苯乙酸對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中cmyc和Caspase3表達(dá)的影響

1、苯乙酸對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中c-myc和Caspase-3表達(dá)的影響 作者：黃少偉，楊朝華，李齊廣，吳全理，羅大山，王光綠 【摘要】 目的 觀察誘導(dǎo)分化劑苯乙酸（phenylacetate，PA）對c-myc和Caspase-3表達(dá)的影響，探討PA誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，實驗組給予PA濃度5.0mmol /L誘導(dǎo)72h，對照組不用PA，分別用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測c-myc和Caspase-3的表達(dá)，圖像分析比較表達(dá)水平的差異。結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，兩對照組和實驗組中c-myc的表達(dá)分別為0.2140.013和0.1530.007，Caspase-3的表達(dá)分別為0.

2、1490.004和0.2060.033。結(jié)論 PA能夠下調(diào)c-myc的表達(dá)和增強Caspase-3的表達(dá)，其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與此有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 苯乙酸酯類；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細(xì)胞凋亡Abstract: Objective To study the effects of differentiation inducer phenylacetate (PA) on the expression of c-myc and Caspase-3 in rat C6 glioma cells and explore the mechanism of PA action. Methods C6

3、glioma cells were cultured in vitro. In experiment group, C6 cells were induced by PA at concentration of 5.0mmol/L for 72 hours. In control group, no PA was administrated. The expression of c-myc and Caspase-3 was detected by using an immunocytochemistry technique. The differernces of the imaging p

4、resentation in the two groups were analyzed. Results The expressions of c-myc in control group and experiment group were 0.2140.013 and 0.1530.007, respectively, while the expression of Caspase-3 were 0.1490.004 and 0.2060.033, respectively. Conclusion PA can down-regulate the expression of c-myc an

5、d enhance the expression of Caspase-3, which might consequently induce apoptosis in C6 glioma cells. Key words: phenylacetates; glioma; apoptosis誘導(dǎo)分化劑苯乙酸（phenylacetate，PA）是一種苯丙氨酸的脫氨基產(chǎn)物，正常情況下以低濃度存在于人腦脊液和血液，能降低血漿中谷氨酰氨水平，對人體無毒副作用，1994年Samid1發(fā)現(xiàn)PA對膠質(zhì)瘤有誘導(dǎo)分化和抑制生長作用。此外研究發(fā)現(xiàn)PA對子宮頸癌2、乳腺癌3和腎癌4等多種腫瘤也有抑制作用，PA具有很好

6、的臨床應(yīng)用前景。在國外PA已進(jìn)入期臨床試驗，但作用機(jī)理尚未完全清楚。前期的研究發(fā)現(xiàn)PA能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡5，筆者主要研究PA對c-myc和Caspase-3表達(dá)的影響，探討PA誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。1 材料與方法1.1 材料 大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞（引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco,美國）； 苯乙酸（sigma,美國）；SABC免疫組化檢測試劑盒（武漢博士德公司）；c-myc和Caspase-3一抗（兔抗大鼠，武漢博士德公司）；CO2培養(yǎng)箱(SANYO,日本)；倒置光學(xué)顯微鏡IMT-2-12型（OLYMPUS，日本）；OLYMPUS采集圖像系統(tǒng)；Laser

7、Pix圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad,UK）。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C6細(xì)胞以5105/ml在100ml培養(yǎng)瓶中單層培養(yǎng)，置37、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，RPMI 1640培養(yǎng)基加入10%熱滅活胎牛血清，碳酸氫鈉2g/L，青霉素100u/ml，鏈霉素100g/ml，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測c-myc和Caspase-3的表達(dá) 將經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片放入6孔板中，C6細(xì)胞以5105/ml接種培養(yǎng)，24h后更換為含有PA的培養(yǎng)基，濃度5.0mmol/L，培養(yǎng)72h后取出蓋玻片，PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛緩沖液固定30min，PBS洗滌3次。

8、按試劑盒說明進(jìn)行檢測操作(一抗工作濃度c-myc 125，Caspase-3 1100)。結(jié)果判斷: c-myc和Caspase-3陽性表達(dá)均位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色。用OLYMPUS采集圖像系統(tǒng)采集圖像，LaserPix圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在統(tǒng)一放大倍數(shù)(400倍)下測定平均光密度(mean density，MD)，進(jìn)行分析。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 每個實驗重復(fù)5次，計量資料結(jié)果數(shù)據(jù)表示為s，作t檢驗，分析用軟件SAS8.02完成。2 結(jié)果2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測c-myc的表達(dá) 在C6細(xì)胞中有c-myc的表達(dá)（見圖1），圖像分析顯示MD為0.2140.013。PA5.0mmol/L作用72h

9、亦有c-myc的表達(dá)（見圖4），胞漿黃染減弱，圖像分析顯示MD為0.1530.007，兩者差異有高度顯著性（t=8.93，P0.01）。2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Caspase-3表達(dá) 在C6細(xì)胞中有Caspase-3的表達(dá)（見圖3），圖像分析顯示MD為0.1490.004。PA5.0mmol/L作用72h亦有Caspase-3的表達(dá)（見圖4），胞漿黃染明顯增強，圖像分析顯示MD為0.2060.033，兩者差異有高度顯著性（t=3.79,P0.01）。圖1 c-myc 在C6細(xì)胞中的表達(dá) SABC400（略）圖2 PA5.0作用72h c-myc的表達(dá) SABC400（略）圖3 Caspase-

10、3 在C6細(xì)胞中的表達(dá) SABC400（略）圖4 PA5.0作用72hCaspase-3的表達(dá) SABC400（略）3 討論 細(xì)胞凋亡是一種基因控制的細(xì)胞自主性的死亡過程，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制之一。目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞過度增殖有關(guān)，同時與凋亡不足也有關(guān)。細(xì)胞凋亡從內(nèi)外多因子復(fù)雜的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡信號，傳遞至半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）并使其活化開始，以蛋白底物裂解、細(xì)胞解體為結(jié)局，從而使細(xì)胞凋亡得以完成，凋亡是一系列的基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果。 c-myc是與病毒癌基因同源的細(xì)胞癌基因，產(chǎn)物為c-myc蛋白。c-myc蛋白具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子所具有的所有結(jié)構(gòu)，包括蛋白

11、的二聚體化結(jié)構(gòu)區(qū)，轉(zhuǎn)錄活性區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)域，具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)其他基因表達(dá)的作用。本研究通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，PA能夠通過下調(diào)c-myc的表達(dá)，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。與此類似，有研究發(fā)現(xiàn)6，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，mesalazine能夠下調(diào)c-myc表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡和抑制生長。一般認(rèn)為c-myc蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，其后又發(fā)現(xiàn)c-myc可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，c-myc是誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡還是促進(jìn)細(xì)胞增殖取決于細(xì)胞接受的其他信號7。還有研究表明8，c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與cyt-c的釋放有關(guān)，這一過程依賴于其他凋亡信號途徑的信號傳導(dǎo)如Fas/FasL凋亡傳導(dǎo)通路。因此我們認(rèn)為PA誘導(dǎo)凋亡可能與其下調(diào)c-m

12、yc表達(dá)有關(guān)。 另外本研究發(fā)現(xiàn)PA能顯著增強Caspase-3的表達(dá)。caspase家族的14個成員中，最引人注目的是caspase-3。大量的事實證明，凋亡發(fā)生是個復(fù)雜的、由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程。多種多樣的刺激因素啟動的信號激活caspase-3，引起多效基因變化，使胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)降解失活?？梢哉fcaspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。caspase-3處于蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的下游，是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一9。本研究通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，PA能夠通過下調(diào)c-myc的表達(dá)和增強Caspase-3的表達(dá)，其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C

13、6細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與此有關(guān)，但詳細(xì)的機(jī)制有待深入研究。【參考文獻(xiàn)】 1 Samid D, Ram Z, Hudgins WR, et al. Selective activity of phenylacetate against malignant gliomas: Resemblance to fetal brain damage in phenylketonuria J. Cancer Res,1994,54(4):891-895. 2 Ferrandina G, Filippini P, Ferlini C, et al. Growth inhibitory effects and r

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