation grades of blastocyst. 2 We further used a blastocyst/uterineepitheli

27、al cell co-culture system to observe and compare blastocyst attachment,adhesion and outgrowth at 24h, 48h and 72h by microscopy in the superovulatedgroup with the control groups. 3 Microarray hybridization was applicated todetect gene expression profiling in blastocyst of superovulated group and the

28、control groups. The data were analyzed by hierarchical clustering analysis , geneontogoly (GO) analysis and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) pathway databases.4 Gene expression profiles derived from microarrayanalysis were confirmed quantitatively by real-time RT-PCR analysis for wh

29、ichwe randomly selected 14 genes. 5 At the end of the process, ELISA wasperformed to test the expressions of Il-6 protein in blastocyst culture medium.-9-第四軍醫(yī)大學博士學位論文Results： First, we measured the diameter of blastocysts. The results showedthat diameters of blastocysts from control group were signi

30、ficantly larger thanm, p0.001).Moreover, total cell number of blastocysts from control group was more thanthose from superovulation groum, p0.01).Mophological examination of the blastocysts revealed that there were more grade0.1 per mouse, p0.01).We further used a blastocyst/uterine epithelial cell

31、co-culture system to studythe effects of superovulation on blastocyst implantation. Data were collected atdifferent time (24, 48, and 72 h) after embryos transferred onto the monolayer ofthe uterine epithelial cells. Results showed that, compared to the control group,superovulation had little effect

32、 on blastocyst hatchment, attachment andoutgrowth.Furthermore, A total of 180 genes were differentially expressed between thesuperovulated blastocysts and the natural ovulating blastocysts(1.5fold, p0.01).Totally, 108 out of the 180 genes exhibited down-regulation and the remainderwere up-regulated

33、in the superovulation group. 5 secreted proteins encoded bydifferentially expressed genes ( IL-6, Efemp1, H2-K1, Ly96 and Tgfbiwerefound, in which IL-6,Efemp1 and Tgfbi were associated with embryonicdevelopmentThe fourth, 14 differentially expressed genes were randomly selected andconformed using qR

34、T-PCR. The PCR results showed consistent change in geneexpression as in the corresponding microarray experiments. Fold changes of allthe tested genes were higher by qRT-PCR than results from the microarrayanalysis-10-第四軍醫(yī)大學博士學位論文The last one, From 0.5dpc to 3.5dpc in vitro culture, we found that the

35、content of IL-6 protein in blastocyst culture medium in the superovulation group1.317,P0.01). The more the content of IL-6 protein were in blastocyst culture medium,the more blastocysts formed.Conclusions： These results indicated that superovulation have effect onembryo quality and development, whic

36、h reflected in the reduced diameter of theblastocyst, blastocyst evaluation. But ovarian stimulation did not change thecapacity of embryo implantation. Ovarian stimulation may mainly affect the innercell mass and further affect the fetus developing to term. To our knowledge, It hasbeen the first rep

37、ort that discovered a total of 180 genes were differentiallyexpressed between the superovulated blastocysts and the natural ovulatingblastocysts. Among them, 108 genes exhibited down-regulation and theremainder were up-regulated in the superovulation group. Then we randomlyselected 14 genes for qRT-

38、PCR, the result of qRT-PCR were consistent with thatof the gene chip.We choose five genes (IL-6, H2-K1, ly96, Efemp1 and Tgfbi) that couldencode secreted proteins from the differentially expressed genes, in whichfunctions of IL-6, Efemp1 and Tgfbi were associated with embryonicdevelopment. We also s

39、elected IL-6, which mRNA was down-regulated bysuperovulation, to test the change at protein level in blastocyst culture medium.Using ELISA , we found that the content of IL-6 protein in blastocyst culturemedium in the superovulation group was significantly less than that in the controlgroup, which w

40、as consistent with the result that super-ovulation have reduced thelevel of IL-6 mRNA. At the same time we found that the higher level of IL-6protein present in the blastocyst culture medium, the more blastocysts formed.In short, the discovery of differentially expressed genes caused bysuperovulatio

41、n provides a possible mechanism underlying the negative effect of-11-第四軍醫(yī)大學博士學位論文superovulationonembryoqualityanddevelopment.Theconfirmeddown-regulation of secreted protein IL-6 may help to develop a non-invasiveevaluation method of preimplantation embryos and to improve the rate ofpregnancy and red

42、uce the rate of multiple pregnancy.Key words：ART; Superovulation; Embryos; Preimplantation; Evaluation;IL-6-12-第四軍醫(yī)大學博士學位論文前言近 30 年來，輔助生殖技術(shù) assisted reproductive technology, ART在臨床上的廣泛使用使許多不育不孕夫婦有了自己的親生孩子。但是目前輔助生育技術(shù)的成功率比擬低,而且臨床上 ART 后存在多胎妊娠率高引發(fā)高的母嬰病死率。如何提高成功率是各個輔助生殖中心所要解決的問題。為此各國生殖機構(gòu)人員致力于研究一種更接近生理過程

43、的單個囊胚移植,希望能有效提高妊娠率、降低多胎率。目前胚胎評估的方法還主要是采用形態(tài)學評估，因為是人為操作評估，難免有主觀因素介入。著床前胚胎遺傳學診斷 preimplantationgenetic diagnosis，PGD那么對胚胎有損傷。因而繼續(xù)尋找無創(chuàng)的、客觀量化的胚胎評估方法預(yù)測胚胎發(fā)育潛能成為目前生殖醫(yī)學領(lǐng)域面臨的問題之一。超排卵是體外受精-胚胎移植技術(shù)中非常重要的方法, 能募集卵母細胞和囊胚，為體外受精-胚胎移植技術(shù)廣泛順利開展提供了前提和保障。IL-6 在妊娠中起著重要作用，其不僅參與生殖功能，調(diào)節(jié)生殖活動的各個環(huán)節(jié)，而且在輔助生殖領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。目前，對于促排卵藥物、體外

44、操作如何影響小鼠早期胚胎發(fā)育？促排卵藥物能否造成小鼠胚胎基因組改變？哪些差異基因編碼分泌蛋白？哪種差異基因分泌的蛋白能夠影響胚胎發(fā)育？這些都是未知的，是我們研究的重點。采用基因芯片技術(shù)研究胚胎操作著床前胚胎基因表達譜的變化，篩選并鑒定與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，找出編碼分泌型蛋白的基因，進而從編碼分泌型蛋白的差異表達基因入手研究超排卵對這些基因表達的影響，以及這些分泌型蛋白與胚胎發(fā)育的相關(guān)性，從而了解超排卵和胚胎操作對著床前胚胎發(fā)育及質(zhì)量影響的機制，對其平安性進-13-第四軍醫(yī)大學博士學位論文行評估。通過我們的研究可能發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致健康問題的差異基因，尋找識別發(fā)育異常胚胎的方法，對指導(dǎo)臨床實踐，優(yōu)化 AR

45、T 技術(shù)，建立無創(chuàng)性胚胎質(zhì)量評估方法，從而提高臨床的妊娠成功率、減少多胎妊娠率具有重要意義。-14-第四軍醫(yī)大學博士學位論文文獻回憶ART 是指通過對卵子、精子、受精卵、胚胎的操作處理，實現(xiàn)治療男女不育孕癥的一系列助孕技術(shù)的總稱。是 20 世紀 70 年代興起 的 一 種 治 療 不 育 癥 的 新 方 法 1。 主 要 有 常 規(guī) IVF-ET、 人 工 授 精 artificial insemination，AI、卵胞漿單精子注射 intracytoplasmic sperminjection，ICSI、卵子、精子和胚胎凍融技術(shù)、移植前遺傳學診斷等。主要是 IVF-ET 及其衍生技術(shù)。IL

46、-6 是目前發(fā)現(xiàn)的非類固醇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控因子之一，在生殖細胞的生長、發(fā)育、成熟、受精及胚胎著床、發(fā)育過程中起著重要作用?，F(xiàn)將近年來有關(guān) ART 治療不育癥的進展以及 IL-6 的研究進展作一簡要回憶。1 輔助生殖技術(shù)進展 輔助生殖技術(shù)的概述上世紀 60 年代末，英國婦科學家 Steptoer 和胚胎學家 Edwards開始合作研究人類試管嬰兒。1974 年采用腹腔鏡取卵技術(shù)探索研究了卵子體外受精、胚胎培養(yǎng)及胚胎移植。在 1976 年經(jīng)藥物促排卵后經(jīng)腹腔鏡取卵獲得了第一例妊娠，但是發(fā)生了輸卵管妊娠。至 1978 年Edwards 和 Steptoer 首創(chuàng)的常規(guī)體外受精與胚胎移植，稱為第一代試

47、管嬰兒技術(shù)，終于誕生世界上第一例試管嬰兒。試管嬰兒的問世在生殖醫(yī)學領(lǐng)域樹立了里程碑 1,2。1984 年第 1 例冷凍后復(fù)蘇的胚胎移植嬰兒誕生； 1992 年， Palerm 首先使用技術(shù)難度更高的單精子卵胞漿注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)，被稱為第二代試管嬰兒技術(shù)，治療男性不育。卵胞漿單精子注射受精后胚胎移植嬰兒出生。-15-第四軍醫(yī)大學博士學位論文隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的進步，使人類基因診斷在單細胞水平進行成為可能，結(jié)合輔助生殖的顯微操作技術(shù)，人類 ART 技術(shù)進而開展為胚胎植入前遺傳學診斷，即第三代試管嬰兒技術(shù)。第四代試管嬰兒技術(shù)又叫

48、卵漿置換技術(shù)。目前，隨著核移植技術(shù)不斷開展，采用核移植技術(shù)進行配子重構(gòu)將有可能成為人類生殖醫(yī)學應(yīng)用的新突破。ART在 我 國 起 步 較 晚 ,1982 年 湖 南 醫(yī) 科 大 學 成 功 將 人 工 授 精 技 術(shù) 用 于 臨床,1988 年 3 月大陸地區(qū)的首例試管嬰兒誕生。經(jīng)過我國科研和臨床人員 20 余年的努力,該學科已到達國際水平 1,3?，F(xiàn)階段各國生殖醫(yī)務(wù)工作者正致力于通過改良超排卵方案、提高體外培養(yǎng)囊胚質(zhì)量，發(fā)展實驗室體外培養(yǎng)系統(tǒng)、開拓分子生物學技術(shù)等方面，來到達輔助生育技術(shù)降低多胎率，提高妊娠率，減少并發(fā)癥最終出生健康嬰兒的目的。 輔助生殖技術(shù)研究進展1.2.l IVF-ET

49、的研究IVF-ET 技術(shù)，又稱試管嬰兒，是指分別從人體內(nèi)取出卵子和精子，精子經(jīng)過處理獲能后體外受精，受精卵發(fā)育成 2-8 個卵裂球或胚泡期時，再移植回母體子宮內(nèi)著床，發(fā)育成胎兒。它的適應(yīng)證比擬廣泛，包括女性排卵障礙、輸卵管性不孕、宮內(nèi)膜異位癥，男性輕度少精癥、弱精癥或畸精癥，免疫性不孕和其他助孕技術(shù)失敗的原因不明的不孕癥。 超排卵方案的研究 人類超排卵方案的研究上 世 紀 80 年 以 來 ， 常 規(guī) 使 用 促 性 腺 激 素 釋 放 激 素 激 動 劑(gonadotropin-releasing hormone analogue ， GnRHa) 和 促 性 腺 激 素(gonadotr

50、opin，Gn)超排卵。臨床上 COH 分為常用方案、強刺激方案、-16-第四軍醫(yī)大學博士學位論文短方案、超短方案、氯米芬常規(guī)方案、強降調(diào)節(jié)方案、超強降調(diào)方案、屢次拮抗劑方案和單次拮抗劑方案 9 種 4：A 常用方案：GnRHa 在經(jīng)前 7-10 天開始使用，至月經(jīng) 3-5 天開始 HCG 注射 150 IU /d 停用。其特點是適用范圍廣，用于常規(guī)超排卵。B 強刺激方案：GnRHa 在經(jīng)前7-10 天開始使用至月經(jīng)第 3 天開始 HCG 注射 450 IU /d 停用。其特點是強化卵泡的募集、加速卵泡的發(fā)育。主要適用于卵巢反響不良者。C 短方案：于月經(jīng)第 2 天開始給 GnRHa，同時加用

51、HCG 注射 150 IU /d。其刺激作用強，特別是強化卵泡的募集。適用于反響不良、卵泡數(shù)量少的病人。 D 超短方案:于月經(jīng)第 2 天給 GnRHa 數(shù)天，同時 HCG 注射 150 IU /d。其特點是強化卵泡的募集，減少 Gn 的用量。適用于反應(yīng)不良、卵泡數(shù)量少的病人。E 氯米芬常規(guī)方案：于月經(jīng)第 3 天開始氯米芬、第 5 天開始 Gn。其特點是減少 Gn 用量，有自發(fā) LH 峰。適用于一般超排卵。F 強降調(diào)節(jié)方案：長效沖動劑在月經(jīng)第 2 天開始使用，月經(jīng)第 29 天加用 Gn。其特點是加強降調(diào)節(jié)。適用于多囊卵巢綜合征 polycystic ovary syndrome，PCOS、卵巢反

52、響過度病人。G 超強降調(diào)方案：長效沖動劑三個療程，末次 GnRHa 第 29 天開始添加 Gn。其特點是加強降調(diào)節(jié)。適用于 PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥病人。H 屢次拮抗劑方案：卵泡14mm 開始每天使用拮抗劑，月經(jīng) 3-5 天開始使用 Gn， 150 IU /d。其特點是抑制 LH 峰。適用于常規(guī)超排卵。I單次拮抗劑方案：卵泡14mm 時單次使用拮抗劑 3mg，月經(jīng) 3-5 天開始使用 Gn， 150 IU /d。其特點是使用方便。適用于常規(guī)超排卵。使用 GnRHa 和 Gn 超排卵可預(yù)防 LH 峰提早出現(xiàn)，同時防止卵泡過早黃素化，使卵泡發(fā)育同步化，從而提高卵子質(zhì)量和卵子募集率。還能降低卵巢局部

53、雄激素水平，增加受精率，從而提高胚胎種植率和臨床妊娠率5,6。但是 GnRHa 并不能阻止卵巢過度刺激綜合征(ovarianhyperstimulation syndrome， OHSS)的發(fā)生 7。基于卵泡期高 LH 水平-17-第四軍醫(yī)大學博士學位論文對卵子有不良影響，九十年代后半期超排卵藥物趨向于應(yīng)用高純度FSH ( 0. 1 LH)及 recFSH(不含 LH)。但其超排卵效率和平安性與其他方法相比沒有明顯差異。并且有報道對 ART 中正常內(nèi)分泌功能的患者過度降低 LH 水平，可能產(chǎn)生不良的結(jié)局 8。近年來開發(fā)了 CnRH拮抗劑(GnRH antagonist)，其應(yīng)用方案有單次劑量和

54、屢次劑量兩種。臨床研究說明，與沖動劑相比，能促進卵子成熟，降低 OHSS 發(fā)生，提高種植率及臨床妊娠率。其用藥時間短、劑量低、停藥后垂體功能恢復(fù)迅速、不需黃體支持。適用于對 Gn 高反響和正常反響者，但不適用于對 Gn 低反響者 9,10。目前使用 GnRH 拮抗劑的療效仍需進一步探討。 超排卵在小鼠中的應(yīng)用小鼠超排方法是通過注射不同的外源激素 11，如黃體生成素釋放激素類似物 LH-RH analogu12， GnRH 沖動劑13，馬絨毛膜促性腺激素 (equine chorionic gonadotropin, eCG) 或孕馬血清促性腺激素pregnant mares serum gon

55、adotrophin，PMSG和人類絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)聯(lián)合使用，均取得良好成效。有研究報道三品系小鼠 Mus musculus，Mus spretus，Mus spicilegus超排的激素劑量和注射間隔時間進行比擬，得出激素最有效劑量為 5IU PMSG 加 5IU hCG,最適合的注射間隔時間為 48 h14。小鼠品系不同，超排藥物最有效劑量也不同。對多數(shù)品系小鼠來說，PMSG 和 hCG使用最有效劑量一般在 2.5 IU -10IU 之間。重復(fù)使用可以降低卵子的發(fā) 育 潛 能 15。 小 鼠 超 排 還 受 年 齡 影

56、響 ， 28 天 的 ICR， B6C3F1 和C57BL/6J小鼠比 56 天和 112 天的小鼠超排后獲的卵子數(shù)量多-18-16。第四軍醫(yī)大學博士學位論文 體外培養(yǎng)研究1.2.l.2.l 未成熟卵體外培養(yǎng)(in vitro maturation， IVM)IVM 是指取卵巢竇卵泡內(nèi)的未成熟卵母細胞，直徑約為 2-10mm，通過體外培養(yǎng)發(fā)育成為處于第二次減數(shù)分裂中期(M)的成熟的卵母細胞，再經(jīng)體外受精后發(fā)育成胚胎，最后移植回母體獲得妊娠的技術(shù)。IVM 可使 IVF 治療周期中獲得的未成熟卵體外成熟，臨床妊娠率與常規(guī) IVF-ET 相比沒有明顯差異 17，但其防止了 COH 誘發(fā)的卵巢過度刺激

57、綜合征 ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS的負面影響，因而具有非常明顯的優(yōu)越性，還能增加受精率17。多囊卵巢綜合征患者采用未成熟卵子 IVM 治療不孕，能到達相對高的臨床妊娠率 18。對Gn 不敏感婦女或高齡婦女 COH 中卵巢反響差也可以通過 IVM 獲得妊娠 19-21。目前通過 IVM 對卵母細胞成熟機理的探討和研究正在廣泛而深入的進行中。 22,231.2.l.2.2 囊胚體外培養(yǎng)系統(tǒng)的開展在過去的二十年里，最早由于單一培養(yǎng)環(huán)境的限制，多采用 2-8細胞期胚胎進行移植，由于胚胎和子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，胚胎的種植率較低。后來曾有中心使用共同培養(yǎng)提

58、高了囊胚種植率，但共同培養(yǎng)可能對胚胎產(chǎn)生污染，而且其培養(yǎng)系統(tǒng)復(fù)雜，并且使用動物細胞涉及倫理問題，難以普及。接下來采用的序貫培養(yǎng)液是根據(jù)體外培養(yǎng)的胚胎在不同發(fā)育時期代謝需求不同而設(shè)計的，依次添加適合該時期胚胎需要的營養(yǎng)物質(zhì)進行培養(yǎng)，增加囊胚的形成率，從而進一步提高胚胎種植率和妊娠率 24。 09 年 Hentemann25采用序貫培養(yǎng)液體外培養(yǎng)鼠2 細胞期胚胎到囊胚，第 d3 天囊胚形成率達 97%， d4 囊胚孵化率達71%。而 Franco26報道，采用單一培養(yǎng)液人的卵母細胞發(fā)育率和囊胚種植率比序貫培養(yǎng)高，單一培養(yǎng)優(yōu)于序貫培養(yǎng)因為序貫培養(yǎng)液添加時機是個有難度的問題，要求培養(yǎng)者熟悉人胚胎發(fā)育階

59、段，選擇最適合-19-第四軍醫(yī)大學博士學位論文時機進行添加。 2021 年有人 27提出使用微流體技術(shù)進行胚胎體外培養(yǎng)，它能提供與體內(nèi)發(fā)育環(huán)境更接近的培養(yǎng)環(huán)境，目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于豬、牛、鼠胚胎培養(yǎng)的實驗室研究。1.2.l.2.3 胚胎發(fā)育的評估原核期胚胎形態(tài)學的評估內(nèi)容主要包括核仁的數(shù)量、排列、胞漿暈、核仁前體發(fā)育和核膜裂解時間。原核分類強調(diào)兩個原核核仁前體發(fā)育的快慢和同步化。有報道原核形態(tài)評估有助于提高胚胎種植率。Tesarik28將原核分為 6 種類型觀察胚胎發(fā)育停滯率和妊娠率，結(jié)果發(fā)現(xiàn) O 型胚胎存在，胚胎的發(fā)育停滯率低而妊娠率相對高。卵裂期胚胎形態(tài)學的評估采用 d2 或 d3 胚胎的

60、卵裂球數(shù)目及形態(tài)評分。人們觀察卵裂后總結(jié)出受精后 d2 為 4-5 個卵裂球，d3 至少 7 個卵裂球，卵裂球大小較均勻且無多核，碎片20%的胚胎種植率較高。目前有報道 29，早期卵裂(early cleavage, EC)評分優(yōu)于原核形態(tài)學評估，但最好的方法是兩種評分系統(tǒng)相結(jié)合稱作 EC 和 O 型胚胎。有報道30特定時間早期 卵 裂 數(shù) 目 可 以 作 為 預(yù) 測 多 胎 妊 娠 的 指 標 。 但 有 人 報 道 31年 齡 大 于35 歲， COH 使用 CnRH 拮抗劑方案的婦女，早期卵裂率評估妊娠率是不可靠的。人類胚胎的評分標準 32， 33: 1 級：卵裂球均勻規(guī)那么，折光度適中