固定化酶和細胞最新

1、固定化酶和細胞酶應(yīng)用過程中的主要瓶頸酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強酸、強堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進一步的分離純化帶來一定的困難。 固定化技術(shù)Contents of chapter 51、什么是固定化技術(shù)和固定化酶2

2、、固定化酶的研究歷史3、酶的固定化技術(shù)4、固定化酶的特點GoGoGoGo6、細胞、原生質(zhì)體的固定化，自學(xué)5、固定化酶的應(yīng)用Go1 什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)化學(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶固定化酶的三種形式固定化酶：經(jīng)提取和分離純化后的酶固定化菌體(死細胞)：含酶菌體或菌體碎片 固定化細胞：在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞 優(yōu)點：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。缺點：1.固定化過程中往往會引起酶的失活 2.固定化酶在化學(xué)催化反應(yīng)中存在空間位阻2 固定化酶的研究歷史固定化酶的研究從50

3、年代開始，1953年德國的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，實現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為Immobilized enzyme。隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)固定化菌體 。1973年，日本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸。在固定化酶和固定化菌體的基礎(chǔ)上，

4、70年代后期出現(xiàn)了固定化細胞技術(shù)。 1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產(chǎn)啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶，開始了用固定化細胞生產(chǎn)酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸，取得進展。固定化原生質(zhì)體由于解除了細胞壁的障礙，更有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，這為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提供了新的方向。本章目錄3 酶固定化技術(shù)活性中心：保護酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時，需要在非常嚴密的條件下進行。功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團位于

5、酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結(jié)合酶的高級結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強酸、強堿等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進行。固定化酶操作的注意事項酶和細胞固定化的模式吸附法 利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。 常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。 操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復(fù)使用。 由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。 包埋法 將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。 包

6、埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂、聚酰胺、火棉膠等。根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數(shù)為球狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。 半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等 首先被采用包埋法的酶有： 固定化胰蛋白酶 固定化木瓜蛋白酶 固定化淀粉酶Enzyme+N,N-甲

7、叉雙丙烯酰胺，丙烯酰胺，引發(fā)劑海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。顆粒大小可實時監(jiān)控脂質(zhì)體包裹酶結(jié)合法 選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。 共價鍵結(jié)合法：通過共價鍵將酶與載體結(jié)合的固

8、定化方法稱為共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，可以長時間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備

9、成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補短。 常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶本章目錄酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酵母細胞表面展示技術(shù)NHCH2CH2OPOOONH2OHOOHOHOHOPOOOCH2CHCH26R1-2Mana1-2Mana1-6R2Mana1-4Glca1-Plasma membraneProteinEthana

10、lamine phasphate bridgeGlycanInositol脂肪酶在畢氏酵母表面展示與篩選C. antarctica 脂肪酶B及M. miehei 脂肪酶基因在酵母細胞表面的展示 4 固定化酶的特性：將酶或含酶菌體固定化制成固定化酶或固定化菌體以后，由于受到載體等的影響，酶的特性可能會有些變化。 固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。 酶經(jīng)過固定化后，其作用的最適pH值往往會發(fā)生一些變化。這一點在使用固定化酶時，必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質(zhì)，另一個是酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)。

11、固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。 本章目錄乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D AlaAminoacylase 氨 基 酰 化 酶5 固定化酶的應(yīng)用世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再進行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)

12、成本的60左右。 泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-AlaDL-乙酰氨基酸拆分高果糖漿的生產(chǎn)世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細胞用6065熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，催化葡萄糖異構(gòu)化生成果糖，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。 生產(chǎn)果葡糖漿的固定化酶反應(yīng)器Typical fixed bed reactor 2022/7/14K. Buchholz, et al.(Germany) ,2005; 2008This is the largest process performed

13、 with about 1500 t of immobilized enzymes producing a glucosefructose syrup (HFCS, high fructose corn syrup) with more than 10 million t of product (dry matter) per year 1220 t (dry substance, d.s.) per kg of biocatalyst with a half-life of 80150 days. Reactor dimensions typically are 1.5 m diameter

14、 and 5 m height of fixed bed bioreactors, with operation at 5860 C青霉素?；皋D(zhuǎn)化填充床反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)(R)-1,3-丙二醇 b. 固定化生物催化劑在異丙醇-水溶液體系中進行不對稱氫轉(zhuǎn)移生物還原 底物4-羥基-2-丁酮 5%產(chǎn)物(R)-1,3-丁二醇 49.5 g/l光學(xué)純度 99%e.e. 轉(zhuǎn)化率為 99% 反應(yīng)器穩(wěn)定工作 500 h反應(yīng)器的生產(chǎn)率約為 750 mg/h/10 ml (催化劑) （Nobuya Itoh,2007） a. 固定化E. coli 細胞生物催化不對稱氧化還原CO2合成甲醇 （ Ei-Zahab, e

15、t al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ） 四種酶，包括甲酸、甲醛、乙醇和谷氨酸脫氫酶 共固定化在一種顆粒上輔酶NADH固定在另顆粒上向兩種固定化顆粒的懸浮液中通CO2氣體進行反應(yīng)實現(xiàn)了輔酶的內(nèi)部循環(huán)該固定化系統(tǒng)表現(xiàn)出較好的循環(huán)使用的穩(wěn)定性 酶和輔酶共固定化E1E2環(huán)氧琥珀酸水解酶生產(chǎn)L-(+)-酒石酸江蘇常茂生化常茂生化利用凝膠包埋固定化含環(huán)氧琥珀酸水解酶的整細胞催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-(+)-酒石酸，年生產(chǎn)規(guī)模6000噸，占世界市場15%，改變了傳統(tǒng)從葡萄酒石提取的單一技術(shù)局面。 獲得高酶活固定化細胞，單元反應(yīng)柱生產(chǎn)能力增加50%，酶反應(yīng)半衰期8個月以上，并且是世界上

16、最大型的凝膠包埋固定化微生物細胞生產(chǎn)裝置 大型固定化細胞裝置底物產(chǎn)物交聯(lián)鏈孢霉菌細胞拆分DL-泛解酸內(nèi)酯交聯(lián) 提高酶在有機底物體系中的穩(wěn)定性31浙江鑫富 利用戊二醛交聯(lián)固定化的鏈孢霉菌細胞(含內(nèi)酯水解酶) 催化拆分DL- 泛解酸內(nèi)酯，已實現(xiàn)D-泛酸鈣和D-泛醇的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化年產(chǎn)量5000噸，占世界市場44%5000L生物反應(yīng)器交聯(lián)固定化菌體在反應(yīng)OOOH+消旋化DL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL內(nèi)酯化D-泛解酸內(nèi)酯水解酶浙江鑫富藥業(yè)酶-化學(xué)耦聯(lián)不對稱合成左旋帕羅醇 原料利用率提高：底物近100%轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，原子經(jīng)濟性大幅提高。 節(jié)能減排效果明顯：有機溶劑用量

17、減少約59.3%、“三廢”排放減少約39.4%。 產(chǎn)品質(zhì)量提高： ee 值大于99.5%（化學(xué)法99.0%）?？挂钟羲幣亮_西汀手性中間體左旋帕羅醇的合成浙江九洲藥業(yè)工程菌，酯酶；大孔樹脂固定化酶；重復(fù)使用20次以上（Industrial Engineering Chemistry & Research (2010, 2008a, 2008b)酵母展示脂肪酶在生物合成中的應(yīng)用脂肪酶CALB/RML?；w油，脂肪酸、己酸等?；荏w甲醇，乙醇，糖醇等反應(yīng)體系非水相/離子液等產(chǎn)物及性質(zhì)芳香酯，表面活性劑，生物柴油等應(yīng)用酵母展示脂肪酶在短鏈芳香酯合成的應(yīng)用無水體系中不同酸醇摩爾比對合成己酸乙酯的影響無

18、溶劑體系下酶催化合成芳香酯酯酸醇摩爾比6h轉(zhuǎn)化率12h轉(zhuǎn)化率24h轉(zhuǎn)化率乙酸丁酯乙酸異戊酯 乙酸葉醇酯乙酸香葉酯 丁酸乙酯丁酸異戊酯丁酸葉醇酯丁酸香葉酯己酸乙酯己酸丁酯己酸己酯己酸香葉酯庚酸乙酯辛酸乙酯 1：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：225.3%22.0%25.0%9.5%72.9%70.1%80.8%19.0%88.0%56.3%42.4%18.8%69.1%24.1%40.5%40.1%53.6%38.1%88.5%90.4%84.6%76.9%90.2%88.9%72.2%60.2%87.7%55.0%79.0%85.9%85.7%85.7%89.4%92.3%84.6%90.5%90.0%90.6%84.0%90.6%88.0%87.9%無水體系下合成芳香酯酶傳感器酶傳感器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶傳感器是酶電極，即將固定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當(dāng)酶膜與被測物發(fā)生催化反應(yīng)而生成電極活性物質(zhì)后，電極測定活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)換為電信號輸出。酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶電極并把它用于葡萄糖