基于高通量測序的菌群結(jié)構(gòu)譜研究-中醫(yī)藥方向課件

1、基于高通量測序的菌群譜研究中醫(yī)藥方向1主要內(nèi)容一、中醫(yī)藥微生態(tài)概述二、菌群譜的檢測方法三、生物信息分析內(nèi)容及意義四、案例解析234 建議“6+2”模式，即人體、環(huán)境、農(nóng)作物、家養(yǎng)動物腸道、工業(yè)以及海洋等6個領(lǐng)域的微生物組研究，加上微生物組研究方法及應(yīng)用技術(shù)平臺和微生物組數(shù)據(jù)儲存及功能挖掘兩個方向。 2016年年7月，50多位院士專家支持中科院微生物所的倡議，向國務(wù)院建議盡快啟動中國微生物組計劃，并得到積極回應(yīng)。5中國微生物組計劃腸道微生態(tài)成人胃腸道微生物重量超過1kg，約編碼330萬個特異基因，是人類基因組編碼基因數(shù)的150多倍；人類第二套基因組；人類是超級生物體。6人類腸道優(yōu)勢菌7資料來自H

2、akansson A等的文章人類腸道優(yōu)勢菌8資料來自Hakansson A等的文章人類腸道優(yōu)勢菌9資料來自Hakansson A等的文章腸道微生物的功能及相關(guān)疾病10中醫(yī)藥微生態(tài)研究歷史和進展早在公元4世紀(jì)，中醫(yī)師葛洪曾用糞便懸浮液治療食物中毒和嚴(yán)重腹瀉；公元16世紀(jì)，李時珍在本草綱目中有用糞便治病的記載；20世紀(jì)，我國微生態(tài)學(xué)創(chuàng)始人魏曦教授曾預(yù)言：“微生態(tài)學(xué)很可能成為打開中醫(yī)奧秘大門的一把金鑰匙”；2012年，上海交大趙立平教授在Science上發(fā)表題為我的微生物組和我的新聞報道，介紹了其如何把中醫(yī)藥學(xué)和菌群研究結(jié)合，并以此與肥胖斗爭的故事。這開啟了中醫(yī)藥與菌群關(guān)系研究的新紀(jì)元；2014年，

3、上海交大趙立平教授和中國中醫(yī)科學(xué)研究院仝小林教授等，在國際微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的頂級學(xué)術(shù)期刊The ISME Journal發(fā)表題為一種中草藥復(fù)方緩解2型糖尿病時的腸道菌群改變的研究成果；2015年，臺灣長庚大學(xué)學(xué)者在 Nature Communications發(fā)表題為靈芝通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成而降低小鼠肥胖的研究成果；2016年，臺灣長庚大學(xué)學(xué)者在 Nature子刊發(fā)表題為植物和蘑菇對抗肥胖和糖尿病的分子機制的綜述；2017年，香港浸會大學(xué)陳虎彪教授和江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員等的綜述Understanding the Molecular Mechanisms of the Interplay

4、Between Herbal Medicines and Gut Microbiota 在線發(fā)表在Wiley Online Library ；11人參皂苷Rb1腸道生物轉(zhuǎn)化過程中腸道菌群的關(guān)鍵作用資料來自Jun Xu等的文章12與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章13與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章14與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章15與草藥代謝相關(guān)的腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章16草藥通過靶向腸道菌群的潛在治療機制資料來自Jun Xu等的文章17草藥靶向治療腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章18草藥靶向治療腸道菌群資料來自J

5、un Xu等的文章19草藥靶向治療腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章20草藥靶向治療腸道菌群資料來自Jun Xu等的文章21草藥與哺乳動物腸道菌群的互作網(wǎng)絡(luò)資料來自Jun Xu等的文章22草藥與菌群的互作方式（1）腸道菌群將草藥化學(xué)成分生物轉(zhuǎn)化成代謝物質(zhì)，而這些物質(zhì)的生物利用度、生物活性及毒性與其前體不同；（2）草藥化學(xué)成分改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而改善其功能失調(diào)狀態(tài)及相關(guān)的病理條件；（3）腸道菌群介導(dǎo)草藥多種化學(xué)成分之間的相互作用；23中醫(yī)藥微生態(tài)研究的機遇和挑戰(zhàn)中醫(yī)藥微生態(tài)研究是我們難得的歷史性的機遇，建議投入更多的團隊和資源，而且需要頂層設(shè)計；挑戰(zhàn)（1）對于與腸道菌群相關(guān)的中醫(yī)藥化學(xué)成分，

6、需要更多的整體化學(xué)特征的研究：是否發(fā)酵的金銀花；（2）對于中醫(yī)藥靶標(biāo)腸道菌群，需要更多的微生物學(xué)的研究：麝香草酚；（3）需要靠譜的中醫(yī)藥腸道微生態(tài)研究模型：人源化老鼠；24機遇二、菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法25菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法 在細菌的進化過程中，rRNA基因的進化相對保守，被認(rèn)為是衡量生命進化歷史最理想的標(biāo)尺。 rRNA結(jié)構(gòu)既具保守性又具高變性。保守性反映生物物種的親緣關(guān)系，高變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)。25菌群結(jié)構(gòu)譜檢測方法羅氏454(2005)Hiseq2500(2014)Miseq(2011)19901960DGGET-RFLPClone library分子生

7、物學(xué)手段Pacbio(2009)培養(yǎng)基培養(yǎng)法高通量測序時代RT-PCR27PlatformMethodCharacteristic16S rRNACommentsSangerFluorescent, dideoxy terminator750 bpHigh accuracyFull length Costly, Low throughput, low coverage of 16S 454Pyrosequencing light emission600 bpHigh accuracyUp to 3 variable regions per readCost limits 16S coverag

8、e MiSeqFluorescent, stepwise sequencing500600 bpHigh accuracyUp to 3 variable regions per readVery high coverage and very low costPacBioFluorescent, SMRT DNA sequencing8 KbLow accuracy, allievated by CCSFull lengthRelatively low cost, Finer phylogenetic resolution菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法28基因組DNA提取設(shè)計并合成含接頭引物PCR擴增及

9、產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物定量及均一化Miseq高通量測序Miseq PE文庫制備菌群結(jié)構(gòu)譜的檢測方法高保真酶；最低循環(huán)數(shù)；精確定量29樣品采集：采樣方法、生物學(xué)重復(fù)、樣品保存測序前準(zhǔn)備：DNA抽提，PCR 平臺選擇：illumina Miseq/Hiseq；Pacbio區(qū)域選擇：細菌（V3-V4 ）；真菌（ITS）；古菌（V3-V5）測序量：30000 所需分析：標(biāo)準(zhǔn)分析+高級分析準(zhǔn)備30三、生物信息分析內(nèi)容及意義31生物信息分析內(nèi)容及意義樣本自身所含微生物的多樣性程度（ Alpha多樣性） 樣本間微生物多樣性比較（ Beta多樣性） 環(huán)境因子的影響（對樣本或者微生物）菌群代謝功能預(yù)測常規(guī)分析項目A

10、lpha多樣性分析1Rarefaction稀疏曲線2Specaccum物種累積曲線樣本 103豐度等級曲線4Alpha多樣性指數(shù)計算分類組成分析1各分類水平的微生物類群數(shù)統(tǒng)計2各分類水平的分類學(xué)組成分析3Metastats分析樣本（組） 24LEfSe分析分組 2群落組成交互式可視化1系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建2MEGAN可視化展示3GraPhlAn可視化展示4Krona交互式展示5熱圖分析樣本 3Beta多樣性分析1PCA分析樣本 32UniFrac-PCoA分析樣本 33UniFrac-MDS分析樣本 54UniFrac-UPGMA聚類分析樣本 35基于UniFrac距離的多組比較和箱線圖展示分組 2

11、分析項目備注高級分析項目菌群比較分析和關(guān)鍵物種篩選1RDA分析樣本 3：提供影響因素數(shù)值或分組 22物種網(wǎng)絡(luò)分析3菌群功能預(yù)測32錯誤率與質(zhì)量值換算的公式：Q= -10 log 10(E) Fastaq文件： HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946 1:N:0:ATTCCT ATNATGACTCAAGCGCTTCCTCAGTTTAATGAAGCTAACTTCAATGCTGAGATCGTT + HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946 1:N:0:ATTCCT ?A#AFFDFFHGFFHJJGIJJJIICH

12、IIIIJJGGHIIJJIIJIIJIHGIFEHIIJBFFHGJJIIHHHDFFFF信息分析內(nèi)容33OTU聚類 OTU（Operational Taxonomic Units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，屬，種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個樣品測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進行歸類操作（cluster）。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU?？筛鶕?jù)不同的相似度水平（通常為97% ），對所有序列進行OTU劃分。有效數(shù)據(jù)優(yōu)化數(shù)據(jù)信息分析內(nèi)容34分類學(xué)分析Qiime分類學(xué)分析（/s

13、cripts/assign_taxonomy.html）將序列與greengene等數(shù)據(jù)庫比對某OTU的種屬信息：同一個OTU中的不同序列的最近祖先的種屬信息OTU nameABOTUsizesuperkingdomphylumclassOTU1100150250BacteriaProteobacteriaBetaproteobacteriaOTU250100150BacteriaProteobacteriaGammaproteobacteria35稀釋性曲線36Rank Abundance 曲線37Specaccum物種累積曲線38單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖39單個樣品的群落結(jié)構(gòu)組分圖40OT

14、U分布VENN圖多樣品相似度樹狀圖41多個樣品的菌群結(jié)構(gòu)譜柱形圖42菌群結(jié)構(gòu)譜Heatmap圖43 PCA44ABC物種差異顯著性分析45LEfSE46LEfSE:47RDA/CCA48優(yōu)勢物種互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析49菌群代謝功能預(yù)測ABC50四、案例解析51案例分析52 實驗設(shè)計：檢測高脂飲食組，以及高脂飲食+靈芝水提物干預(yù)組小鼠腸道菌群譜變化，同時用正常飲食組，以及正常飲食+靈芝水提物干預(yù)組作為對照；采集并統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)；通過向高飲食組移植其他組分的糞便來驗證，并檢查糞便菌群譜變化；分離并驗證靈芝水提物活性物質(zhì)。 測序策略：采用羅氏454平臺，對16S rRNA V3-V5區(qū)測，引物為3

15、38F-907R。 結(jié)論： 靈芝水提物通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜而緩解小鼠肥胖。靈芝通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜緩解小鼠肥胖5354正常飲食組正常飲食+喂食8%靈芝水提物組高脂飲食組高脂飲食+喂食2%靈芝水提物組高脂飲食+喂食4%靈芝水提物組高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組實驗設(shè)計采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群譜變化情況發(fā)現(xiàn)靈芝水提物不僅可以降低高脂飲食小鼠體重、炎癥和胰島素抵抗，還可以降低腸道菌群的厚壁菌擬桿菌門比值和內(nèi)毒素濃度，同時維持腸屏障完整性。向高脂飲食組移植正常飲食組糞便向高脂飲食組移植正常飲食+喂食8%靈芝水提物組向高脂飲食組移植高脂飲食組糞便向高脂飲食組移植高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組采集

16、統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)檢測分析菌群譜變化情況發(fā)現(xiàn)將喂養(yǎng)靈芝水提物的小鼠糞便移植給高脂飲食小鼠，與直接喂食靈芝水提物效果類似。正常飲食組正常飲食+喂食8%靈芝水提物組正常飲食+喂食30萬Da以上靈芝粗提物組正常飲食+喂食10-30萬Da靈芝粗提物組正常飲食+喂食10萬Da以下靈芝粗提物組正常飲食+喂食某不明確芝粗提物組高脂飲食組高脂飲食+喂食8%靈芝水提物組高脂飲食+喂食30萬Da以上靈芝粗提物組高脂飲食+喂食10-30萬Da靈芝粗提物組高脂飲食+喂食10萬Da以下靈芝粗提物組高脂飲食+喂食某不明確靈芝粗提物組靈芝水提物通過調(diào)節(jié)腸道菌群譜而緩解小鼠肥胖單獨用大于30萬Da的靈芝粗提物喂養(yǎng)高脂飲食小鼠，與直接喂食靈芝水提物效果類似。采集統(tǒng)計多項生理生化指標(biāo)靈芝水提物對高脂飲食小鼠體重等指標(biāo)的影響55靈芝水提物對高脂飲食小鼠肝臟重量等指標(biāo)的影響56靈芝水提物對高脂飲食小鼠白介素等基因表達的影響57靈芝水提物對高脂飲食小鼠白介素等基因表達的影響58靈芝水提物對高脂飲食小鼠肌動蛋白等豐度的影響59靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響60靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影響61靈芝水提物對高脂飲食小鼠腸道菌群譜的影