實驗一植物組織總DNA的提取及DNA的濃度測定（4學時）ppt課件

1、實驗十一 植物組織總DNA的提取及DNA的濃度測定 掌握用CTAB法提取植物總DNA的方法和根本原理。學習利用紫外分光光度法測定DNA溶液的濃度。一、實驗目的二、實驗原理 通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需參與抗氧化劑或強復原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，資料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。 CTAB, SDS等離子型外表活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。 再參與苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白量變性，并使抽提液分相，因核酸(

2、DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質。上清液中參與異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。之后可參與RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。 DNA的吸收光譜峰在260 nm處，據(jù)計算，測定此波長下DNA溶液的OD值，當OD260=1時，雙鏈DNA含量約為50 g/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA含量。 由于蛋白質的吸收峰在280 nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280之值，如該值為1.8-2.0時，以為已到達較高的純度，如低于此值，闡明其內(nèi)含雜質較多

3、，能夠影響酶切反響。水稻種類的幼苗葉片三、實驗資料四、實驗器具、藥品試劑 水浴鍋，研缽，微量移液器，槍頭，離心管，臺式離心機，液氮，恒溫箱，標簽紙，紫外分光光度計，磁力攪拌機，剪刀等。 2% CTAB抽提緩沖溶液，異丙醇, 氯仿-異戊醇等 CTAB法流程圖植物資料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解枯燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀DNA溶液五、實驗方法(1) 2%CTAB抽提緩沖液在65水浴中預熱。(2)取少量葉片約0.2 g置于研缽中，用液氮磨至粉狀；(3) 在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時迅即參與700 l的2%CTAB抽提緩沖液，悄然攪動；(4) 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌離心管中，磨碎

4、液的高度約占管的三分之二；(5) 置于65的水浴槽或恒溫箱中，每隔10 min悄然搖動，40 min后取出；1. DNA的提取 6冷卻2 min后，參與氯仿-異戊醇24：1至滿管，猛烈振蕩23 min，使兩者混合均勻；7放入離心機中10 000 rpm離心10 min，與此同時，將600 l的異丙醇參與另一新的滅菌離心管中；8 用移液器悄然地汲取上清夜，轉入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管漸漸上下?lián)u動30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；910000 rpm離心1 min后，立刻倒掉液體，留意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；1060 sec后，直立離心管，

5、參與720 l的75%乙醇及80 l 5 M的醋酸鈉，悄然轉動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；11放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；12 10000 rpm離心1 min后，倒掉液體，再參與800 l 75%的乙醇，將DNA再洗 30 min；1310000 rpm離心30 sec后，立刻倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，枯燥DNA自然風干或用風筒吹干；14參與50 l 0.5 TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37恒溫箱約15 h，使RNA消解；15置于-20保管、備用。稱取樣品，液氮研磨，參與預熱的(65 ) CTA

6、B及-巰基乙醇 保溫1h,期間不停的搖均汲取上清液,移至新的離心管中,參與等體積氯仿：異戊醇24：1，輕緩顛倒混勻,10000rpm,10min 取上清液，移至新的離心管中,加等體積氯仿：異戊醇,顛倒混勻, 10000rpm,10min取上清液，參與0.6-0.7V的異丙醇預冷，后4 /-20 保溫沉淀10000rpm,10min離心取沉淀，70%乙醇清洗兩次，吹干用TE溶解DNA,然后低溫保管 取提取的DNA溶液2 l(約100-200 ng)至一干凈的離心管，參與198 l蒸餾水稀釋。先200 l蒸餾水至比色杯，進展紫外光空白測定，然后倒掉蒸餾水，參與200 l已稀釋的DNA溶液，測定260 nm及280 nm的光吸收值OD260及OD280，計算DNA濃度及OD260/OD280比值。計算公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù)以上濃度單位為g /ml2. DNA濃度的測定1葉片磨得越細越好。2移液器的運用。3由于植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中參與EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應迅速，以免組織解凍，導致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。六、本卷須知七、作業(yè)(1)本實驗所