sd大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離課件

1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究第一組：演講人：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模航⒁环N簡便有效的體外分離純化及培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法，研究BMSCs的生物學(xué)特性，為后續(xù)細(xì)胞移植和基因治療提供理想的種子細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：大鼠BMSCs體外培養(yǎng)生長狀況良好，可見BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式細(xì)胞儀檢測顯示BMSCs表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)CD34、CD45。經(jīng)體外誘導(dǎo)后具有多向分化潛能。試驗(yàn)方法：全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離大鼠BMSCs，體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代，在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，利用MTT法測定其生長曲線，流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原，成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化鑒

2、定其多向分化潛能。結(jié)論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法適合體外分離、擴(kuò)增和純化大鼠BMSCs，培養(yǎng)的大鼠BMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般生物學(xué)特性，為后續(xù)基因修飾BMSCs及其體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)奠定良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)材料：68 周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量80100 g，清潔級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司許可證號(hào)為SC-XK(滬)20192-005。胎牛血清(美國Hyclone 公司)，L-DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胰酶( 美國Gibco 公司)，CD34-FITC 抗體、CD45-FITC 抗體、CD90-FITC 抗體(英國AbD Serotec公司)，CD29-FITC抗體(美國Bioleg

3、end公司)前言：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作為一種組織特異性干細(xì)胞，具有高度增殖能力和多向分化潛能，其作為種子細(xì)胞在干細(xì)胞移植和基因治療等方面的研究倍受關(guān)注。2019年9月至2019年8月我們開展了體外分離純化及培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠BMSCs 的實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)行基因修飾BMSCs及其體內(nèi)移植的后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定良好的基礎(chǔ)。試驗(yàn)方法：1、鼠原代BMSCs的分離培養(yǎng)抽取10%水合氯醛0.2 ml腹腔注射麻醉大鼠后，用75%酒精浸泡大鼠雙下肢5min，無菌條件下分離出大鼠雙側(cè)的股骨和脛骨，將離體的骨干放入滅菌PBS緩沖液中沖洗

4、后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。剪去兩側(cè)干骺端，暴露骨髓腔，用無菌注射器抽取5ml含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔內(nèi)所有骨髓液沖凈。反復(fù)吹打骨髓沖洗液制成單細(xì)胞懸液，將此懸液接種于25cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3d后首次換液，以后每3d換液1次。倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)。2、大鼠BMSCs的傳代與純化通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法，每次換液棄除懸浮細(xì)胞。貼壁細(xì)胞主要是BMSCs，但可能混有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等造血細(xì)胞，710d原代細(xì)胞生長融合達(dá)80%90%，以0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化后按

5、1:2的比例傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞傳代后的細(xì)胞標(biāo)記為P1 (Passage 1)，反復(fù)傳代擴(kuò)增，并依次遞增標(biāo)記。每次傳代時(shí)用0.25% EDTA-胰蛋白酶(0.04 ml/cm2)消化12 min，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。嚴(yán)格控制胰酶的用量和消化時(shí)間，利用BMSCs較易脫落的特點(diǎn)，保證BMSCs在較短的時(shí)間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞則因貼壁性強(qiáng)仍貼附于培養(yǎng)瓶底，從而使BMSCs得到純化。大鼠BMSCs生長曲線測定：為了定量測定大鼠BMSCs的生長狀況，對來源于同一動(dòng)物的原代細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，分別選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制備成細(xì)胞懸液，

6、調(diào)整細(xì)胞密度為5104/ml。接種于96孔板，每孔接種200 l 細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)(每孔1104細(xì)胞)。次日起每天選擇6個(gè)培養(yǎng)孔各自加入MTT溶液(5 mg/ml)20l，37繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入150l二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照1孔。在酶標(biāo)儀上選擇570nm波長，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度(A)值，連續(xù)測7d，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。2、大鼠BMSCs P4細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定(1)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：待培養(yǎng)的BMSCs P3細(xì)胞生長至80%90%的融合，加入0.

7、25%EDTA-胰酶消化后，以2104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)1d后，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)組(實(shí)驗(yàn)組)加入2 ml成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)組(對照組)加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每3d換液1次。成骨誘導(dǎo)21d后，進(jìn)行茜素紅染色檢測，確定細(xì)胞外基質(zhì)的礦化。(2)茜素紅染色：兩組細(xì)胞分別用PBS沖洗2次，95%乙醇固定5 min，茜素紅染液染色5 min，蒸餾水沖洗3 次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和染色結(jié)果。(3)向成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化：待培養(yǎng)的BMSCs P3細(xì)胞生長至80%90%的融合，加入0.25% EDTA-胰酶消化后，以2104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)1d后，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

8、組(實(shí)驗(yàn)組)加入2ml成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)組(對照組)加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每3d換液1次。成脂肪誘導(dǎo)10d后進(jìn)行油紅O染色。(4)油紅O染色：兩組細(xì)胞分別用PBS沖洗3次，10%中性甲醛固定10min，油紅O染液浸染10min，60%異丙醇洗去多余染液，PBS沖洗3次，蘇木精復(fù)染35min，1%鹽酸分色及返藍(lán)后，PBS漂洗10min，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和染色結(jié)果。大鼠BMSCs的鑒定：1、流式細(xì)胞儀鑒定采用流式細(xì)胞儀對大鼠BMSCs進(jìn)行鑒定。待25cm2塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)P3細(xì)胞長至融合至90%左右，吸去培養(yǎng)基，以1PBS洗滌細(xì)胞一次，加入0.25%EDTA-胰酶室溫消化后加入

9、新鮮含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打數(shù)次制成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml離心管中1 000 r/min室溫離心5 min，棄上清，PBS洗滌兩遍并于相同條件下離心，棄上清，于待檢測的樣本中各加入100 lPBS，輕輕混勻，分別加入CD29-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗體各10l，37避光孵育30min后上機(jī)檢測。結(jié)果：1、大鼠原代BMSCs的分離培養(yǎng)經(jīng)全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離得到的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下呈圓形、透亮、漂浮、折光性強(qiáng)，單個(gè)分布。接種1d后，輕晃培養(yǎng)瓶可見大部分細(xì)胞隨培養(yǎng)液晃動(dòng)，僅少部分細(xì)胞貼壁，可見大部分細(xì)

10、胞呈圓形，少量呈不規(guī)則形，折光性強(qiáng)。3d后，貼壁細(xì)胞逐漸增加，少許伸出偽足呈梭形或三角形，并開始分裂增殖，可見一些小的細(xì)胞集落形成(圖1A)。45d后，貼壁細(xì)胞多呈梭形或多角形，形成不同大小、分散的細(xì)胞集落，集落逐漸擴(kuò)散并相互交連呈網(wǎng)狀(圖1B)；以后細(xì)胞增殖迅速，至接種后第7天，細(xì)胞形似短棒狀或纖維樣，細(xì)胞集落數(shù)量明顯增加，呈放射狀或漩渦狀排列，集落間漸融合成單層(圖1C)；傳代至P5以備實(shí)驗(yàn)用時(shí)細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化(圖1D圖1H)。2、大鼠BMSCs的傳代與純化傳代細(xì)胞呈圓形，很快開始貼壁，36h后基本完成貼壁。貼壁細(xì)胞初期伸出偽足呈梭形或多角形，少部分圓形細(xì)胞懸浮，折光性差，隨換液除去。

11、傳代12d后貼壁細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致，以梭形為主，胞體飽滿，增殖迅速，34d后即可長滿培養(yǎng)瓶底。多次傳代的BMSCs達(dá)融合生長時(shí)，細(xì)胞形態(tài)更趨一致，形成更均勻有序的放射狀或漩渦狀排列，說明BMSCs得到進(jìn)一步純化。3、大鼠BMSCs生長曲線測定P1、P3細(xì)胞生長曲線基本相同，經(jīng)過12d的潛伏適應(yīng)期，第3天開始大量增殖進(jìn)入對數(shù)生長期，P1和P3細(xì)胞維持3d左右對數(shù)生長期，此后進(jìn)入平臺(tái)期。P5細(xì)胞生長趨勢不同于P1、P3細(xì)胞，增殖速度減慢，較之前兩者其潛伏適應(yīng)期延長，而對數(shù)生長期縮短。見圖2。4、大鼠BMSCs的鑒定1、流式細(xì)胞儀鑒定大鼠BMSCs P3細(xì)胞表面標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測顯示

12、CD29、CD90陽性率均達(dá)97%以上，CD34、CD45陰性率達(dá)95%以上(圖3)。2、大鼠BMSCs P4細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定成骨誘導(dǎo)分化鑒定：實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后第21天茜素紅染色顯示大量橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成(圖4A)；對照組染色陰性。成脂誘導(dǎo)分化鑒定：實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后第10天油紅O染色可見胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的橙紅色脂滴(圖4B)；對照組染色陰性。討論：1968年Fridenstein等首次對BMSCs進(jìn)行了描述，提出了在骨髓中存在能貼附塑料培養(yǎng)皿，呈長梭形成纖維細(xì)胞樣，培養(yǎng)時(shí)呈克隆樣生長的細(xì)胞，將這類細(xì)胞稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。傳統(tǒng)認(rèn)為BMSCs的主要功能是參與構(gòu)成造血干細(xì)胞生存和分化的微環(huán)境。近

13、年研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有跨系統(tǒng)、跨胚層的多向分化潛能，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為中胚層及神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)組織細(xì)胞等。BMSCs具有來源充足、取材方便、免疫原性低、易于轉(zhuǎn)入外源基因進(jìn)行表達(dá)等諸多優(yōu)勢，不僅是組織工程的重要種子細(xì)胞，還是進(jìn)行基因治療的重要載體細(xì)胞，在器官移植和一些終末期疾病中亦有廣泛的應(yīng)用前景。但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量極少，約占骨髓有核細(xì)胞的十萬分之一。因此建立一種簡便有效的體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠BMSCs的方法以供研究及應(yīng)用顯得尤為重要。目前分離BMSCs的方法主要有全骨髓貼壁培養(yǎng)法、

14、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法。盡管利用流式細(xì)胞儀和免疫磁珠進(jìn)行分選可獲得高純度的BMSCs，但對細(xì)胞的活性影響較大，加之成本較高和技術(shù)難度大，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。 采用密度梯度離心法對細(xì)胞活性影響較小，卻破壞了BMSCs生長的骨髓微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。桂莉等采用Percoll淋巴細(xì)胞分離液獲得骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，并結(jié)合BMSCs的貼壁特性，獲得大鼠BMSCs，雖然細(xì)胞均一性更高，但增殖速度較慢。高建鵬等比較貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法培養(yǎng)大鼠BMSCs的效果，發(fā)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法都可以得到純度較高的MSCs，兩種培養(yǎng)方法的效果無明顯差異。全

15、骨髓貼壁培養(yǎng)法是根據(jù)BMSCs貼壁生長而造血細(xì)胞懸浮生長的特性對兩者進(jìn)行分離，由于保存了BMSCs生長所需的骨髓微環(huán)境，細(xì)胞經(jīng)換液傳代后得到純化且能保持旺盛的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出了純度較高的BMSCs。每次換液去除懸浮生長的造血細(xì)胞；傳代時(shí)利用BMSCs較淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞易脫落的特點(diǎn)，嚴(yán)格控制胰酶的用量和消化時(shí)間，使BMSCs在較短的時(shí)間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞則因貼壁性強(qiáng)仍貼附于培養(yǎng)瓶底，從而使BMSCs得到進(jìn)一步純化。隨著換液傳代次數(shù)的增加，BMSCs的純度也不斷增加。在體外分離培養(yǎng)BMSCs的過程中我們也體會(huì)到，造血系細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生

16、物學(xué)特性影響很小，而且全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作簡單快速，造成污染的環(huán)節(jié)和機(jī)會(huì)較少，不需離心，可以更好的保持細(xì)胞活性。同時(shí)將全骨髓貼壁培養(yǎng)法作為其他培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步富集BMSCs和進(jìn)行單克隆培養(yǎng)提供良好的細(xì)胞來源。BMSCs原代細(xì)胞對于細(xì)胞的接種密度依賴性很強(qiáng)，接種密度過稀，則細(xì)胞不能形成有效的相互作用而導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢甚至完全停止生長。因此采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法在原代接種時(shí)應(yīng)盡可能獲得足夠多的骨髓液沖洗以達(dá)到BMSCs的良好增殖，我們的體會(huì)是將大鼠雙側(cè)股骨和脛骨的骨髓液一同沖洗后接種入一個(gè)25cm2的塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)以保證接種細(xì)胞的密度，與陳凱等報(bào)道一致。而趙玉金等則報(bào)道采用全骨髓培養(yǎng)獲

17、得原代大鼠BMSCs，傳代后低密度接種結(jié)合機(jī)械擦除對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行純化，可以獲得高純度大鼠BMSCs，且具有更佳的生物學(xué)特性。周麗娜等通過對照研究發(fā)現(xiàn)采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)基內(nèi)添加表皮生長因子后能夠穩(wěn)定、簡便、快速獲取大量高純度大鼠BMSCs。本研究針對性地觀察了P1至P5BMSCs的生長特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P5BMSCs增殖速度明顯減慢，其細(xì)胞倍增時(shí)間也明顯延長，提示大鼠BMSCs似乎不能在體外無限擴(kuò)增。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs隨著傳代次數(shù)的增加，逐漸出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，傳到第10代以后，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)空泡或者折光性降低等改變，其體外增殖的能力也逐漸下降，表現(xiàn)在形態(tài)上從梭形或多角形逐漸變得寬大扁平，傳代時(shí)間延長。而李寧等通過觀察不同氧濃度微環(huán)境對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)適宜的高濃度氧微環(huán)境可以促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖。迄今為止，仍然沒有發(fā)現(xiàn)BMSCs公認(rèn)的獨(dú)特的抗原表型，一般采用聯(lián)合的抗原表型來鑒定BMSCs。BMSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如造血干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45等，而表達(dá)CD29、CD90等間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物。本研究分離到的細(xì)胞絕大部分表達(dá)CD29和CD90，不表達(dá)CD34和CD45，表明本實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞為純度較高的