何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術與原理

1、第四章 基因工程的主要技術與原理周毅峰2013.03整理ppt核酸的提取與純化核酸電泳分子雜交PCR技術DNA序列分析大分子相互作用整理ppt1、核酸的提取與純化破碎細胞或包膜內容物釋放材料準備核酸分離、純化沉淀或吸附核酸，并去除雜質核酸溶解在適量緩沖液或水中整理ppt2060bp1.1、基因組DNA的提取與純化DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑DNA鈉鹽比游離態(tài)更易溶于水DNP在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的1%DNP在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的2倍整理ppt生物材料的準備新鮮，或者凍存的樣品液氮中研磨加緩沖液EDTA螯合Mg2+、Ca2+SDS變性蛋白質-巰

2、基乙醇、DTT打開二硫鍵和抗氧化PVP與酚和多糖結合及抗氧化裂解細胞除雜加CTAB或SDS結合多糖和蛋白加酚仿去蛋白純化與保存加乙醇或異丙醇沉淀加乙醇反洗滌吹干水或TE溶解20保存整理ppt基因組DNA的提取 酚抽提法樣品的準備細胞的裂解蛋白質變性DNA的抽提DNA的沉淀整理ppt血基因組DNA試劑盒酵母基因組DNA試劑盒細菌基因組DNA試劑盒細胞基因組DNA試劑盒整理pptCTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液整理ppt SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液整理ppt利

3、用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內容物密度不同的原理分離各種內容物濃鹽法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：整理ppt核酸分離、純化蛋白質的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理整理ppt多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含

4、1.2 M NaCl) ，冰浴20min。核酸分離、純化整理ppt多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合核酸分離、純化鹽離子的去除：70的乙醇洗滌整理pptCTAB溶液配制好備用，65水浴預熱。獼猴桃葉片或果實采取后最好立即放到液氮中,避免酚類物質氧化 65水浴一個小時 氯仿：乙醇：異戊醇=80:16:4的抽提液 兩次。10000轉/分離心20分鐘，盡量把絲狀物壓緊，避免吸取上清時有絲狀物牽拉 等體積預冷的異丙醇 ，75%乙醇洗去其他雜質。

5、洗兩次 。用無水乙醇5毫升洗一次。晾干5分鐘揮發(fā)掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 獼猴桃DNA提取實例CTAB提取緩沖液的改進配方整理ppt獼猴桃基因組DNA整理ppt閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；原理1.2、堿裂解法提取質粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復性強堿中性整理ppt染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質SDS復合物結合在一起；當K+取代Na+時,生成不溶的PDS， 這些復合物從溶液中沉淀下來。變性整理ppt利用宿主菌線狀染色體DNA與閉環(huán)雙鏈質粒DNA的結構狀態(tài)的差異來提取質

6、粒DNA。當同時堿變性時，線狀基因組DNA變性充分而質粒DNA處于拓撲纏繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開。 當條件恢復時（酸中和），質粒DNA迅速準確配置重新形成完全天然超螺旋分子，而線狀DNA則與破裂的細胞壁，細菌蛋白相互纏繞成大型復合物，被SDS包蓋。當K+取代Na+時,這些復合物會從溶液中沉淀下來，附在細胞碎片上一起被離心除去。 堿裂解法整理ppt所用的試劑作用 葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。 EDTAMg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。S

7、DS: 溶解細胞膜蛋白和細胞內蛋白，并結合成“蛋白SDS”復合物，使蛋白質（包括DNA酶）變性沉淀。整理ppt冰醋酸把醋酸鉀溶液的pH調到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復性。高濃度的K+置換Na+，生成不溶的PDS用于沉淀DNA。 乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。 KAc-HAc緩沖液 RNase A降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。整理ppt TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl維持溶液中pH值相對穩(wěn)定；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白

8、質，使蛋白質沉淀。但苯酚會殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。 酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。整理ppt堿抽提法提取質粒DNA的步驟 Solution I 的配制：使用“溶液”懸浮菌體。第一步：懸浮菌體25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA溶液II 破壞細胞膜，蛋白質和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質和DNA變性Solution II 的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA復性、并促使蛋白質-SDS復合物和染色體DNA沉淀。Solution III的配制：5M 乙酸鉀（用冰醋酸調pH至4.8）整

9、理ppt上清液中含有閉合質粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA整理ppt材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質粒DNA的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加）培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量菌株不要頻繁轉接（質粒丟失）整理ppt細胞裂解材

10、料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取質粒DNA的提取菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質粒易被打斷復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁整理ppt核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間

11、（獼猴桃大提，10000轉20min）針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法基因組DNA的提取質粒DNA的提取整理ppt核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解 基因組DNA的提取質粒DNA的提取整理pptDNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制

12、后續(xù)酶解反應DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應。 原因對策整理ppt材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避

13、免反復凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策 原因整理ppt實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。對策 原因整理ppt1.2、RNA的提取與純化細胞RNA的含量每個細胞的RNA量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 sn

14、RNA 、snoRNA整理ppt液氮中研磨加蛋白變性劑去除DNA和蛋白提供超低溫抵制酶活性異硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸鈉使蛋白和核酸分離異硫氰酸胍、-巰基乙醇抑制RNase活性LiCl2沉淀RNA酚仿或水飽和酚抽提DNA和蛋白，將RNA留水相中乙醇洗滌雜質，乙醇或異丙醇沉淀RNA純化和沉淀RNA整理ppt異硫氰酸胍/苯酚法 原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。 整理ppt 步驟:材料準備：盡量新鮮。器具準備：0.

15、1%DEPC處理24小時，滅菌；裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。整理ppt影響RNA提取的因素 材料：新鮮，切忌使用反復凍融的材料如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRIzol或樣品貯存液中，于70或20保存如要多次提取，請分成多份保存液氮長期保存，70短期保存整理ppt 樣品破碎及裂解：

16、根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和細菌：一般TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機械方法破壁動植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當加大裂解液的用量整理ppt 純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，雖然經濟，但操作時間長，易造成 RNA 降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應的雜質，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素整理ppt1.3 核酸的純度與濃度鑒定紫外分光光度法

17、核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。 各種堿基的紫外吸收光譜可通過A260與A280 的比值來判定有無蛋白質的污染，比值升高與降低均提示不純 判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0純DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染純RNA 比值2.0， Hairpin and Cross DimerDimer得到產物的機率，應大于50%整理pptPCR反應條件的選擇 溫度與時間的設置 三溫度點法 雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至40 60，引物退火并結合到靶序列上，然后快速

18、升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸 (標準反應) 二溫度點法 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 較短靶基因(長度為100300bp)時整理ppt變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394 1min足以使模板DNA變性，若低于93則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。 變性溫度與時間整理ppt退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至406

19、0，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。 退火(復性)溫度與時間：整理ppt引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結合。 整理p

20、ptTaq DNA聚合酶的生物學活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90時， DNA合成幾乎不能進行。延伸溫度與時間： PCR反應的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 整理ppt循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DN

21、A的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù)整理pptPCR實驗操作過程整理pptPCR產物純化整理pptPCR產物純化試劑盒整理pptPCR產物電泳PCR常見問題正對照有條帶，而樣品則無原因：該Buffer對樣品不合適引物設計不當或者發(fā)生降解模板:含有抑制物，含量低反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短優(yōu)化純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間整理ppt非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)

22、特異性擴增帶與非特異性擴增帶原因：引物特異性差酶純度不高Mg2+濃度偏高退火溫度偏低Buffer不合適循環(huán)次數(shù)過多解決：重新設計引物或者使用巢式PCR換用高純度的酶降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法更換Buffer減少循環(huán)次數(shù) 整理ppt拖尾現(xiàn)象：產物在凝膠上呈Smear狀態(tài)原因：酶量過多模板不純循環(huán)次數(shù)過多dNTP、Mg2+濃度偏高退火溫度偏低Buffer不合適解決：適量用酶純化模板減少循環(huán)次數(shù)適當降低dNTP和鎂離子的濃度適當提高退火溫度更換Buffer整理ppt假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產物原因：靶序列或擴增產物的交叉污染對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍

23、內或濺出離心管外除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 整理ppt雙脫氧法測序 (Sanger dideoxy procedure )5DNA序列的測定(Sanger dideoxy procedure )大規(guī)模測序的策略和測序技術的發(fā)展化學法測序(Maxam-Gilbert procedure) 整理pptFrederick SangerDNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3末端，依據(jù)堿基配對的原則，通過生成新的3，5-磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產生短的DNA鏈。產生相應的四組具有特定長度的、

24、不同長短的DNA鏈。5.1雙脫氧法測序 (Sanger dideoxy procedure )雙脫氧法測序 原理整理ppt整理ppt雙脫氧法測序基本過程整理ppt自動測序電泳裝置整理pptAn example of a portion of a chromatogram from automated sequencing Automated sequencing is based on the dideoxy methodology, but four different fluorescent dye-labelled ddNTPs are used. Thus each fluoresce

25、nt label can be detected by its characteristic spectrum. The products are separated by automated electrophoresis and the bands detected by fluorescence spectroscopy. 整理pptSanger測序儀采用96個毛細電泳管的陣列，可以同時進行96個這樣的測序反應，每個反應得到的Read長度可以達到1000bp以上 MEGABACE1000 DNA測序儀 整理ppt多道移液器96孔反應板整理ppt雙脫氧法測序 程序將待測基因序列打斷成較短重

26、疊的DNA片段群DNA片段連入載體，在E.coli體內擴增，挑取單菌落，分離純化重組載體測序加入DNA聚合酶，dNTP以及帶有熒光標記的雙脫氧核苷酸ddNTP凝膠電泳，檢測標記過的核苷酸片段的熒光信號。根據(jù)重疊序列，通過軟件處理，DNA序列信息整理ppt測序載體pUC：雙鏈質粒載體，衍生的載體很多，不同商業(yè)公司有所不同，但基本均由pUC衍生而來，使用時需先變性M13系列和pUC系列的測序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的DNAM13：單鏈噬菌體載體，目前很少采用整理ppt測序DNA聚合酶DNA聚合酶Klenow片段53的聚合酶活性，35的外切酶活性持續(xù)合成能力不強，不能復制富含二級結構的模

27、板區(qū)以ddNTP為底物的能力遠比在dNTP低易受DNA制備時經常產生的污染物的影響，且只對單鏈模板有效整理pptT7噬菌體聚合酶(測序酶)是一種經過修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，缺乏35外切酶活性能產生出非常漂亮的DNA梯帶，每條帶都具有相似的強度，可讀的DNA序列可覆蓋凝膠的全長測序酶催化ddNTP結合的速率是dNTP的33%具有1.0和2.0兩個版本，2.0取代了1.0，能對折疊成二級結構的模板起作用測序酶526位氨基酸為Tyr，若換成Phe，結合ddNTP的能力下降2000倍，將E.coliDNAPol或TaqdnaPol類似氨基酸換面Tyr其結合ddNTP的能力提高8000倍整理ppt

28、TaqDNA聚合酶它在高溫下（70）進行終止鏈反應的能力可減少測序反應中由于模板DNA上引物假結合位點與引物退火錯配產生的相關問題在測序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強度不同，從頂部到底部條帶逐漸減弱，出現(xiàn)陰影?？捎糜诟缓壗Y構的模板催化ddNTP結合的與該區(qū)模板DNA序列的影響TaqDNAPol和PfuPol催化ddNTP結合的速率比結合dNTP的速率低兩個數(shù)量級整理ppt通用引物的使用避免了合成不同引物的麻煩（M13正反向，T7，SP6等）M13 Primers（TaKaRa 公司） M13 Primer各引物位置圖 整理ppt形態(tài) 凍結干燥品?？捎脺缇騎E Buffer (pH 7.58.0) 溶解后使用用途 作為具有SP6 Promoter載體的測序用引物或PCR用引物 整理ppt5.2化學法測序(Maxam-Gilbert procedure) 經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影后，根據(jù)X光片所顯現(xiàn)的相應條帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序是一個DNA化學降解的過程，而不是生物合成過程化學試劑處理具有末端標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混合物注意：只能標記一個堿基，多堿基標記會產生錯誤。 標記方式： 羥基磷酸化反應 、 大腸桿菌聚合酶I Klenow片段及-3