《細(xì)胞生物》課件第3章細(xì)胞生物學(xué)的研究方法1

1、第三講 細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)習(xí)內(nèi)容顯微鏡技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)和融合技術(shù)細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù)細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)顯微鏡是觀察細(xì)胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（或紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。 一、 光學(xué)顯微鏡 （一）. 普通光學(xué)顯微鏡 普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)組成：（1）照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器（2）光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；（3）機(jī)械裝置：用于固定材料和方便觀察。影響顯微鏡成像清晰度的關(guān)鍵因素分辨率resolution：是指能

2、區(qū)分辨認(rèn)相近兩點(diǎn)最小間隔的能力光鏡分辨率(R)的計(jì)算公式： R0.61 / n .sin 0.610.5 m / 1.51 0.2 m ： 入射光波長； n：聚光鏡與物鏡間介質(zhì)的折射率； ：標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的半角普通光學(xué)顯微鏡的成像原理總放大倍數(shù)： 物鏡的放大倍數(shù) 目鏡的放大倍數(shù)最大放大倍數(shù)： 最大放大倍數(shù)=人眼分辨率（100um） 光鏡分辨率（0.2um）= 500um微米=10-6m；nm納米=10-9m；A埃=10-10m光鏡標(biāo)本的制備1、取材：將組織細(xì)胞從生物體內(nèi)取出來2、固定:使大分子交聯(lián)而保持在原有位置上，不至于以后染色處理過程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。 常用方法：甲醛、戊二醛

3、浸泡固定 可與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價(jià)鍵，將鄰近蛋白分子交聯(lián)。3、包埋：組織硬化； 液體石蠟、樹脂4、切片：110um5、染色蘇木精 核 酸伊 紅 細(xì)胞質(zhì)蘇 丹 脂 肪考馬斯亮藍(lán) 蛋白質(zhì)使細(xì)胞可見（二）、熒光顯微鏡熒光顯微鏡是對(duì)細(xì)胞內(nèi)某些生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)）在細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行研究的有力工具熒光分子激發(fā)光（exciting）發(fā)射光（emission）熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別：1. 照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上； 2. 光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡； 3. 有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。 吖啶

4、橙 染色顯示細(xì)胞中的DNA與RNAFITC標(biāo)記微管蛋白抗體顯示細(xì)胞中微管的分布熒光顯微鏡的成像特點(diǎn)：（三）、相差顯微鏡相差顯微鏡，由PZernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。倒置相差顯微鏡：特點(diǎn)是光源和聚光鏡在載物臺(tái)的上方，相差物鏡在載物臺(tái)的下方。用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞 倒置相差顯微鏡體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞1.相差顯微鏡的基本原理利用光的衍射和干涉效應(yīng)把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見（四）、暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡的聚光鏡中央有遮光片，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，

5、只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。 應(yīng)用：觀察物體的輪廓，分辨不清 內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造. 適合觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和真菌暗視野顯微鏡下蒼白密螺旋體 （四）、激光共聚焦掃描顯微境特點(diǎn)：1、用激光作掃描光源2、共聚焦：激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的 焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)3、逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描形成立體圖像共聚焦原理 物鏡和聚光鏡聚焦到一個(gè)點(diǎn)，保證了只有從標(biāo)本焦面發(fā)出的光線聚焦成像，提高分辨率，圖象更清晰 系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限

6、制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管顯微電影攝影技術(shù)應(yīng)用：觀察和記錄活細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)二、電子顯微鏡電子顯微鏡分透射電鏡與掃描電鏡兩類。電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場(chǎng)作透鏡。由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。電子顯微鏡的分辨率可達(dá)0.002nm，檢測(cè)生物樣品時(shí)分辨率達(dá)2nm。1933年 生產(chǎn)出第一臺(tái)透射電鏡在透射電子顯微鏡下觀察到的細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)稱為亞顯微

7、結(jié)構(gòu)（submicroscopic structure）或超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure）1942年 劍橋大學(xué)的馬倫首次制成世界第一臺(tái)掃描電鏡。掃描電鏡照片電子顯微鏡的成像原理電子顯微鏡標(biāo)本的制備方法超薄切片技術(shù)負(fù)染技術(shù)金屬投影技術(shù)冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)1）超薄切片技術(shù)取材:盡可能保持生活狀態(tài),避免損傷固定:為防止生物樣品在死亡后和脫水過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變,離體生物標(biāo)本迅速固定。常用戊二醛和四氧化鋨雙重固定戊二醛-蛋白質(zhì)；四氧化鋨-蛋白-脂類脫水:標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察,所以電鏡不能觀察含水的生物標(biāo)本。包埋:為使柔軟生物組織制成超薄切片,并使切片耐受高真空、電子轟擊,則在切片前

8、將標(biāo)本進(jìn)行包埋,常用環(huán)氧樹脂。切片:電子穿透力很弱,需將樣品制成50100nm厚的薄片。染色:生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成,它們散射電子能力弱,在電鏡下幾乎不存在明暗反差,為增大生物樣品反差,進(jìn)行重金屬染色。2） 負(fù)染電鏡技術(shù)（1）原理:將重金屬染料沉積在樣品周圍及凹陷處，從而使樣品本身成為淺色而突出的電鏡技術(shù).* 操作簡單、快速（不經(jīng)固定、包埋、切片）* 獲得高分辨率，提高標(biāo)本反差* 染色本身不改變生物標(biāo)本的活性，不變形將病毒、纖維、核糖體或分離的生物大分子樣品放于覆有親水性支持膜的載網(wǎng)上,滴加磷鎢酸,樣品干燥后重金屬鹽沉積于樣品周圍使樣品和背景形成顯著的明暗對(duì)比,這種染背景而不染樣品的

9、方法叫負(fù)染。運(yùn)用負(fù)染技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白纖維 3）重金屬投影 把鉑或鈀等重金屬接受高溫蒸發(fā),金屬顆粒以一定傾斜角度噴落在樣品表面形成不同厚度的薄膜,膜的厚度反映了樣品的表面輪廓。分子較小適合電子穿透時(shí),可直接進(jìn)行重金屬噴鍍后TEM下觀察。 4） 冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù) 冰凍斷裂冰凍蝕刻用于觀察膜性結(jié)構(gòu)的內(nèi)部構(gòu)造用于觀察細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造冰凍斷裂技術(shù)觀察植物細(xì)胞葉綠體膜表面鑲嵌蛋白冰凍蝕刻技術(shù)顯示細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)第二節(jié) 細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)一、制備細(xì)胞懸液 經(jīng)典方法： 胰蛋白酶 細(xì)胞間連接 EDTA（乙二胺四乙酸） 細(xì)胞外基質(zhì) 二、分離不同細(xì)胞的技術(shù)（一）離心沉降大小、形狀和密度綜合利用細(xì)胞本身的

10、物理和生物學(xué)特性對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行分離（二）免疫磁珠技術(shù)一種新的細(xì)胞分選技術(shù)。磁珠是人工合成的一種微球顆粒，內(nèi)含F(xiàn)e2O3或Fe3O4，可被磁場(chǎng)所吸引，外含功能基團(tuán)，可結(jié)合蛋白質(zhì)?；钚缘牡鞍踪|(zhì)包被在磁珠上，與細(xì)胞表面特異性抗原結(jié)合，生成的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下，與其他細(xì)胞分離。（三）、激光捕捉顯微切割技術(shù)應(yīng)用：用來從組織切片中精確地分離一個(gè)單一的細(xì)胞，特別適于收集分離腫瘤及周緣組織不同部位、不同區(qū)域的細(xì)胞（五）流式細(xì)胞儀也稱熒光激活細(xì)胞分選儀流式細(xì)胞儀是從多細(xì)胞懸液中分離目的細(xì)胞的精密儀器。應(yīng)用：細(xì)胞分選 ；細(xì)胞大小； DNA含量 ； 蛋白質(zhì)含量流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選的工作原理三

11、、細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture） 定義：細(xì)胞在體外的培養(yǎng)技術(shù) 條件：營養(yǎng)條件 生長環(huán)境（合適的溫度，酸堿度，濕 度及無菌） 分類：原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 應(yīng)用：研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞化學(xué)組成，功能 及機(jī)制。 1.原代培養(yǎng) primary culture 直接從體內(nèi)取出的組織細(xì)胞進(jìn)行的初次培養(yǎng)。2.傳代培養(yǎng) secondary culture 將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代以1：2以上的比例擴(kuò)大培養(yǎng)。正常組織細(xì)胞-原代培養(yǎng)-傳代培養(yǎng)（50代）-細(xì)胞死亡腫瘤組織細(xì)胞-原代培養(yǎng)-傳代培養(yǎng)（無限傳代）-細(xì)胞永生細(xì)胞系cell line：能在體外無限分裂和繁殖的同種細(xì)胞；來源于腫瘤組織或正常組織發(fā)生變異的細(xì)胞。常見的細(xì)胞系： NIH3T3細(xì)胞系：1963年取自小鼠胚胎細(xì)胞建立 Hela 細(xì)胞系：1952年取自人宮頸癌細(xì)胞建立細(xì)胞克隆clone：即分離出單個(gè)細(xì)胞使之增殖形成細(xì)胞群。細(xì)胞株cell strain: 由細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的具有相同性質(zhì)和特征的培養(yǎng)細(xì)胞群體。用途：分離出具有特殊基因缺陷的突變細(xì)胞系四、細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合：通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交(1)同核體：基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞(2)異核體：來自不同基因型的雜交細(xì)胞2.誘導(dǎo)細(xì)胞