醫(yī)學(xué)資料4+參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)

1、參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)2021/7/18 星期日 現(xiàn)在已經(jīng)知道約20多種蛋白質(zhì)參與復(fù)制。（1）聚合酶（2）解 鏈、 解 旋 酶 類（3）引發(fā)酶（4）連接酶 下表是與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。2021/7/18 星期日蛋白質(zhì)名稱分子量103U亞基數(shù) 功 能每個(gè)菌中的分子數(shù)毫克蛋白質(zhì)公斤細(xì)胞（濕重）SSBi蛋白n蛋白n 蛋白n蛋白dnaCdnaB引發(fā)酶 74 80 25 75 11 29300 6044111161與單鏈結(jié)合預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)部位識(shí)別,ATPase預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)移動(dòng)啟動(dòng)子,ATPase引發(fā)合成300 50 30 70 -100 20 50 20 0.5 0.3 0.3 0.2表 與

2、大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)接下頁(yè)BACK2021/7/18 星期日蛋白質(zhì)名稱分子量103U亞基數(shù) 功 能每個(gè)菌中的分子數(shù)毫克蛋白質(zhì)公斤細(xì)胞（濕重）Pol 全酶 140 25 10 37 52 32 831121211鏈的延長(zhǎng)30020 0.5Pol 1091填補(bǔ)缺口和切去引物30010連接酶 741連接30010拓?fù)洚悩?gòu)酶 400 210 190422引進(jìn)超螺旋_25025rep 蛋白 解鏈酶dnaA 65 75 4811解開(kāi)雙鏈復(fù)制起始5050002000.6Rep蛋白是一種大腸桿菌解鏈酶2021/7/18 星期日 1 DNA聚合酶 DNA聚合酶 是指以脫氧核苷三磷酸作為底物催化合成DNA的一

3、類酶。 全稱： DNA依賴的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性2021/7/18 星期日所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它們催化脫氧核苷三磷酸加到復(fù)制中的DNA鏈的3羥基末端，合成方向從53，由模板決定加上何種脫氧核苷酸。 2021/7/18 星期日5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?能切除突變的 DNA片段和RNA

4、引物。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。 核酸外切酶活性 目 錄2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日DNA聚合酶的分類DNA-pol 主要的修復(fù)酶DNA-pol 次要的修復(fù)酶DNA-pol 復(fù)制酶DNA-pol IV SOS修復(fù)DNA-pol V SOS修復(fù)原核生物的聚合酶2021/7/18 星期日 (1) 大腸桿菌DNA聚合酶I (Pol ) 純的DNA聚合酶I由分子量109 000U (109KD)，含928個(gè)氨基酸殘基的一條肽鏈構(gòu)成，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中大約含400個(gè)酶分子。(單鏈多肽） 功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。2021/7/18 星期

5、日323個(gè)氨基酸小片段（34KD）5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 （76KD）604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶DNA-pol 2021/7/18 星期日 DNA聚合酶的多種活性。 53聚合活性： 在模板指導(dǎo)下，以脫氧核苷三磷酸為底物在引物3-OH末端加上脫氧核苷酸。每個(gè)酶分子每分鐘添加1 000個(gè)單核苷酸。 聚合酶催化的DNA的合成需要以下條件： 模板 四種脫氧核苷酸 必須有一 3-OH末端的引物，且此引物必須與模板正確形成氫鍵 合成從53方向進(jìn)行，如圖7-8和圖7-9所示2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日

6、35外切酶活性： 沒(méi)有脫氧核苷三磷酸底物時(shí)， DNA聚合酶 I 能從3-OH開(kāi)始以35方向水解DNA，產(chǎn)生5-單核苷酸。 實(shí)際上DNA復(fù)制時(shí)，加上去的脫氧核苷酸不一定每次都正確，錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)不少，有時(shí)甚至加上一個(gè)不與模板配對(duì)的核苷酸，當(dāng)3-OH末端的堿基不與模板配對(duì)時(shí)聚合酶就無(wú)聚合活性，此時(shí)它具有的35外切酶活性可以切除這個(gè)不配對(duì)的核苷酸，這一堿基切除后，外切核酸酶活性終止，聚合酶活性恢復(fù)，如圖7-10所示。所以聚合酶的35外切酶活性也叫修補(bǔ)活性。 2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日 53外切酶活性： DNA聚合酶I具有53外切酶活性。 如圖7-11，其特點(diǎn)是： 只能在5-P末

7、端一個(gè)接一個(gè)地切除核苷酸； 能連續(xù)地切除多個(gè)核苷酸； 只切除配對(duì)的5-P末端核苷酸，不切除不配對(duì)的單鏈5-P末端核苷酸； 既能切除脫氧核苷酸也能切除核苷酸； 對(duì)只具有5-P末端的切口也有活性（由于在DNA復(fù)制過(guò)程中一般情況下只在RNA引物處才有缺口，因此53外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物）。 2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日 切口翻譯(nicktranslation) DNA聚合酶 I 的53外切酶活性和聚合活性同時(shí)作用可以進(jìn)行切口翻譯(nicktranslation)，用來(lái)制造放射性探針。 在反應(yīng)物里加入同位素標(biāo)記的脫氧單核苷酸，DNA聚合酶I 首先利用53外切

8、酶活性，從切口處逐個(gè)切下DNA上的核苷酸，再利用3-OH末端聚合作用逐個(gè)將標(biāo)記的核苷酸加上去(圖712)。2021/7/18 星期日53532021/7/18 星期日 內(nèi)切酶活性： DNA聚合酶 I 也具有53 內(nèi)切酶活性，如圖7-13所示。在兩個(gè)堿基之間切開(kāi)產(chǎn)生一個(gè)具有5-P 末端的不配對(duì)堿基的片段。 很多實(shí)驗(yàn)證明DNA聚合酶 I 在大腸桿菌復(fù)制中不是主要的合成酶，而是在除去RNA引物和損傷修復(fù)中起重要作用。 2021/7/18 星期日不配對(duì)的片段內(nèi)切酶活性2021/7/18 星期日 （2） 大腸桿菌 DNA聚合酶 DNA聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApol不是DNA復(fù)制的主要聚合

9、酶。人們開(kāi)始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了DNApol。 從53方向合成DNA 具有35外切酶活性，但沒(méi)有53外切酶活性。 在體外的合成速率比體內(nèi)的速率要低得多，帶有這個(gè)酶缺陷的大腸桿菌突變株染色體的復(fù)制各方面都正常，它在體內(nèi)的功能可能和DNA聚合酶 I 類似。 2021/7/18 星期日 (3) 大腸桿菌DNA聚合酶 聚合酶是體內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶 帶有DNA聚合酶 的溫度敏感突變 (polc) 的大腸桿菌在限制溫度下是不能存活的，從這種菌株得到的裂解液也不能合成DNA，當(dāng)加入正常細(xì)菌的DNA 聚合酶 時(shí)可以恢復(fù)它的聚合能力，因此不同于DNA聚合酶I和，聚合酶是體內(nèi)DNA復(fù)制

10、所必需的酶。 DNA多聚酶相當(dāng)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)和各亞基的功能如圖1124，25所示。 DNA pol 具有53聚合功能。 2021/7/18 星期日DNA聚合酶 的 “核心酶”由、三種亞基組成。 亞基具有合成DNA的能力。 亞基具有35外切酶的功能，起到校正的作用。 亞基可能在組裝中發(fā)揮功能。亞基加到核心酶上使其二聚化，進(jìn)一步產(chǎn)生pol III。復(fù)合體加入到pol ，進(jìn)一步形成 pol 復(fù)合體。 復(fù)合體是由，和亞基組成，其作用是固定亞基這個(gè)“夾子”的支架。亞基：形成夾鉗，保持催化核心和模板鏈的結(jié)合2021/7/18 星期日 聚合酶的活性 聚合活性： DNA復(fù)制時(shí)聚合酶 全酶十分重要，它可以在DNA

11、模板上的引物的3-OH上以每分鐘約50 000核苷酸的速率逐個(gè)延伸新生的DNA。 35和53的外切酶活性： pol 的53外切酶活性與pol的不同，pol 的53外切酶活性只對(duì) 單鏈 DNA有作用，因此不能用于缺口翻譯。 DNA聚合酶的作用范圍如圖7-14所示。 2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)+-+5 外切酶活性+ 5外切酶活性+5 聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的DNA聚合酶2021/7/18 星期日 (4) 真核生物中的DN

12、A聚合酶 所有真核生物中的聚合酶的性質(zhì)基本上同大腸桿菌中的聚合酶相似，它的活性有賴于模板，帶3-OH的引物，四種脫氧核糖核苷磷酸。 目前發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有 。 DNA聚合酶： 在迅速增殖的細(xì)胞中活力較高。酶分子量在165,000一175,000U之間。最合適的底物是帶缺口的雙鏈DNA，但是帶引物的變性DNA也是很好的底物。是真核生物的復(fù)制酶。 它同大腸桿菌DNA聚合酶最大不同之處在于不具外切酶活性。 2021/7/18 星期日 DNA聚合酶(損傷修復(fù))：為分子量較小(43,000U)的聚合酶。在整個(gè)細(xì)胞周期中它的活力沒(méi)有變化，它利用Dnase I 處理過(guò)的天然DNA作模板，對(duì)變性DN

13、A幾乎沒(méi)有活性，不具外切酶的活性。 DNA聚合酶（線粒體）：是一個(gè)大分子酶，在細(xì)胞內(nèi)含量很低，因此不容易純化。這個(gè)酶可以使用帶缺口的DNA作底物，但以多聚(A)、寡聚(dT)8-10作為底物，酶活力更高。 DNA聚合酶負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。 DNA聚合酶和DNA聚合酶（主要復(fù)制酶）: 是真核生物的復(fù)制酶，主要根據(jù)是聚合酶的活性隨細(xì)胞周期而變化。 DNA聚合酶：功能不詳。2021/7/18 星期日 2 DNA連接酶 DNA Ligase DNA連接酶催化一個(gè)DNA鏈的5磷酸根與另一DNA鏈的3羥基形成磷酸二酯鍵。 但兩個(gè)鏈都必須與同一另外的鏈互補(bǔ)結(jié)合，而且兩鏈必須相鄰，即只能連接一個(gè)切口(ni

14、ck)而不能連接一個(gè)豁口(gap)(丟失核苷酸)，如圖7-15所示。例子：T4誘導(dǎo)的連接酶不僅能在模板上連接DNA和DNA之間的切口，也能連接RNA和RNA之間的切口，不僅能連接DNA中的單鏈切口或雙鏈的粘性末端，而且能連接平頭雙鏈DNA 。大腸桿菌連接酶則不行。 2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日3 與解鏈有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) DNA是雙螺旋，在復(fù)制中雙螺旋要解開(kāi)，雙螺旋的解開(kāi)使得復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，如果這些應(yīng)力不以某種方式釋放將妨礙復(fù)制叉前進(jìn)。 現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使DNA雙鏈變得易于解開(kāi)，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介紹一些這類蛋白質(zhì)。 2021/7/

15、18 星期日 (1) 單鏈結(jié)合蛋白 (SSB蛋白) SSB蛋白：是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，可以在遠(yuǎn)低于Tm的溫度下使雙鏈DNA拆開(kāi)，并牢牢地結(jié)合在單鏈DNA上，穩(wěn)定單鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)。（ SSB保護(hù)復(fù)制中的DNA單鏈部分不被核酸酶降解） 首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)發(fā)現(xiàn)許多種生物中都有這類蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，這類蛋白曾用過(guò)多種名稱：解旋蛋白(unwindingproteill)，熔化蛋白(mel2ingprptein)，螺旋降穩(wěn)蛋白(helixdestabizingprotein)。 2021/7/18 星期日 (2) 解鏈酶（DNA解旋酶；DNA helicases） 解鏈酶(解螺旋酶)：是一類

16、能通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA的酶稱為DNA解鏈酶。 解鏈酶依賴于單鏈DNA 的存在 分解ATP獲得能量 具引發(fā)酶的功能（合成小片段的RNA作為后隨鏈的引物） 如果雙鏈DNA中有單鏈末端或缺口，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動(dòng)，復(fù)制時(shí)大部分DNA解鏈酶可以沿著后隨鏈模板的53方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有rep蛋白（一種大腸桿菌解鏈酶）是沿前導(dǎo)鏈模板的35方向移動(dòng)。因此在復(fù)制時(shí)rep蛋白和某DNA解鏈酶分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開(kāi)雙鏈DNA（圖7-16） 2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日 (3) 拓

17、撲異構(gòu)酶(Topoisomerase)： 是催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體(Topoisomer)相互轉(zhuǎn)換的一類酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶能與DNA形成共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA中間體，從而在其骨架的磷酸二酯鍵處造成暫時(shí)性裂口，使DNA的多核苷酸鏈得以穿越，從而改變DNA分子的拓?fù)錉顟B(tài)。 根據(jù)酶作用的機(jī)理及其介導(dǎo)一條鏈還是二條鏈的斷裂，拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為型和型。2021/7/18 星期日 型拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點(diǎn)是： 僅切斷雙鏈DNA中的一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接。 不需要能量輔助因子，如ATP和NAD等，因此不能催化需能的超螺旋化結(jié)構(gòu)。型拓?fù)洚悩?gòu)酶一般都使高度超螺旋的DNA松弛。 型拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點(diǎn)是：

18、同時(shí)切斷、縫合DNA的兩條鏈。 需要能量輔助因子，可以作用于任何相交的兩對(duì)雙鏈DNA。2021/7/18 星期日 大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶I（屬于型酶） 概述：拓?fù)洚悩?gòu)酶 (E. coli)催化負(fù)超螺旋DNA的松弛。 拓?fù)洚悩?gòu)酶也參與DNA的打結(jié)和解結(jié)。 將兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈DNA環(huán)耦合為雙鏈DNA環(huán)。 完整的全酶是一分子量97 kDa的蛋白。2021/7/18 星期日 大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 的特點(diǎn)是： 僅切斷雙鏈DNA中的單鏈并催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接。 由于反應(yīng)的產(chǎn)物還是閉環(huán)DNA，因此，酶反應(yīng)機(jī)制是先切開(kāi)雙鏈DNA中的一條鏈，使切開(kāi)鏈的末端沿螺旋的方向轉(zhuǎn)動(dòng)，然后把切口封起來(lái)，達(dá)到松旋的目的。 不

19、需要能量輔助因子。如：ATP NAD (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸) ，最初從大腸桿菌中分離到一種叫蛋白，后來(lái)定名為大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 。2021/7/18 星期日Structure of the Topo I /contact with DNA2021/7/18 星期日 后來(lái)發(fā)現(xiàn)這種酶廣泛存在于各種生物中，不同學(xué)者曾給予各種命名：轉(zhuǎn)軸酶(swivelase)，松旋酶(untwisting enzyme)，DNA松弛酶(DNA relaxing enzyme)，切割封口酶(nickingclosing enzyme)。 Topo I 酶松弛超螺旋DNA時(shí)不需要ATP，它可以催化三種拓?fù)滢D(zhuǎn)換反應(yīng)(圖7-17)。2021/7/18 星期日拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (E. coli)催化負(fù)超螺旋DNA的松弛。拓?fù)洚悩?gòu)酶 I也參與DNA的打結(jié)和解結(jié)。 將兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈DNA環(huán)耦合為雙鏈DNA環(huán)。2021/7/18 星期日Topo IReactions僅切斷雙鏈DNA的一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接，不需要能量輔助因子如ATP和NAD等2021/7/18 星期日Topo I 作用機(jī)制23圖2-21 拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制2021/7/18 星期日 拓?fù)洚悩?gòu)酶 （屬于型酶） 概述：Topo廣泛存在于各種